CN102662058B - 一种用于羊泰勒虫病检测的间接elisa方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用TlSP检测羊泰勒虫病的间接ELISA方法，包括如下步骤：①包被；②封闭；③与一抗结合；④与二抗结合；⑤显色；⑥终止；⑦结果判定：样品的效价表示为：(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)，若效价小于0.20，为阴性；效价在0.20～0.30之间为可疑；效价大于0.30为阳性；本发明选取中国羊泰勒虫病的流行虫种-吕氏泰勒虫的TlSP基因，通过克隆表达，以纯化的TlSP蛋白作为诊断抗原，采用间接ELISA模式，研制出吕氏泰勒虫TlSP抗体检测试剂盒。该法操作简单，耗时短，成本低，高通量。
Description
技术领域
本发明涉及畜牧兽医领域，尤其涉及的是一种用于羊泰勒虫病检测的间接ELISA方法。
背景技术
羊泰勒虫病(ovine Theileriosis)是由媒介蜱传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称，属于一种蜱传性血液原虫病。在我国，已报道的羊泰勒虫病的病原有尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。本病危害严重，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病的山羊和绵羊发育变缓，产肉量和产毛量显著下降，从而给养羊业造成重大经济损失。
在临床上，泰勒虫病的诊断可根据临床症状如高热、贫血、体表淋巴结肿大和异嗜等，及流行病学资料如发病季节，本地区蜱的活动情况，动物在近期是否被蜱叮咬，发病地点，家畜是本地动物还是外地引入动物等做出初步的诊断。确诊泰勒虫病应查到病原，由于泰勒虫在进入畜体后主要以裂殖体和红细胞内虫体形式存在，病原检查只有查到一种阶段的虫体即可确诊，常用的方法有PCR、RT-PCR、RLB、LAMP等。由于虫体进入畜体之后，宿主即产生抗体，因此检测抗体的血清学诊断方法也用于泰勒虫病的诊断[1-9]
近年来，在牛的泰勒虫病研究中，国外以牛的环形泰勒虫的TaSP为目的蛋白建立了间接ELISA技术并相继进入田间试验【2-6】。在我国，简子健等以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原，通过优化ELISA反应条件，建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法[1]。这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法，为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。
在我国，2002年高玉龙以羊的泰勒虫虫体粗抗原建立了间接ELISA方法，但该法与绵羊巴贝斯虫有交叉反应，易造成假阳性结果和非特异反应[8]。2006年，Miranda以泰勒虫热休克蛋白Hsp70类似物建立了羊泰勒虫的间接ELISA方法[7]。2010年，刘志杰等以尤氏泰勒虫TuiP重组蛋白为基础，建立了间接ELISA方法，该法仅用于由尤氏泰勒虫引起的羊泰勒虫病的检测，而对吕氏泰勒虫引起的羊泰勒虫病检测不到抗体[9]。
参考文献：
1.简子健，马素贞，黄家雨，孙其吉吉，沈炯玉，苗中秋，吕伟.牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白间接ELISA检测方法的建立.新疆农业科学2011，48(3)：578-583.
2.Mohamed AM，Abdel-Rady A，Ahmed LS，El-Hosary A.Evaluat ion of indirectTaSP enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of tropical theileriosisin cattle(Bos indicus)and water buffaloes(Bubalus bubalis)in Egypt.VetParasitol.2011Nov 12.
3.Mohammad Al-Saeed AT，Omer LT，Abdo J，Habibi G，Sal ih DA，Seitzer.Epidemiological studies on tropical theileriosis(Theileria annulata infectionof cattle)in Kurdistan Region，Iraq.Parasitol Res.2010Jan；106(2)：403-7.Epub2009 Nov 13.
4.Seitzer U，Beyer D，Kullmann B，Bakheit MA，Ahmed JS.Evaluation ofTheileria annulata recombinant immunodominant proteins for the development ofELISA.Transbound Emerg Dis.2008Aug；55(5-6)：244-8.
5.Seitzer U，Bakheit MA，Salih DE，Ali A，Haller D，Yin H，Schnittger L，Ahmed J.From molecule to diagnostic tool：Theileria annulata surface proteinTaSP.Parasitol Res.2007 Sep；101 Suppl 2：S217-23.
6.Miranda J，Bakheit MA，Liu Z，Yin H，Mu Y，Guo S，Beyer D，Ol iva A，AhmedJS，Seitzer U.Validation of the indirect TaSP enzyme-linked immunosorbent assayfor diagnosis of Theileria annulata infection in cattle.Parasitol Res.2006May；98(6)：561-7.Epub 2006 Jan 20.
7.Miranda J，Bakheit MA，Liu Z，Yin H，Mu Y，Guo S，Beyer D，Ol iva A，AhmedJS，Seitzer U.Development of a recombinant indirect ELISA for the diagnosisof Theileria sp.(China)infection in small ruminants.Parasitol Res.2006May；98(6)：561-7.Epub 2006 Jan 20.
8.Gao YL，Yin H，Luo JX，Ouyang WQ，Bao HM，Guan GQ，Zhang QC，Lu WS，MaML.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis ofTheileria sp.infection in sheep.Parasitol Res.2002 May；88(13 Suppl 1)：S8-10.
9.Identification of Theileria uilenbergi immunodominant protein fordevelopment of an indirect ELISA for diagnosis of ovine theileriosis.Liu Z，Wang Z，Yin H，Luo J，Zhang B，Kullmann B，Abdo J，Salih D，Ahmed J，SeitzerU.Int J Parasitol.2010Apr；40(5)：591-8.Epub 2009Nov 10.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种用于羊泰勒虫病检测的间接ELISA方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用TlSP检测羊泰勒虫病的间接ELISA方法，其包括如下步骤：
①包被：以包被缓冲液将表达产物TlSP蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔50μL，4℃过夜；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；
②封闭：每孔加入50μL封闭液，37℃封闭40分钟；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；
③与一抗结合：待检血清样品及任选的阳性和阴性对照用血清稀释液(含5％脱脂奶粉，1％大肠杆菌萃取物的封闭液)1∶100稀释，每孔加入50μL，37℃结合1小时；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；
④与二抗结合：兔抗绵羊IgG/HRP或兔抗山羊IgG/HRP用PBST 1∶1500稀释，每孔加入50μL，37℃结合1小时；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；
⑤显色：每孔加入50μL H2O2/OPD，37℃避光15分钟；
⑥终止：每孔加入1.25mol/L H2SO4，测定OD492；
⑦结果判定：样品的效价表示为：
(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)，
若效价小于0.20，为阴性；效价在0.20～0.30之间为可疑；效价大于0.30为阳性。
所述的间接ELISA方法，所述TlSP蛋白由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，扩增所述核苷酸序列的特异性引物：
上游引物(SBxp-F)：5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3；
下游引物(SBxp-R)：5-CCAAGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3。
所述的间接ELISA方法用于吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的动物的用途。
所述间接ELISA方法中TlSP蛋白的制备方法，(1)采用高效利用稀有密码子的BL21宿主菌，并在诱导表达时在培养基中加入1％的葡萄糖，大大提高了TlSP融合蛋白的表达水平，表达量达到宿主细菌总蛋白的28.6％；(2)在目的蛋白的N-端融合表达6组氨酸标签便于纯化得到高纯度的TlSP融合蛋白，这种高纯度和高活性的TlSP蛋白为随后的方法建立奠定了基础。
本发明利用免疫学筛选方法，从吕氏泰勒虫cDNA表达文库获得TlSP基因(TaSP类似物)，经验证，该基因存在于吕氏泰勒虫的子孢子、裂殖体和裂殖子三阶段。并证实该基因也存在于羊的尤氏泰勒虫以及牛的环形泰勒虫基因组中。经动物免疫、WesternBlotting和ELISA实验证实，TlSP重组蛋白均具有较好的免疫原性和反应原性。用TlSP重组蛋白建立的间接ELISA方法，完全适用于我国羊泰勒虫病的血清学检测和流行病学调查。
本发明选取中国羊泰勒虫病的流行虫种-吕氏泰勒虫的TlSP基因，通过克隆表达，以纯化的TlSP蛋白作为诊断抗原，采用间接ELISA模式，研制出吕氏泰勒虫TlSP抗体检测试剂盒。该法操作简单，耗时短，成本低，高通量。
本发明人针对我国畜牧业领域中羊泰勒虫病的发病状况确定了判定标准，从而能够有效检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的绵羊和山羊。此外，采用本发明所述方法还可用于由牛环形泰勒虫引起的牛泰勒虫病的抗体检测。
附图说明
图1为吕氏泰勒虫TlSP的PCR特异产物；M：核酸marker2000；泳道1：以吕氏泰勒虫裂殖子表达文库为模板的特异产物；泳道1：以吕氏泰勒虫裂殖子基因组为模板的特异产物；泳道3：以吕氏泰勒虫裂殖体基因组为模板的特异产物；泳道4：以吕氏泰勒虫子孢子基因组为模板的特异产物；泳道4：空白对照。
图2为TlSP诱导表达产物的SDS-PAGE；泳道1：蛋白marker；泳道2：1h表达物；泳道3：2h表达物；泳道4：3h表达物；泳道5：4h表达物；泳道6：5h表达物；泳道7：6h表达物；泳道8：空载体菌液。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1 TlSP基因的克隆
1、PCR扩增：以吕氏泰勒虫cDNA表达文库为模板，
上游引物(SBxp-F)：5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3，
下游引物(SBxp-R)：5-CCAAGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3，
进行PCR扩增。反应体系为100μL，即：10×缓冲液10μL，dNTP(2.5mmol/L)8μL，MgCl2(25mmol/L)6μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板(cDNA)2μL，灭菌水71.5μL，Taq酶(TaKaRa，DR001B，10U/μL)0.5μL。
离心混匀后置PCR自动扩增仪中，94℃预变性4min，进行如下循环：94℃1min，50℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。PCR产物上样5～8μL，在琼脂糖凝胶中进行电泳(80～100V)，扩增产物片段大小若与预期的目的片段大小一致(图1)，即可用于后续试验。
2、目的DNA片段的纯化回收
先将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳(80V)40min左右。在长波紫外光下观察电泳情况，当目的DNA片段与杂带完全分开后，用清洁手术刀(经火焰消毒)切下含有目的片段的凝胶块(小于300μL)置于1.5mL离心管中。
后续步骤按Roche公司Agarose Gel DNA Extraction Kit说明书进行。具体步骤为：
①用吸头将凝胶块轻轻捣碎，每100mg琼脂糖凝胶中加入300μL溶胶液。
②加入10μL玻璃奶，颠倒混匀，于56～60℃水浴10min，并间隔2～3min混匀一次。
③12000r/min离心30s，吸弃上清，用500μL核酸结合液，在混匀器上重悬DNA。
④12000r/min离心30s，吸弃上清；用500μL洗涤液洗涤沉淀丸，涡旋混匀，12000r/min离心30s，吸弃上清；重复一次。
⑤尽量吸尽液体，37℃干燥40min或自然干燥1～2h。
⑥加20～50μL TE缓冲液，混匀，56～60℃水浴10min，每2～3min涡旋一次，12000r/min离心1min，回收上清备用。
3、目的DNA片段与pGEM-T Easy载体(Promega，A3600)的连接
由于所使用的Taq酶在聚合过程的最后给产物末端加上一个腺嘌呤(A)，而pGEM-T Easy载体的两个末端各有一个突出的胸腺嘧啶(T)，因此既可防止质粒的自身环化，又可形成粘端连接，使得连接效率大为提高。连接体系为10μL，即：2×Buffer 5μL，T4DNA Ligase 1μL，pGEM-T Easy载体(Promega，A3600)(10U/μL)1μL，目的DNA 3μL，4℃连接过夜或16℃温育4h以上。
4、感受态细胞的转化
①每管感受态细胞(Takara)中加入5μL或10μL连接反应物，用枪头轻轻混匀，冰浴45min。
②将离心管小心的转移至42℃水浴中热激90s。
③迅速置于冰浴中冷却3min，然后每管加入预热至37℃的LB培养基800μL，37℃220r/min震荡培养1h使细胞复苏。
④4℃4000r/min离心2min，弃部分上清，留200μL左右重悬沉淀。
⑤在细胞悬液中加入16μL X-gal(50mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)，用枪头轻轻混匀，涂布于预至37℃的LB琼脂平板(含氨苄青霉素60μg/mL)上，37℃过夜培养。
5、挑斑
在超净工作台里用灭菌牙签从平板上挑取单个白色菌落，接种于含3mL LB培养基(含60μg/mL氨苄青霉素)的链瓶中，同时挑一个蓝斑作阴性对照，37℃ 220r/min摇振培养12～16min。
6、质粒的提取与鉴定
利用Takara质粒提取试剂盒，操作步骤如下：
①用无菌牙签从LB平板挑取白色单菌落，接种于3mL LB培养液(氨苄青霉素100μg/mL)中，37℃振摇(230r/min)12～16h。
②无菌移取1.5mL菌液置离心管中，12000r/min离心3min，弃上清，倒置控干残留液体。
③每管加入120μL预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0))，用涡旋器振荡悬浮。
④加入240μL新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH稀释)；1％SDS(用10％SDS稀释))，温和倒置离心管3～4次混匀，然后冰浴放置5min。
⑤加入180μL预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60mL；冰乙酸11.5mL；无离子水28.5mL)，颠倒混和几次，冰浴放置5min。
⑥12000r/min离心8min，将上清转移至另一离心管中，加入500μL Tris饱和酚振荡抽提。
⑦12000r/min离心1min，转移上层水相至一新管中，用Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)振荡抽提。
⑧12000r/min离心1min，上层水相加入2倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀0.5h以上，12000r/min，离心10min。
⑨沉淀用冰冷的70％乙醇洗涤，离心除去残余乙醇，置室温自然干燥。
⑩用30μL含RNA酶(20μg/mL)的TE(pH 8.0)溶解，室温放置0.5h，电泳观察。
阳性克隆的鉴定：①电泳鉴定：将所提取的质粒进行电泳，与阴性质粒(蓝斑)进行比较，选出阳性质粒。
②酶切鉴定：用EcoR I和Hind III进行双酶切。反应体系为20μL体系，即：重组质粒15μL，10×Buffer 2μL，EcoR I 1μL，Hind III1μL，无菌水1μL，置37℃温箱中，2h后取出，将酶切产物、分子量Marker进行电泳比较。
③PCR鉴定：以酶切和电泳为阳性的质粒10倍稀释后取1μL为模板，加入2μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTP(2.5mmol/L)混合物，0.5μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，0.2μL上游引物(201)、0.2μL下游引物(203)，1.2μL MgCl2(25mmol/L)，补水至20μL，进行PCR鉴定，用100bp DNA ladder Marker作为参照。
④重组质粒的测序确证：将PCR扩增鉴定、酶切鉴定均为阳性的克隆，过夜培养扩增，送大连宝生物工程公司测序(核苷酸序列如SEQ ID NO：1)。鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-TlSP。
所得编码TlSP片段的核苷酸序列如下：
GAATTCGATCGACAACGGAATCCTATCGATTTTGATCCCAATGATGATCAACAGCCTTTGGACCCTAATCAACTCATAGATCAAGAAGAACCTTCTGAACAACCTACTCAACAAGAACCAATAGAACCACAACAACCTACAGAACTAGAAACTACAGAACCCGAAGAGTTGGAACCAGAAACTGTTACAGTAGAAGTTCCAGAACCCGTTACATCAGAAGAACCTAAAGAATCGGATCAAACTGAAGAACAAAAACACGAAGAACCTGAAGCATTTCCAGCTCCTGAACCAGTTGATGAACCCGCAGTTCATGCTACTGAATCTACTCCTACTAAGGCAAGTTCCAGTGGTGATGGAGCAGCTGTTTGTCATGGAAAACATCATGATGATGACTCTGACGGGAAGCTT
实施例2 重组表达载体的构建
目的片段与pET30a-TlSP载体的酶切回收：
①已测序的pGEM-TlSP质粒和pET30a质粒分别用EcoR I和Hind III酶切。
酶切体系(50μL)分别如下，目的基因管为10×buffer D 5μL，BSA 1μL，Hind III2.5μL，EcoR I 2.5μL，H2O 24μL，pGEM-TlSP质粒15μL。载体管为10×buffer D 5μL，BSA 1μL，EcoR I 2.5μL，Hind III 2.5μL，H2O 24μL，pET30a载体15μL。
②酶切混合物离心混匀后，置37℃水浴消化3h。③取3uL酶切混合物电泳观察，酶切完全后，65℃水浴保温15min灭活内切酶，分别用0.8％琼脂糖凝胶电泳重组质粒和载体酶切产物，切下所需的目的条带，用Agarose Gel DNA ExtractionKit回收纯化目的片段和载体片段(方法同前)。电泳观察回收情况。
目的片段与表达载体的连接：10×ligase buffer 2μL，目的片段12μL，pET30a载体4μL，T4DNA ligase 2μL，混匀后置16℃连接5h。
转化：取连接产物10μL无菌操作加入200μL BL21感受态细胞(感受态细胞的制备同前)中进行转化(除涂板时不加IPTG、X-gal外，其它操作步骤均同前)。
重组表达质粒的提取与鉴定：Takara质粒提取试剂盒，进行鉴定。
①重组质粒的电泳鉴定：提取的质粒每个上样5uL进行电泳，同时加空白载体对照，选出泳动速度较阴性慢的质粒进行进一步鉴定。
②重组质粒酶切鉴定：将电泳选出的质粒取8μL，加Buffer H 2μL，BSA 0.5μL，H2O 6.5μL，Hind III 1.5μL，EcoR I 1.5μL，37℃水浴消化2h，电泳观察结果。对鉴定为阳性的质粒进行扩增鉴定。
③重组质粒PCR鉴定：重组质粒DNA 1∶10稀释后，用引物：
上游引物(SBxp-F)：5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3，
下游引物(SBxp-R)：5-CCAAGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3，
进行扩增，扩增程序为，94℃预变性3min；进行如下循环：94℃1min，50℃1min，72℃1min 20s；30个循环后72℃延伸8min。
经上述鉴定均为阳性的重组表达质粒命名为pET30a-TlSP。
实施例3 重组表达质粒的诱导表达
将经过序列分析的重组菌30μL接种至3mL含1％葡萄糖的2×YT培养液(含50μg/mL羧苄青霉素)中，37℃振摇过夜。取过夜培养物200μL接种于20mL含1％葡萄糖的2×YT培养液(含50μg/mL羧苄青霉素)中，剧烈振摇至OD600为0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃诱导表达，在第4小时收集菌液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting分析，检测表达产物。同时用未诱导的菌液作为阴性对照。
实施例4 表达产物的检测
SDS-PAGE电泳：
①洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0％琼脂糖封边。配制12％的分离胶20mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖1mL双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置控干液体，加入6mL 5％的积层胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。
②小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液：25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH 8.0)；0.1％SDS)，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。
③收集的菌液12000r/min离心3min，用100μL pH 7.4的PBS悬浮，加入等体积的2×SDS上样buffer(100mmol/L Tris.c1(pH8.0)；200mmol/L巯基乙醇；4％SDS；0.2％溴酚蓝；20％甘油)，混匀，水浴煮沸5min，用微量进样器上样20μL，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。
④染色取下凝胶用蒸馏水冲洗，用凝胶5倍体积的考马斯亮兰染色液(45mL甲醇∶45mL水∶10mL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮兰)浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上室温染色3h。
⑤脱色用30％乙醇和10％冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3～4次。待兰色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。
⑥结果观察，见图2，电泳显示重组表达质粒产生了约25kDa的蛋白带，与预期的融合蛋白分子量大小相符，经薄层扫描分析，目的蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的28.6％。
Western印迹分析：
①溶液的配制，洗液溶液：150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCL pH 7.5。转移缓冲液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS，20％甲醇。氨基黑染色液(100mL)：0.5g氨基黑10B溶于40mL水、50mL甲醇、10mL冰乙酸中。封闭液：10mL PBST+0.3g BSA。底物溶液(30mL)：30mL PBST中溶解15mg的DAB(二氨基联苯胺)，9mg CoCl2·6H2O加入10μl 30％ H2O2混匀后立即使用。
②转印剪8块滤纸与1块硝酸纤维素膜(NC膜)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡3min，在正极板上按四层滤纸、NC膜、凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，160mA转移2.5h。
③封闭转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染5min，取出后漂洗脱色，直至背景兰色脱尽。其余NC膜用PBST冲洗，加入10mL封闭液，室温轻轻振摇1～2h。
④与抗体结合封闭结束后，用PBST冲冼NC膜4～5次，加入PBST 1∶500倍稀释的羊的吕氏泰勒虫阳性血清10mL，37℃结合1.5h，用PBST冲洗4～5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1∶2000倍稀释的兔抗绵羊或山羊IgG(二抗)，室温下轻摇孵育1h，取出用PBST冲洗3～4次，每次10min。
⑤底物显色将NC膜转移到10mL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液中，室温保存。
⑥结果表达产物经SDS-PAGE电泳的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上进行免疫学反应，结果诱导菌出现一条特异性反应带，未诱导菌未见任何反应带。证明表达产物能与吕氏泰勒虫阳性血清发生反应，且具有很高的特异性。
实施例5 TlSP蛋白的大量制备
每4mL上述上清中加入1mL 50％NTA His.Bind slurry，室温摇培1h，装入空层析柱中，用4mL洗液(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH6.3)洗两次，洗脱非特异性结合在柱子上的蛋白质。接下来用1mL不同pH值的洗脱液(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris，pH5.9和pH4.5)各洗4次，洗脱吸附在柱子上的TlSP蛋白，电泳观察，收集只含有TlSP蛋白的洗脱液。
实施例6 TlSP间接ELISA建立
用方阵试验测定纯化后抗原的最佳工作浓度(10μg/mL)。然后进行如下操作：
①包被：以包被缓冲液(包被缓冲液：0.05mol/L Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)将表达产物TlSP蛋白稀释至工作浓度10μg/mL，加入96孔酶标板，每孔50μL，4℃过夜。以洗涤缓冲液PBST洗涤2次，拍干。
②封闭：每孔加入50μL封闭液(含5％蔗糖，10％马血清的PBST)，37℃封闭40min。洗涤3次，拍干。
③与一抗结合：待检血清样品及阳性和阴性对照用血清稀释液(含5％脱脂奶粉，1％大肠杆菌萃取物的封闭液)1∶100(体积比，下同)稀释，每孔加入50μL，每一个样加2孔，37℃结合1h。洗涤5次，拍干。
④与二抗结合：兔抗绵羊或山羊IgG/HRP用PBST 1∶1500稀释，每孔加入50μL，37℃结合1h。洗涤5次，拍干。
⑤显色：每孔加入50μL H2O2/OPD，37℃避光15min。
⑥终止：每孔加入1.25mol/L H2SO4，测定OD492。
⑦结果判定：待检血清及阳性和阴性对照各有两个结果，均需要计算平均值。
样品的效价则为：(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)，
若效价小于0.20，为阴性；效价在0.20～0.30之间为可疑；效价大于0.30为阳性。如果可疑样品第二次检测仍为可疑，需对同一动物另采样品检测。
实施例7 TlSP间接ELISA方法用于检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染动物的实验结果。
用此方法检测了3000多份血清，包括实验感染动物血清，健康动物血清和注苗动物血清。结果100％感染动物血清为阳性，而86％野外样品为阳性，健康动物血清为阴性。该结果优于沿用多年的泰勒虫虫体粗提物建立的间接ELISA，这说明本发明的检测方法具有很高的敏感性和特异性。
以上试验结果说明，该TlSP间接ELISA能够检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的动物，我们已经成功的建立了检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的动物的TlSP间接ELISA方法。
实施例8
TlSP间接ELISA试剂盒
①包被：以包被缓冲液(0.05mol/L Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)将表达产物TlSP蛋白稀释至工作浓度(10μg/mL)，加入96孔酶标板，每孔50μL，4℃过夜。以洗涤缓冲液PBST洗涤2次，拍干。
②封闭：每孔加入50μL封闭液(含5％蔗糖，10％马血清的PBST)，37℃封闭40min。洗涤3次，拍干。真空抽干后，4℃保存。
③与一抗结合：参照实例6。
④与二抗结合：参照实例6。
⑤显色：参照实例6。
⑥终止：参照实例6。
⑦结果判定：参照实例6。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.用于通过间接ELISA法检测羊泰勒虫病的TlSP蛋白的制备方法，其特征在于，TlSP蛋白由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，PCR扩增TlSP蛋白的特异性引物为：
上游引物：5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3；
下游引物：5-CCAAGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3。
2.根据权利要求1所述的用于通过间接ELISA法检测羊泰勒虫病的TlSP蛋白的制备方法，其特征在于：
(1)采用高效利用稀有密码子的BL21宿主菌，并在诱导表达时在培养基中加入1％的葡萄糖，大大提高了TlSP融合蛋白的表达水平，表达量达到宿主细菌总蛋白的28.6％；
(2)在目的蛋白的N-端融合表达6组氨酸标签便于纯化得到高纯度的TlSP融合蛋白，这种高纯度和高活性的TlSP蛋白为随后的方法建立奠定了基础。
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