CN104730239A - 羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测羊血清中尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫抗体的羊泰勒虫病的免疫胶体金试纸条，包括PVC垫，PVC垫上表面依次排列用于待检样品上样的样品垫、包被有金标记的尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方；硝酸纤维素膜上分别包被有尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的检测线和多克隆抗体的质控线，还提上述检测试纸条的制备方法。采用该方法制备的检测试纸条检测时具有需要样品量少，操作简单的特点，且不需要复杂仪器，肉眼直接可判读结果，检测简便快速，成本低，适合在基层兽医实验室和兽医工作者使用。
Description
技术领域
本发明属于羊的泰勒虫病检测技术领域，具体涉及一种羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。
背景技术
尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫（Theileria uilenbergi& T. luwenshuni）属于原生生物界（Protista）、顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoea）、梨形虫亚纲（Piroplasmia）、梨形虫目（Piroplasmida）、泰勒科（Theileriidae）、泰勒虫属（Theileria），是引起羊的泰勒虫病的病原。青海血蜱和长角血蜱是该病的传播媒介。羊的泰勒虫病在我国分布广，目前已在四川、青海、甘肃、辽宁、内蒙古、山西、宁夏、新疆、河南、湖北等地检测到了病原或抗体。尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的混合感染较为常见，感染常引起动物高热、贫血、黄疸、呼吸困难、消瘦等特征性临床症状。该病为地方性流行动物疫病，它的流行必需同时具备病原，传播媒介蜱和宿主动物三个要素。该病在易感动物初次接触时易造成爆发，导致动物死亡而造成巨大的经济损失，而且该病疫源地限制了羊种的引进，成为了制约当地养羊业发展的主要因素之一。
目前，羊泰勒虫病的诊断主要有以下几种方法：（1）传统的诊断方法。如：临床症状观察、血涂片镜检、淋巴结穿刺法，取淋巴液，制涂片，镜检等。动物发病时，其临床症状为发热、食物不振、呼吸困难、淋巴结肿大等，血涂片镜检时红细胞内可见虫体（Yin, H., et al. Parasitol Res (2003) 91, 34–39）。传统方法操作人员需具有丰富专业知识和实践经验，而且这些方法只能诊断处在急性发病期的羊。（2）基于核酸检测的病原学检测技术。如PCR (Yin, H.,et al. Transbound Emerg Dis. (2008) 55:233-7)、反向线性印迹杂交技术（RLB）（Schnittger, L., et al. Parasitol Res ( 2004)92:189-96）和成环介导等温扩增法（LAMP）（Liu, Z.,et al. Parasitol Res (2008) 103, 1407-1412）等。这些基于核酸检测的方法，可用于尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的病原学检测。这些方法需要相应的仪器设备，适用于实验室检测，目前还不能用于临床检查。（3）血清学诊断方法。至今用于我国羊的泰勒虫病血清学检测的方法只有三种酶联免疫吸附试验（ELISA）方法。它们分别为基于虫体裂解物粗抗原（Gao, Y., et al. Parasitol Res ( 2002) 88: S8-10）, 基于rTIHSP 70重组蛋白抗原（Miranda, J., et al. Parasitol Res (2006) 98: 561–567）和TuIP重组抗原（Liu, Z., et al. Int J Parasitol (2010) 40, 591–598）的间接ELISA方法。ELISA方法的应用需要相关仪器设备和较强的专业知识，检测耗时较多，适用于实验室检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供一种操作简单、快速、价廉等优点，它不但可以用于实验室快速检测，也可以用于临床现场检测的羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条。
本发明的另一目的还提供上述羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法。
为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：
一种羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，包括PVC垫，所述PVC垫上表面依次排列用于待检样品上样的样品垫、包被有金标记的尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，所述胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，所述吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方；所述硝酸纤维素膜上分别包被有尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的检测线和多克隆抗体的质控线。
上述羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
a. 制备尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原：
采用基因克隆技术聚合酶链式反应PCR扩增出尤氏泰勒虫TuIP基因片段后，与载体连接并转化到感受态细胞中使其表达，得到尤氏泰勒虫TuIP蛋白抗原；
b. 硝酸纤维素膜的点样：
在硝酸纤维素膜检测线上包被尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原，同时在硝酸纤维素膜质控线上包被抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体，晾干；
c. 制备胶体金：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，取质量分数为1%的氯金酸1 ml加入到100 ml双蒸水中，得到的氯金酸溶液置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，95℃-100℃下搅拌加入质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液2.0 ml，继续加热至溶液呈葡萄酒红色为止，制备的胶体金中加入质量分数为2%的NaN3溶液，所述胶体金：质量分数为2%的NaN3溶液的质量比为1：50，最后经一次性灭菌滤器过滤后置于棕色瓶中4℃下保存备用；
d. TuIP抗原-胶体金标记物制备：
将200 μl 尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原加入到20 ml胶体金溶液中，尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的质量浓度为2 mg/ml，搅拌15 min后加入4 ml牛血清白蛋白BSA，牛血清白蛋白BSA的质量分数为5%，再搅拌15 min后离心分离，弃上清，收集尤氏泰勒虫TuIP抗原-胶体金标记物；
e. 将TuIP抗原-胶体金标记物点在结合垫上，37℃烘干30 min后得到胶体金垫；
f. 免疫检测试纸条制备
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在PVC垫上表面制得羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，其中样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，所述胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，所述吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方。
所述步骤b中尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的浓度为0.5 mg/ml，所述抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体用PBS稀释后点样，所述抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体与PBS的体积比为1:15。
所述步骤e中TuIP抗原-胶体金标记物的使用量为2.5 μg/mm2。
所述步骤d中离心分离的转速为10000 rpm，离心时间为40 min。
羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条检测分析结果：
1. 血清
尤氏泰勒虫阳性血清、吕氏泰勒虫阳性血清、羊巴贝斯虫阳性血清、羊无浆体阳性血清、无上述病原感染健康羊的血清（阴性对照），均为本实验室制备和保存的样品。2203、1236和1219号羊是通过尤氏泰勒虫临潭株染虫血感染并在感染后第0、14、19、53和85天分别采血，并制备了血清。 1250、1240和1229号羊是通过将采自羊的泰勒虫疫区甘肃甘南藏族自治州临潭县的青海血蜱在实验条件下叮咬动物，造成羊的泰勒虫感染，并在感染后第0、14、19、53和85天分别采血，并制备了血清（详见Liu, Z., et al. Int J Parasitol (2010) 40, 591–598），其它阴阳性血清均为实验室之前采集的田间样品。
2. 特异性
与羊的泰勒虫相对较近的羊的血液病原还有巴贝斯虫和无浆体，本实验用同一批次的羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条同时检测了经过1:50稀释的尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫阳性血清、羊巴贝斯虫阳性血清、羊无浆体阳性血清和阴性对照血清样品。结果显示（图3），仅有尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫阳性血清在检测线上产生了红色条带，羊巴贝斯虫阳性血清、羊无浆体阳性血清和阴性对照血清均未见条带，说明了该方法能特异的检测尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫阳性血清。
3. 敏感性
为了进一步确定该试纸条的检测性能，将阳性血清分别做了1:50，1:100, 1:200, 1:250, 1:300, 1:500稀释，用同批次的试纸条对这些样品进行了检测以确定该试纸条的检测敏感性，重复3次实验。结果显示，该试纸条可检测到的最高稀释倍数为1:300。当血清稀释到1:200时，仍然可见清晰条带，稀释到1:300时，条带微弱。说明该方法具有较好的敏感性，完全满足基层实验室和基层兽医的检测需要。
4.批内批间重复性试验
批内差异：用尤氏泰勒虫阴阳性血清对同一批次试纸条进行检测，结果完全一致，阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测结果为阴性。
批间差异：用尤氏泰勒虫阴阳性血清对不同批次试纸条进行检定，结果完全一致，阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测结果为阴性。
5. 符合率试验（与间接ELISA检测结果比对）
通过利用羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条和rTuIP-ELISA（详见Liu., et al. Int J Parasitol (2010) 40, 591–598）同时检测127份样品（表2），两者同时检出40份阴性样品，可推算出该试纸条的阴性符合率为100%；两者公检出阳性样品87份，其中试纸条检测81份，可推算出该试纸条的阳性符合率为93.1%。说明该试纸条具有较好的检测性能，完全满足基层实验室和兽医从业者的使用。
6. 检测性能评价
为了进一步确定该方法的检测能力，通过检测用血液接种感染羊2203、1236和1219号按时间顺序采集的血清样品，以及检测通过媒介蜱感染羊1250、1240和1229号按时间顺序采集的血清样品（表1），发现在感染后第14天即可检测到阳性血清，且在感染后第85天仍然可以检测到阳性血清，说明该方法可用于尤氏泰勒虫的早期感染和持续感染。
7.保存期试验
将羊泰勒虫胶体金试纸条放置在4℃ 6个月（确保成品与干燥剂一块存放），间隔相同日期取样，用其检测相同阳性与阴性血清，以上各项指标无显著变化。
羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的使用方法及结果判定：
1．样品前处理方法：采集血液后，37℃放置1 h，以防止溶血。然后3000 rmp，离心20 min。4℃保存备用。
2.胶体金试纸条检测步骤：每次使用试纸条检测样品时，均需要设置阴阳性对照。样品检测方法：将试纸条浸润在血清中（注：血清不能超过提示线），待血清层析到硝酸纤维素膜处，即可取出试纸条，静置10-15 min后，进行结果判定。
3.结果判定：如果只在质控线处出现红色条带的，则判定为阴性；如果在质控线和检测线处均出现红色条带的，则判定为阳性；如果检测线和质控线均未出现红色条带或只有检测线出现一条红色条带的，则判定为无效结果。
表1.羊泰勒虫实验室感染羊按照时间顺序采样、用羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条检测结果
表2 胶体金检测试纸条与ELISA对照检测结果
本发明提供的免疫胶体金试纸条可用于羊血清中尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫抗体的快速检测，该免疫胶体金试纸条检测时需要样品量少，操作简单，不需要复杂仪器，肉眼直接可判读结果，且检测简便快速，适合在基层兽医实验室和兽医工作者使用。提供的免疫胶体金试纸条的制备方法制作简单、方便，成本低。
附图说明
图1为本发明结构示意图；
图2为本发明结构判定示意图；
图3为本发明特异性实验结果示意图。
图中：1—PVC垫；2—样品垫；3—胶体金垫；4—检测线；5—质控线；6—硝酸纤维素膜；7—吸水垫；A—阳性结果；B—阴性结果；C—无效结果；D—使用前的示意图；a—尤氏泰勒虫阳性血清；b—吕氏泰勒虫阳性血清；c—巴贝斯未定种阳性血清；d—羊无浆体阳性血清； e—健康羊血清（阴性对照）。
具体实施方式
实施例1
一种羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，包括PVC垫1，所述PVC垫1上表面依次排列用于待检样品上样的样品垫2、包被有金标记的尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的胶体金垫3、硝酸纤维素膜6和吸水垫7，样品垫2的一端设在胶体金垫3的一端上方，胶体金垫3的另一端设在硝酸纤维素膜6的一端上方，吸水垫7的一端设在硝酸纤维素膜6的另一端上方；硝酸纤维素膜6上分别包被有尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的检测线4和多克隆抗体的质控线5。
上述羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
a. 制备尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原：
采用基因克隆技术聚合酶链式反应PCR扩增出尤氏泰勒虫TuIP基因片段后，与载体连接并转化到感受态细胞中使其表达，得到尤氏泰勒虫TuIP蛋白抗原；
b. 硝酸纤维素膜的点样：
在硝酸纤维素膜检测线上包被尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原，同时在硝酸纤维素膜质控线上包被抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体，晾干；其中尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的浓度为0.5 mg/ml，抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体用PBS稀释后点样，其中抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体与PBS的体积比为1:15。
c. 制备胶体金：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，取质量分数为1%的氯金酸1 ml加入到100 ml双蒸水中，得到的氯金酸溶液置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，100℃下搅拌加入质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液2.0 ml，继续加热至溶液呈葡萄酒红色为止，制备的胶体金中加入质量分数为2%的NaN3溶液，其中胶体金：质量分数为2%的NaN3溶液的质量比为1：50，最后经一次性灭菌滤器过滤后置于棕色瓶中4℃下保存备用；
d. TuIP抗原-胶体金标记物制备：
将200 μl 尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原加入到20 ml胶体金溶液中，尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的质量浓度为2 mg/ml，搅拌15 min后加入4 ml牛血清白蛋白BSA，牛血清白蛋白BSA的质量分数为5%，再搅拌15 min后离心分离，其中离心分离的转速为10000 rpm，离心时间为40 min，离心后弃上清，收集尤氏泰勒虫TuIP抗原-胶体金标记物；
e. 将TuIP抗原-胶体金标记物点在结合垫上，37℃烘干30 min后得到胶体金垫，其中TuIP抗原-胶体金标记物的使用量为2.5 μg/mm2；
f. 免疫检测试纸条制备
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在PVC垫上表面制得羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，其中样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，所述胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，所述吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方。
实施例2
一种羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，包括PVC垫1，所述PVC垫1上表面依次排列用于待检样品上样的样品垫2、包被有金标记的尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的胶体金垫3、硝酸纤维素膜6和吸水垫7，样品垫2的一端设在胶体金垫3的一端上方，胶体金垫3的另一端设在硝酸纤维素膜6的一端上方，吸水垫7的一端设在硝酸纤维素膜6的另一端上方；硝酸纤维素膜6上分别包被有尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的检测线4和多克隆抗体的质控线5。
上述羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
a. 制备尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原：
采用基因克隆技术聚合酶链式反应PCR扩增出尤氏泰勒虫TuIP基因片段后，与载体连接并转化到感受态细胞中使其表达，得到尤氏泰勒虫TuIP蛋白抗原；
b. 硝酸纤维素膜的点样：
在硝酸纤维素膜检测线上包被尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原，同时在硝酸纤维素膜质控线上包被抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体，晾干；其中尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的浓度为0.5 mg/ml，抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体用PBS稀释后点样，其中抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体与PBS的体积比为1:15。
c. 制备胶体金：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，取质量分数为1%的氯金酸1 ml加入到100 ml双蒸水中，得到的氯金酸溶液置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，95℃下搅拌加入质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液2.0 ml，继续加热至溶液呈葡萄酒红色为止，制备的胶体金中加入质量分数为2%的NaN3溶液，其中胶体金：质量分数为2%的NaN3溶液的质量比为1：50，最后经一次性灭菌滤器过滤后置于棕色瓶中4℃下保存备用；
d. TuIP抗原-胶体金标记物制备：
将200 μl 尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原加入到20 ml胶体金溶液中，尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的质量浓度为2 mg/ml，搅拌15 min后加入4 ml牛血清白蛋白BSA，牛血清白蛋白BSA的质量分数为5%，再搅拌15 min后离心分离，其中离心分离的转速为10000 rpm，离心时间为40 min，离心后弃上清，收集尤氏泰勒虫TuIP抗原-胶体金标记物；
e. 将TuIP抗原-胶体金标记物点在结合垫上，37℃烘干30 min后得到胶体金垫，其中TuIP抗原-胶体金标记物的使用量为2.5 μg/mm2；
f. 免疫检测试纸条制备
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在PVC垫上表面制得羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，其中样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，所述胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，所述吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方。
Claims (5)
1.一种羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，其特征在于包括PVC垫（1），所述PVC垫（1）上表面依次排列用于待检样品上样的样品垫（2）、包被有金标记的尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的胶体金垫（3）、硝酸纤维素膜（6）和吸水垫（7），所述样品垫（2）的一端设在胶体金垫（3）的一端上方，所述胶体金垫（3）的另一端设在硝酸纤维素膜（6）的一端上方，所述吸水垫（7）的一端设在硝酸纤维素膜（6）的另一端上方；所述硝酸纤维素膜（6）上分别包被有尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的检测线（4）和多克隆抗体的质控线（5）。
2.根据权利要求1所述的羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a. 制备尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原：
采用基因克隆技术聚合酶链式反应PCR扩增出尤氏泰勒虫TuIP基因片段后，与载体连接并转化到感受态细胞中使其表达，得到尤氏泰勒虫TuIP蛋白抗原；
b. 硝酸纤维素膜的点样：
在硝酸纤维素膜检测线上包被尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原，同时在硝酸纤维素膜质控线上包被抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体，晾干；
c. 制备胶体金：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，取质量分数为1%的氯金酸1 ml加入到100 ml双蒸水中，得到的氯金酸溶液置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，95℃-100℃下搅拌加入质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液2.0 ml，继续加热至溶液呈葡萄酒红色为止，制备的胶体金中加入质量分数为2%的NaN3溶液，所述胶体金：质量分数为2%的NaN3溶液的质量比为1：50，最后经一次性灭菌滤器过滤后置于棕色瓶中4℃下保存备用；
d. TuIP抗原-胶体金标记物制备：
将200 μl 尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原加入到20 ml胶体金溶液中，尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的质量浓度为2 mg/ml，搅拌15 min后加入4 ml牛血清白蛋白BSA，牛血清白蛋白BSA的质量分数为5%，再搅拌15 min后离心分离，弃上清，收集尤氏泰勒虫TuIP抗原-胶体金标记物；
e. 将TuIP抗原-胶体金标记物点在结合垫上，37℃烘干30 min后得到胶体金垫；
f. 免疫检测试纸条制备
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在PVC垫上表面制得羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，其中样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，所述胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，所述吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方。
3.根据权利要求2所述的羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤b中尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的浓度为0.5 mg/ml，所述抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体用PBS稀释后点样，所述抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体与PBS的体积比为1:15。
4.根据权利要求2或3所述的羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤e中TuIP抗原-胶体金标记物的使用量为2.5 μg/mm2。
5.根据权利要求4所述的羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤d中离心分离的转速为10000 rpm，离心时间为40 min。
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