CN101974639B - 鉴别诊断牛环形泰勒虫的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速鉴别诊断被检牛只是否感染环形泰勒虫的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的试剂盒内由至少两对牛环形泰勒虫特异引物构成，其使用方法是对提取血样的基因组DNA与DNA聚合酶、反应缓冲液、灭菌超纯水以及环形泰勒虫特异引物混合物按比例混合均匀，进行LAMP扩增，经扩增后灭活，在扩增产物中加入荧光染料，根据LAMP反应管中所发生颜色的变化判断被检牛只是否感染有牛环形泰勒虫。

Description

鉴别诊断牛环形泰勒虫的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种动物寄生虫的检测鉴别技术，确切讲本发明提供一种快速鉴别诊断被检牛只是否感染环形泰勒虫的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。

背景技术

环形泰勒虫(Theileria annulata)是顶复门(Apicomplexa)、梨形虫纲(Piroplasmea)中的泰勒科(Theileriidae)、泰勒虫属的一个重要成员，经节肢动物-蜱传播后寄生于牛的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，引起以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿胀为特征的一类血液原虫疾病，即泰勒虫病。据估计，世界每年约有2.5×10⁸头牛受到该病的威胁(Williamson S，Tait A，Brown D，et al.Theileria annulata sporoziote surface Antigen express in Escherichia coli elicitsneuralizing antibody[J].Proc.Natl.Acad.Sci.，1989，86(12)：4639-4643。国际兽疫局(Office International Des Epizooties，OIE)将其列为B类疫病，我国将其列为二类疫病。该病最早发生在北非和欧洲南部，接着迅速蔓延到中东和印度，由俄罗斯南部进入中国(Aktas M，Altay K，Dumanli N.A molecular survey ofbovine Theileria parasites among apparently healthy cattle and with a note on thedistribution of ticks in eastern Turkey[J].Vet Parasitol，2006，138：179-185)。在我国，内蒙古畜牧兽医研究所和马素芳等于1960年同时在内蒙古首次发现环形泰勒虫病以来，吉林、内蒙古、河北、天津、山西、陕西、宁夏、甘肃、新疆、四川、重庆、湖北、河南、山东、浙江、湖南、福建、广州和云南等19个省区也相继报道了该病，其主要传播媒介是璃眼蜱属的蜱：包括小亚璃眼蜱、残缘璃眼蜱和盾糙璃眼蜱等(沈杰等，中国家畜家禽寄生虫名录[M]：北京：中国农业出版社，2004：24-25)。本病的季节流行性很强，多呈急性经过，发病率和死亡率均很高，尤其对外来牛、纯种牛以及杂交牛的危害更大，是制约发展中国家养牛业生产和发展的主要疾病之一。

牛环形泰勒虫病的诊断现在主要有下列几种手段：(1)血涂片检测、淋巴结穿刺、体外培养、临床症状和动物接种。(2)血清学方法，如：补体结合试验(CFT)、间接荧光抗体试验(IFAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，但这些方法很难排除不同种之间的交叉反应，而且常会出现假阳性或漏检，参见：ManujaA et al.，Comparison of cellular schizont，soluble schizont and soluble piroplasmantigens in ELISA for detecting antibodies against Theileria annulata.VeterinaryParasitology，2000，87(2-3)：93-101。(3)分子检测技术，如DNA探针、巢氏PCR技术和反向线状印迹杂交技术(RLB)，与常规的方法相比具有敏感性高、特异性强、检出率高等优点，参见：Leonhard Schnittger et al.，Simultaneous detection anddifferentiation of Theileria and Babesia parasites infecting small ruminants byreverse line blotting.Parasitol Res 2004，92：189-196；简子健等，.牛环形泰勒虫巢式PCR诊断方法的建立.新疆农业大学学报2008，31(6)：59～62。但是这些方法都具有同一个不可避免的缺点——需要先进的仪器和专业培训的技术人员，而且检测中耗时较多。

鉴别诊断牛环形泰勒虫病在临床与研究中有着特殊意义，但现阶段尚无一种简单有效的手段。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的，鉴别诊断牛环形泰勒虫的检测试剂盒，同时提供这种试剂盒的使用方法。

本发明的鉴别诊断牛环形泰勒虫的试剂盒内至少有两对牛环形泰勒虫特异引物，两对特异引物分别为：

TaF3：atgggaatttaaacctattcc

TaB3：agcactctaattttctcaaagt

TaFIP：acgctattggagctggaattacttttgagtatcaattggagggcaag

TaBIP：agctcgtagttgaatttctgctgttttacaaagaaactccgtccg。

本发明的鉴别诊断牛环形泰勒虫的LAMP试剂盒，其特征是试剂盒内还有：

a)LAMP反应缓冲液；

b)DNA聚合酶；

c)由40pmol的TaFIP和TaBIP，5pmol的TaF3和TaB3组成的牛环形泰勒虫特异引物混合物。

本发明试剂盒的使用方法是：从待检牛只静脉采血，提取血样的基因组DNA，将此基因组DNA与DNA聚合酶、反应缓冲液、灭菌超纯水以及环形泰勒虫特异引物混合物按比例混合均匀，进行LAMP扩增，经扩增后立刻灭活，在扩增产物中加入1μl SYBR Green I荧光染料，若是阳性，则反应产物变为绿色，否则为橙色，因此根据LAMP反应管中所发生颜色的变化判断被检牛只是否感染有牛环形泰勒虫。

本发明实际上是一种利用环介导的恒温扩增技术(LAMP)进行牛环形泰勒虫检测的方法，这种方法是日本科学家Notomi T.等于2000年发明的、具有较高敏感性的DNA扩增技术，参见：Loop-mediated isotheral amplification method，LAMP Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amino，N.，Hase，T.，2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.NucleicAcids Research 28，E63。本发明的试剂盒制备方法简单，而采用本发明的方法进行鉴别诊断牛环形泰勒虫时，不需要复杂的仪器设备，只需要常规的水浴锅就可以完成检测，而且可在普通的实验室进行，经相关的试验表明，本发明提供的特异性引物具有极高的敏感性，其检测过程快速，结果可靠，误检率低。

附图说明

图1为用本发明的试剂盒扩增后所得产物的电泳图片，其中：M泳道为标准DNA(2000：1)，1泳道为牛环形泰勒虫，2泳道为牛瑟氏泰勒虫，3泳道为牛中华泰勒虫，4泳道为牛巴贝斯虫，5泳道为牛卵形巴贝斯虫，6泳道为牛双芽巴贝斯虫，7泳道为牛大巴贝斯虫，8泳道为牛巴贝斯虫未定种，9泳道为牛边虫阳性基因组DNA，10泳道为牛基因组DNA，11泳道为灭菌超纯水。

具体实施方式

以下提供本发明的一个具体实施方式。

(一)感染牛环形泰勒虫血液的获得：

用液氮中保存的含虫血液分别接种实验动物，当染虫率达到5％以上时，以20％枸橼酸钠为抗凝剂，静脉采血，将所采血液4℃条件下2500rpm离心10分钟，弃去上清，尽量将白细胞吸弃。用2％枸橼酸钠洗涤三次(同上2500rpm离心10分钟)，最后将上清去掉，红细胞分装入1.5ml离心管中，-20℃保存。

(二)泰勒虫阴性牛血的获得

采集经血涂片检查和PCR检测阴性的牛的静脉血，同上处理。

(三)从血液中提取基因组的方法：

a)加900μl BRC Cell Lysis Solution于盛300μl血液的1.5ml离心管中，颠倒10次，在室温下放置到液体澄清透明。

b)3000g离心3分钟，弃上清，保留下面的可见的白色沉淀和大约10～20μl液体，涡旋20秒。

c)每管中加入300μl Cell Lysis Solution，吹打混匀。

d)加入100μl Protein Preciptation Solution。

e)蜗旋20秒，至出现棕褐色沉淀颗粒。13000g离心3分钟。将上清液移至新标记的离心管中，加入300μl异丙醇，颠倒50次.

f)13000g离心5分钟。弃上清，在干净的纸巾上放置，将剩余的液体吸干。

g)加入300μl 70％乙醇。13000g离心3分钟，小心除去乙醇，在吸水纸上吸干剩余液体。

h)在Speedcac真空干燥。

i)加入100μl DNA Hydration Solution。

j)4℃过夜或60℃温育1小时。

k)-20℃保存备用。

(四)引入特异性引物，制备LAMP反应缓冲溶液

1)特异引物

牛环形泰勒虫：

TaF3：atgggaatttaaacctattcc

TaB3：agcactctaattttctcaaagt

TaFIP：acgctattggagctggaattacttttgagtatcaattggagggcaag

TaBIP：agctcgtagttgaatttctgctgttttacaaagaaactccgtccg

2)牛环形泰勒虫特异性引物反应混合物(40pmol的TaFIP和TaBIP，5pmol的TaF3和TaB3)。

3)2×LAMP反应缓冲液(40mM Tris-HCl(pH 8.8)，20mM KCl，16mMMgSO₄，20mM(NH4)₂SO₄，0.2％Tween 20，1.6M betaine和2.5mM dNTP)。

4)Bst DNA聚合酶(M0275L，BioLabs)。

5)灭菌超纯水

6)SYBR Green I荧光染料(Lot：738477，invitrogen)。

其具体的操作方法如下：

首先应用灭菌的超纯水按照如下表比例配制无dNTP的2×反应缓冲液储存液。所配制的储存液可在4℃保存3个月，-20℃长期保存。

试剂	总体积900mL	总体积90mL
			1M Tris-Cl(pH 8.8)stock sol.	40mL	4mL
KCl	1.49g	0.15g
			MgSO4(MgSO4·7H2O)	1.93g(3.94g)	0.19g(0.39g)
(NH4)2SO4	2.64g	0.26g
			Tween 20	2mL	0.2mL
Betaine	187.4g	18.7g

使用前每900μL的2×反应缓冲液储存液中加入100μL 25mM dNTP，混匀，制备成2×反应缓冲液工作液，-20℃保存备用。

(五)检测过程

在50μL的离心管中按如下述比例加入待检样品，同时设立标准阳性、阴性基因组DNA和超纯水的空白对照：

2×反应缓冲液工作液     12.5μL

引物反应混合物          0.9μL

灭菌的超纯水            8.6μL

DNA样品                 2.0μL

Bst DNA聚合酶           1.0μL

总体积                  25μL

轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中特定温度下(实验性筛选获得，本发明牛环形泰勒虫为60℃)扩增适当时间(实验性筛选获得，本发明中牛环形泰勒虫为55分钟)，立刻在80℃水浴锅中灭活2分钟。在扩增产物的反应管中加入1μLSYBR Green I荧光染料，肉眼观察其颜色的变化。

(六)检测实例

牛环形泰勒虫的检测：

在10个50μL的离心管中按如前述比例加入样品。引物反应混合物用牛环形泰勒虫特异的引物反应混合物；DNA样品分别应用标准牛环形泰勒虫、标准瑟氏泰勒虫、标准中华泰勒虫、标准牛巴贝斯虫、标准牛卵形巴贝斯虫、标准牛双芽巴贝斯虫、标准牛大巴贝斯虫、标准牛巴贝斯虫未定种、标准牛边虫阳性基因组DNA、标准泰勒虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中60℃扩增55分钟，然后80℃灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。也可在扩增产物的反应管中加入1μL SYBR Green I荧光染料，肉眼观察其颜色的变化。检测结果见图1，结果表明只有牛环形泰勒虫基因组DNA能被特异性的扩增，而瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛边虫阳性基因组DNA、泰勒虫阴性牛基因组DNA，以及灭菌超纯水的反应管中没有扩增。

在本发明的检测方法中所用的上样缓冲液为：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％蔗糖水溶液，所用的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶为由0.04M Tris-乙酸和0.001M EDTA组成的TAE缓冲液配制的2％琼脂糖(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青、40％蔗糖水溶液和2％琼脂糖为质量/体积比，即g/v；0.04M Tris-乙酸和0.001M EDTA为摩尔浓度)，其中含0.5μg/mL的溴化乙锭。

由以上的实例可见，本发明的检测试剂盒具有特异性好，且检测过程简单，整个检测操作过程可以在90分钟内完成，并且不需要任何的特殊仪器设备。

Claims (2)

1.一种鉴别诊断牛环形泰勒虫的试剂盒，其特征是试剂盒内至少有两对牛环形泰勒虫特异引物，两对特异引物分别为：

TaF3：atgggaatttaaacctattcc

TaB3：agcactctaattttctcaaagt

TaFIP：acgctattggagctggaattacttttgagtatcaattggagggcaag

TaBIP：agctcgtagttgaatttctgctgttttacaaagaaactccgtccg。

2.根据权利要求1所述的鉴别诊断牛环形泰勒虫的试剂盒，其特征是试剂盒内还有：

a)LAMP反应缓冲液；

b)DNA聚合酶；

c)由40pmol的TaFIP和TaBIP，5pmol的TaF3和TaB3组成的牛环形泰勒虫特异引物混合物。

d)SYBR Green I荧光染料。