CN113125712B - 一种丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒以应用。所述试剂盒包含表面键合有丙型肝炎病毒抗原的受体微球，所述受体微球能够与活性氧作用产生化学发光信号；所述受体微球还包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有第一丙型肝炎病毒抗原；每毫克所述受体微球中的糖含量不高于40微克。所述试剂盒对丙型肝炎病毒抗体的检测性能优异。

Description

一种丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于均相化学发光检测技术领域，具体涉及一种丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒及应用。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎，患者感染丙型肝炎病毒1-3个月后可出现抗体阳转，其病理改变以肝细胞坏死和淋巴细胞浸润为主，HCV引起的肝炎约80％发展为慢性肝炎，其中约25％发展为肝硬化、肝癌，对人类健康危害极大。目前，丙型肝炎血清学检验已列入临床患者输血前、手术前以及各种创伤性检查前等常规检测项目，对防止丙肝传播具有重要的意义。

目前HCV血清学检测方法有酶联免疫(ELISA)、胶体金法、化学发光(CLIA)、电化学发光(ECL)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等。ELISA作为半定量检测方法是现应用最广的检测方法，但其灵敏度、线性宽度范围均未达到较高水平，难以适应市场发展的需求。胶体金法与ELISA均有相同的缺点。而CLIA及ECL虽灵敏度高但均存在检测设备造价高昂，而相应的标记物研发门槛高，短时期内国内均会受制于人的缺点同样也限制了在国内的推广。时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)灵敏度虽然灵敏度能达到CLIA一致的水平，但是检测过程耗时较长。

光激化学发光的基础原理是一种均相免疫反应。它是基于两种微粒表面包被的抗原或抗体，在液相中形成免疫复合物而将两种微粒拉近。在激光的激发下，发生微粒之间的离子氧的转移，进而产生高能级的红光，通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。而当样本不含靶分子时，两种微粒间无法形成免疫复合物，两种微粒的间距超出离子氧传播范围，离子氧在液相中迅速淬灭，检测时则无高能级红光产生。因此具有操作简单、灵敏度高等优点。但是，现有光激化学发光检测试剂盒存在制备成本较高、非特性吸附明显等问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足提供了一种丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒，所述试剂盒对丙型肝炎病毒抗体的检测性能优异。

为此，本发明第一方面提供了一种丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒，其包含表面键合有丙型肝炎病毒抗原的受体微球，所述受体微球能够与活性氧作用产生化学发光信号；所述受体微球还包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有第一丙型肝炎病毒抗原；每毫克所述受体微球中的糖含量不高于40微克。

在本发明的一些实施方式中，所述载体表面没有包被多糖物质而直接与第一丙型肝炎病毒抗原结合。

在本发明的另一些实施方式中，所述载体表面带有羧基官能团，所述第一丙型肝炎病毒抗原通过所述羧基官能团与所述载体直接化学键合。

在本发明的一些实施方式中，所述载体表面羧基官能团的密度不低于10nmol/mg，优选不低于30nmol/mg。

在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒包括试剂1，所述试剂1中含有第一缓冲液以及悬浮在其中的所述受体微球；所述受体微球在试剂1中的浓度为10～150μg/ml；优选为20～100μg/ml；进一步优选为25～85μg/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述受体微球在试剂1中的粒径分布变异系数CV值不高于20％。

在本发明的另一些实施方式中，所述受体微球在试剂1中的粒径分布变异系数CV值不低于5％。

在本发明的一些实施方式中，所述第一缓冲溶液中含有多糖，所述多糖的浓度为0.01wt％～1wt％，优选为0.05wt％～0.5wt％。

在本发明的一些具体实施方式中，所述多糖为葡聚糖。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括试剂2，其包括第二丙型肝炎病毒抗原。

在本发明的一些具体实施方式中，所述第一丙型肝炎病毒抗原和第二丙型肝炎病毒抗原均为HCV融合抗原。

在本发明的一些实施方式中，所示试剂盒还包括抗HCV阴性对照、抗HCV阳性对照和抗HCV弱阳性对照，它们均包括含有小牛血清的缓冲溶液。

本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒在化学发光分析仪上的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述的试剂盒在化学发光分析仪上的应用包括如下步骤：

步骤S1，在盛液装置中分别加入待测样品、HCV阴性对照、抗HCV阳性对照和抗HCV弱阳性对照；

步骤S2，向盛液装置中加入试剂1和试剂2；

步骤S3，将盛液装置放入化学发光分析仪上进行反应和检测。

本发明的有益效果为：本发明所述试剂盒试剂1中受体微球表面的糖含量以及CV值，使得本发明所述试剂盒用于检测丙型肝炎病毒抗体时性能更为优异。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。

本发明所述用语“待测样本”是指可能含有被分析物的一种混合物。可以被用在本发明公开的方法中的典型待检样本包括体液，如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液等。

本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。

本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。所述抗原可以为融合抗原，且在任何需要的情况下，抗原可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。

本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。

本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。

本发明所述用语“特异性结合配对成员”是指这样一对分子，它们能够相互特异性结合，例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性结合配对成员对的例子是生物素-亲和素系统，其中“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而“亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。“亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。

在任何需要的情况下，本发明中所用的任何试剂，包括抗原、抗体、受体或供体，可以根据实际需要缀合生物素-亲和素特异性结合配对成员中的任一员。

本发明所述的“粒径分布变异系数C.V值”是指在纳米粒度仪的检测结果中，粒径在高斯分布中的变异系数。C.V是衡量标准物质中各颗粒粒径变异程度的一个统计量。标准物质粒径分布变异系数用于表示标准物质的颗粒粒径分散程度，常用标准差与标准物质平均粒径的比值的百分数表示，后者也称分散度。变异系数的计算公式为：变异系数C.V值＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％。标准偏差(Standard Deviation，SD)也被称为标准差，它描述各数据偏离平均数的距离(离均差)的平均数，它是离差平方和平均后的方根，用σ表示。标准差是方差的算术平方根。标准偏差能反映一个数据集的离散程度，标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。标准偏差σ为正态分布曲线上的拐点(0.607倍峰高处)至峰高与时间轴的垂线间的距离，即正态分布曲线上两拐点间距离的一半。半高峰宽(Wh/2)是指峰高一半处的峰宽，Wh/2＝2.355σ。通过正态分布曲线两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽或称基线宽度，W＝4σ或W＝1.699Wh/2。

本发明所述用语“供体微球”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体颗粒反应的诸如活性氧的活性中间体的敏化剂。供体颗粒可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明的一些实施方式中，所述供体颗粒通过功能基团被包被在基体上形成填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生活性氧，此时感光微球也可以称为供氧微球或感光微球。所述供体颗粒表面可以有亲水性的醛基葡聚糖，内部填充有光敏剂。所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与活性氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、和酞菁等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。所述供体颗粒表面还可以填充其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为活性氧和水。其他一些供体的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放活性氧，例如活性氧。

本发明所述用语“受体微球”是指能够与活性氧反应可以产生可检测信号的化合物。供体颗粒被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的活性氧，该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获，从而传递能量以激活所述受体颗粒。在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒通过功能基团填充于载体中形成填充有发光组合物的高分子微粒，所述发光组合物包含有能够与活性氧发生反应的化学发光化合物。在本发明的一些具体实施例中，所述化学发光化合物，其经历与活性氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。这些物质的典型例子包括但不限于：烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烷基吖啶满、芳基乙醚烯、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳基咪唑或光泽精。

Ⅱ.具体实施方案

下面将更详细地说明本发明。

本申请的发明人研究发现，受体微球和供体微球的体积小，在试剂盒中的浓度低，制备工艺非常复杂，其质量容易受多种因素的影响，因此需要根据多次的检测实验来获得最佳的控制技术特征，比如受体微球和供体微球的粒径分布变异系数C.V值，由于受体微球和供体微球的体积内部要融入发光组合物或敏化剂，外部要包被抗体抗原或链霉亲和素，为了保证微球的均一性，降低由微球大小不均带来的误差，本领域技术人员通常会考虑将粒径分布变异系数C.V值控制在较小的数值范围，甚至越低越好。然而，本专利的发明人发现，如果想实现微球的C.V值很小，对生产工艺的要求过高，极大地增加了试剂生产成本，不能形成产业化，使试剂无法在临床诊断中大量使用。尤其是包被了多糖之后，纳米微球的粒径分布变异系数C.V值的变化就更显著、更不稳定，难以满足医疗器械产品注册以及临床应用的试剂要求。但是，C.V值如果过大，光激化学发光检测的效果又不好。因此，本专利的发明人惊讶地发现，如果将受体微球和供体微球的粒径分布变异系数C.V值控制在一个合适范围内，能够获得最佳的光激化学发光检测结果，实现既有较合适的灵敏度，又有很宽的检测量程。

因此，本发明第一方面所涉及的丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒，其包含表面键合有丙型肝炎病毒抗原的受体微球，所述受体微球能够与活性氧作用产生化学发光信号；所述受体微球还包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有第一丙型肝炎病毒抗原；每毫克所述受体微球中的糖含量不高于40微克。本发明中所述受体微球的糖成分即可能来自于微球表面直接包被的多糖，也可能来自微球表面包被的其他物质的中的糖成分。

在本发明的一些实施方式中，所述载体表面没有包被多糖物质而直接与第一丙型肝炎病毒抗原结合。

在本发明的另一些实施方式中，所述载体表面带有羧基官能团，所述第一丙型肝炎病毒抗原通过所述羧基官能团与所述载体直接化学键合。

在本发明的一些实施方式中，所述载体表面羧基官能团的密度不低于10nmol/mg，优选不低于30nmol/mg。在本发明的一些具体实施方式中，所述载体表面羧基官能团的密度为10nmol/mg、20nmol/mg、30nmol/mg、40nmol/mg、50nmol/mg、60nmol/mg、80nmol/mg或100nmol/mg等。

在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒包括试剂1，所述试剂1中含有第一缓冲液以及悬浮在其中的所述受体微球；所述受体微球在试剂1中的浓度为10～150μg/ml；优选为20～100μg/ml；进一步优选为25～85μg/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述受体微球在试剂1中的粒径分布变异系数CV值不高于20％。

在本发明的另一些实施方式中，所述受体微球在试剂1中的粒径分布变异系数CV值不低于5％。

在本发明的一些实施方式中，所述第一缓冲溶液中含有多糖，所述多糖的浓度为0.01wt％～1wt％，优选为0.05wt％～0.5wt％。

在本发明的一些具体实施方式中，所述多糖为葡聚糖。

在本发明的一些实施方式中，所述受体微球的制备方法包括如下步骤：

步骤S1，将载体表面含有羧基官能团的受体微球与第一丙型肝炎病毒抗原在活化剂的参与下反应得到中间产物。

步骤S2，加入封闭剂，对中间产物进行封闭处理；

步骤S3，对步骤S2中封闭后的中间产物进行清洗，得到表面键合有第一丙型肝炎病毒抗原的受体微球。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所述载体表面的羧基官能团的密度不低于10nmol/mg，优选不低于30nmol/mg。在本发明的一些具体实施方式中，所述载体表面羧基官能团的密度为10nmol/mg、20nmol/mg、30nmol/mg、40nmol/mg、50nmol/mg、60nmol/mg、80nmol/mg或100nmol/mg等。

在本发明的另一些实施方式中，步骤S1中所述受体微球与第一丙型肝炎病毒抗原的质量比为10:(0.3～0.9)，优选为10:(0.6～0.8)。在本发明的一些具体实施方式中，所述受体微球与第一丙型肝炎病毒抗原的质量比为10:0.3、10:0.4、10:0.5、10:0.6、10:0.7、10:0.8或10:0.9等。

在本发明的一些实施方式中，所述发光组合物能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号，其包含化学发光化合物和金属螯合物。

在本发明的一些具体实施方式中，所述化学发光化合物选自烯烃化合物，优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物，更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。

在本发明的另一些具体实施方式中，所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII族金属，优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌，更优选为铕。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的材料选自天然的、合成或改性的天然存在的聚合物，优选选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯，最优选为聚苯乙烯。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括试剂2，其包括第二丙型肝炎病毒抗原。在本发明的一些具体实施方式中，所述第二丙型肝炎病毒抗原与特异性结合配对成员中的一员(例如)结合。

在本发明的一些具体实施方式中，所述第一丙型肝炎病毒抗原和第二丙型肝炎病毒抗原均为HCV融合抗原。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括抗HCV阴性对照、抗HCV阳性对照和抗HCV弱阳性对照，它们均包括含有小牛血清的缓冲溶液。

本发明第二方面涉及一种如本发明第一方面所述的试剂盒在化学发光分析仪上的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述的试剂盒在化学发光分析仪上的应用包括如下步骤：

步骤S1，在盛液装置中分别加入待测样品、HCV阴性对照、抗HCV阳性对照和抗HCV弱阳性对照；

步骤S2，向盛液装置中加入试剂1和试剂2；

步骤S3，将盛液装置放入化学发光分析仪上进行反应和检测。

上述应用中，所述试剂混合后均可以根据需要进行温育。具体地，所述温育的温度可以是35-45℃，时间可以是10-50min；优选地，所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃；温育的时间可以选自10min、20min、30min、35min、40min、45min或50min。

在本发明中，糖浓度或糖含量可以采用蒽酮法测定糖。利用蒽酮法测多糖是本领域技术人员所知悉的一种方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm～630nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。

Ⅲ.具体实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

实施例1.试剂1的制备

1.1载体的制备及表征过程

1.准备100ml的三口烧瓶，加入40mmol苯乙烯、5mmol甲基丙烯酸、10ml水，搅拌10min后通N2 30min；

2.称取0.12g过硫酸钾和0.2g氯化钠，溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤1的反应体系中，继续通N2 30min；

3.将反应体系升温至70℃，反应15小时；

4.将反应完成后的乳液冷却至室温，用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水过次离心沉降清洗，直至离心初的上清液的电导率接近去离子水，然后用水稀释，以乳液形式保存；

5.由纳米粒度仪测得此时乳胶微球粒径的Gaussian分布平均粒径为202.2nm，变异系数(C.V.)＝5.30％，由电导滴定法测得该乳胶微球羧基含量为30nmol/mg。

1.2发光组合物的填埋过程及表征

1.准备25ml的圆底烧瓶，加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU³⁺)，10ml 95％乙醇，磁力搅拌，水浴升温至70℃，获得配合物溶液；

2.准备100ml的三口烧瓶，加入10ml 95％乙醇、10ml水和10ml浓度为10％、步骤1.1中获得的羧基聚苯乙烯乳胶微球，磁力搅拌，水浴升温至70℃；

3.将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中，70℃反应2小时后停止搅拌，自然冷却；

4.将上述乳液离心1小时，30000G，离心后弃去上清液，得到内部填埋有发光组合物的羧基聚苯乙烯微球。

5.由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为204.9nm，变异系数(C.V.)＝8.04％。

1.3受体微球表面包被葡聚糖

1.取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝6磷酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解；

2.取100mg已制备好的填埋有发光组合物的羧基聚苯乙烯微球，加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2小时；

3.将10mg EDC·HCl溶于0.5mL 50mM/pH＝6磷酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜；

4.将反应后的混合液30000G离心45min后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使其终浓度为20mg/ml；

5.取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解；

6.将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2小时；

7.将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜；

8.将反应后的混合液30000G离心45min后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使其终浓度为20mg/ml，得到半成品微球溶液。

9.由纳米粒度仪测得此时半成品微球粒径的Gaussian分布平均粒径为241.6nm，变异系数(C.V.)＝10.90％。

1.4试剂1的制备

1.在2mL离心管中，取10mg步骤1.3中制备得到的半成品微球，用0.1M MES(pH6.0)的缓冲溶液，4℃离心10000rpm，15min清洗一次。

2.加入200uL 0.1M MES(pH 6.0)缓冲液超声分散均匀，按照包被比例10:0.3包被，加入150uL 2mg/mL的HCV融合抗原，接着加入150uL 10mg/mL EDAC(0.1M MES)溶液，反应浓度20mg/mL，室温搅拌4h。

3.加入封闭剂40％的BSA至终浓度5％，室温搅拌过夜。

4.用含有0.5％Tween-20的0.02M PBS缓冲溶液(pH 7.4)将微球离心清洗三次，得到表面键合有HCV融合抗原的受体微球。

5.最后用含有0.1wt％葡聚糖的0.02M PBS缓冲液(pH 7.4)定容至50mg/mL，得到试剂R1。

由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为255.7nm，变异系数(C.V.)＝12.5％。利用蒽酮法检测微球的糖含量，所述试剂1中的每毫克受体微球的糖含量为25.1微克。

实施例2：试剂2的制备

1)抗原前处理：将HCV融合抗原进行透析，更换为标记缓冲液，并测定蛋白浓度。

2)标记反应：将处理好的HCV融合抗原与活化生物素混合反应，进行标记。

3)透析：将标记后的生物素-HCV融合抗原进行透析，以去除未标记的游离生物素。

4)保存：将透析后的生物素-HCV融合抗原测定蛋白浓度，加入甘油后保存。

使用稀释液将生物素标记物按比例配制成试剂2，2～8℃保存。

实施例3：试剂盒的制备及其性能

本试剂盒由实施例1制备得到的试剂1、实施例2制备得到的试剂2、抗-HCV阴性对照、抗-HCV阳性对照、抗-HCV弱阳性对照、抗-HCV样品稀释液组成，辅以LiCA通用液(具体组成见表1)，在均相条件下采用双抗原夹心免疫光激化学发光法定性检测人血清中的丙型肝炎病毒抗体。

表1

本试剂盒可对丙型肝炎病毒抗体进行定性检测，检测时使用配套的抗-HCV弱阳性对照、抗-HCV阴性对照、抗-HCV阳性对照；检测时，抗-HCV弱阳性对照加2孔、抗-HCV阴性对照与抗-HCV阳性对照各加1孔进行实验。抗-HCV弱阳性对照、抗-HCV阴、阳对照及样本稀释液使用前需平衡至环境温度。

1.样本预稀释：将样品用抗-HCV样品稀释液进行11倍稀释，并充分混匀(如将10μL样品加入100μL样品稀释液中)；

2.在反应孔中分别加入25μL稀释样品及抗-HCV弱阳性对照、抗-HCV阴性对照、抗-HCV阳性对照；

3.向各反应孔依次加入25μL试剂1和25μL试剂2；

4.放入光激化学发光分析仪器，由仪器自动操作，操作步骤包括如下A～F几个步骤：

A.振动

B.37℃温育15分钟

C.自动加入LiCA通用液175μL

D.37℃温育10分钟

E.激光照射微孔并计算每孔发光光子量

F.由软件计算S/CO值(待测样本光信号值与抗-HCV弱阳性对照光信号的比值)，并判定阴阳性。

每次试验时均需加抗-HCV弱阳性对照、抗-HCV阴性对照、抗-HCV阳性对照，阴性对照的S/CO值应≤0.6，阳性对照的S/CO值应≥4，如结果异常，则本次试验结果不可信，需重复。

结果判定

S：待测样本光信号值；

CO：抗-HCV弱阳性对照光信号值(CUT OFF参考值)；

软件自动计算S/CO值，当S/CO<1时待测样品被判定为阴性，当S/CO≥1时待测样品被判定为阳性。

经博阳生物科技(上海)有限公司生产的LiCA 500自动光激化学发光检测仪仪器检测，本实施例的试剂盒的性能如下：

1、阴性参考品符合率：用国家参考品进行检定，30份HCV抗体阴性参考品，阴性反应不低于29份；

2、阳性参考品符合率：用国家参考品进行检定，30份HCV抗体阳性参考品，阳性反应不低于29份；

3、灵敏度：用国家参考品进行检定，4份中L1、L2为阳性，L3可阴可阳，L4为阴性；

4、精密性：用国家参考品进行检定，变异系数CV≤15％(n＝10)；

5、临床灵敏度、临床特异性：在对656份临床判定为阴性的血清样本的检测中，656例样本均被检测为阴性，临床特异性达到100％；对411份临床判定为阳性的血清样本的检测中，410例样本被检出阳性，临床灵敏度达到99.76％。

实施例4：受体微球糖含量对试剂盒性能的影响

实验步骤：

1、挑选10例肿瘤患者干扰样本，经过确证试剂验证为HCV无反应性的样本；以及20例经确证试剂验证的HCV阳性样本；

2、将不同糖含量的受体微球偶联HCV抗原后配制成30ug/ml的浓度与样本反应后测试信号值；

3、计算每个样本的S/CO值后，当S/CO大于1时为检测结果为阳性，反之为阴性；

4、当肿瘤干扰样本中出现阳性结果则为假阳结果，若HCV阳性样本出现阴性结果则为漏。检测结果如下表2所示：

表2

结论：由于受体微球糖含量为60ug时HCV项目S7-5样本测值由阳性变为阴性，出现漏检；而受体微球糖含量为40ug时HCV项目S7-5样本测值为阳性，没有出现漏检；因此微球糖含量小于40微克的时候检测效果较好。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (16)

1.一种丙型肝炎病毒抗体的均相化学发光检测试剂盒，其包含表面键合有丙型肝炎病毒抗原的受体微球，所述受体微球能够与活性氧作用产生化学发光信号，其特征在于：所述受体微球还包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有第一丙型肝炎病毒抗原；每毫克所述受体微球中的糖含量不高于40微克；

所述试剂盒包括试剂1，所述试剂1中含有第一缓冲液以及悬浮在其中的所述受体微球；所述受体微球在试剂1中的粒径分布变异系数CV值不高于20％；所述受体微球在试剂1中的粒径分布变异系数CV值不低于5％。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体表面没有包被多糖物质而直接与第一丙型肝炎病毒抗原结合。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述载体表面带有羧基官能团，所述第一丙型肝炎病毒抗原通过所述羧基官能团与所述载体直接化学键合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述载体表面羧基官能团的密度不低于10nmol/mg。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述载体表面羧基官能团的密度不低于30nmol/mg。

6.根据权利要求1-2、4-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述受体微球在试剂1中的浓度为10～150μg/mL。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述受体微球在试剂1中的浓度为20～100μg/mL。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述受体微球在试剂1中的浓度为25～85μg/mL。

9.根据权利要求1-2、4-5、7-8中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲溶液中含有多糖，所述多糖的浓度为0.01wt％～1wt％。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲溶液中含有多糖，所述多糖的浓度为0.05wt％～0.5wt％。

11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述多糖为葡聚糖。

12.根据权利要求1-2、4-5、7-8、10-11中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试剂2，其包括第二丙型肝炎病毒抗原。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其他特征在于，所述第一丙型肝炎病毒抗原和第二丙型肝炎病毒抗原均为HCV融合抗原。

14.根据权利要求1-2、4-5、7-8、10-11、13中任意一项所述的试剂盒，其他特征在于，所述试剂盒还包括抗HCV阴性对照、抗HCV阳性对照和抗HCV弱阳性对照，它们均包括含有小牛血清的缓冲溶液。

15.一种如权利要求1-14中任意一项所述的试剂盒在化学发光分析仪上的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其包括如下步骤：

步骤S1，在盛液装置中分别加入待测样品、HCV阴性对照、抗HCV阳性对照和抗HCV弱阳性对照；

步骤S2，向盛液装置中加入试剂1和试剂2；

步骤S3，将盛液装置放入化学发光分析仪上进行反应和检测。