CN101699289A

CN101699289A - 弓形虫抗体检测方法及金标检测卡和制备方法

Info

Publication number: CN101699289A
Application number: CN200910022140A
Authority: CN
Inventors: 李克生; 杜惠芬
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2010-04-28

Abstract

本发明涉及一种弓形虫抗体检测方法及快速检卡和制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的弓形虫抗原载于载体上，并在与胶体金载体相连的检测载体上包被弓形虫分泌抗原形成的检测线和由抗弓形虫抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有弓形虫抗体则在检测载体上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。该检测卡包括加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标弓形虫抗原层；在检测层上包被有由弓形虫分泌抗原形成的检测线和由抗弓形虫抗体形成的控制线。本发明的方法为“一步法”快速检测方法灵敏度高、特异性强；且快速、简便，无需专门设施。

Description

弓形虫抗体检测方法及金标检测卡和制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于诊断、检测弓形虫抗体的方法，以及用于该方法的弓形虫抗体金标快速检测卡和其制备方法。

背景技术

弓形虫感染系全球性分布，是最常见的人畜共患寄生虫病。近年来随着人们生活水平的提高，养猫、狗等宠物的人越来越多，感染弓形虫的机会也随之增多。估计目前感染者约占世界人口的四分之一以上。弓形虫是一种机会性致病原虫，免疫功能低下是弓形虫感染率增高的一个主要因素。据国外报道，艾滋病合并弓形虫病占艾滋病人20％～80％，国外已有较多恶性肿瘤并发弓形虫的报道，而且长期使用免疫抑制剂者或免疫功能受损或下降者，器官移植者等合并或出现全身性泛发性弓形虫的报道亦逐渐增多。此外，弓形虫感染也是引起新生儿出生缺陷的一个重要因素，先天性弓形虫感染对优生优育产生的危害极大，直接影响着人口素质的发展。近年来，许多经济发达国家已将弓形虫检测作为孕期常规筛查项目，我国也开展了包括弓形虫在内的TORCH检测项目。弓形虫抗体金标快速检测卡可用弓形虫感染的快速诊断。

本发明的公开

本发明的第一目的是为了提供一种弓形虫抗体的检测方法，该方法为“一步法”快速检测方法，灵敏度高、特异性强；而且速度快，操作简便，无需专门设施，适用于临床检测、流行病学调查等。

本发明的第二目的是为了提供一种弓形虫抗体金标快速检测卡，该检测卡针对弓形虫抗体检测提供一种简便、快速、而且直接的“一步法”检测卡，利用该检测卡检测弓形虫抗体的灵敏度高、特异性强，而且速度快，操作简便，无需专门设施。

本发明的第三个目的是为了提供一种弓形虫抗体金标快速检测卡的制备方法，该方法简便、稳定性好、重复性好。

本发明的第一目的可通过如下措施来实现：

一种弓形虫抗体检测方法，包括下述步骤：(1)将胶体金标记的弓形虫分泌抗原载于玻璃纤维或无纺布载体上；并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被弓形虫分泌抗原形成的检测线和由抗弓形虫分泌抗原抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有弓形虫抗体则在检测载体上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。

本发明的第二目的可通过如下措施来实现：

一种弓形虫抗体金标快速检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。

所述的检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标弓形虫分泌抗原层；在检测层上包被有由弓形虫分泌抗原形成的检测线和由抗弓形虫抗体形成的控制线。

本发明的第三个目的可通过如下措施来实现：

一种弓形虫抗体金标快速检测卡的制备方法主要包括金标抗原层和检测层及其上包被控制线和检测线的制备，以及检测条和检测卡的组装。

所述的金标抗原层的制备方法包括下述步骤：i胶体金的制备：在浓度为0.004％～0.012％的氯金酸中加入其体积的1.3％～2％、浓度为1％～3％的柠檬酸三钠，煮沸10～20分钟，可得到15～50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记弓形虫抗原，在胶体金溶液中用0.2m碳酸钾溶液调PH8.0～8.4，按4～12mg/100ml加入弓形虫抗原，搅拌后，再在溶液中按0.1～0.6g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2～4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10～15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60～80分钟离心得沉淀物；v将沉淀物按4～10ml/100ml溶于0.02MPh7.4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0.2％～0.6％的动物血清蛋白和0.01％～0.06％叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥形成金标抗原层。

所述的检测层的制备，在制备的纯化兔或羊抗弓形虫抗体和弓形虫分泌抗原中加入固定剂，用专用喷膜机在纤维素膜上形成控制线和检测线；其制备方法是在浓度为0.8-2.4mg/ml的抗原或抗体溶液中加入0.1％-0.3％的固定剂，利用专用喷膜机将抗原或抗体在NC膜上喷线，喷膜后37℃干燥，再用含10％小牛血清的0.01mPH7.0PBS液封闭30分钟，0.01mPH7.0PBS漂洗、37℃干燥得检测层。

所述的固定剂选自甲醛、丙酮中的一种。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明的检测弓形虫抗体的方法为一步法，具有高度的特异性和高灵敏度，其检测快速，结果判定在3～15分钟内完成，无需专门设施。

2、本发明的检测卡检测弓形虫抗体时具有高度的特异性和高灵敏度，检测过程操作迅速、快捷，方便，适合弓形虫感染人群的临床诊断和流行病学调查。

3、本发明的检测卡的制备方法简便、稳定性好、重复性好。

图面说明

图1是本发明检测卡的结构示意图

1-检测卡 2-加样孔 3-观察孔

图2是本发明检测卡的内部结构示意图

4-加样端吸水层 5-金标抗体层 6-控制线

7-检测线 8-检测层 9-吸水端吸水层

10-衬板

本发明的实施方式

本发明还将结合实施例作进一步详述：

实施例一：

一种弓形虫抗体检测方法，包括下述步骤：(1)将胶体金标记的弓形虫抗原载于玻璃纤维或无纺布载体上；并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被弓形虫抗原形成的检测线和由抗弓形虫抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有弓形虫抗体则在检测载体上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。

参照图1，一种弓形虫抗体快速金标检测卡1

参照图2，所述弓形虫抗体金标快速检测卡1是在衬板10上设有加样端吸水层4、检测层8和吸水端吸水层9，在检测层8和吸水端吸水层9之间设有金标弓形虫抗原层5；在检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4由多层玻璃纤维或无纺布制成；吸水端吸水层9由多层滤纸制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维膜；金标抗原层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。

一种金标弓形虫抗体快速检测卡的制备方法包括金标抗原层5和检测层8上检测线7和控制线6的包被，然后在衬板10上组合弓形虫抗体金标快速检测卡1。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水层4和吸水端吸水层9；在其中断粘贴包被检测线和控制线的检测层8，在加样端吸水层4与检测层8的交接部位，夹贴金标抗原层5纤维载体，纤维载体4/5部分夹在加样吸水层4中间，1/5部分叠在检测层8上。然后按4-5毫米宽、8厘米长规格切条，在组装在塑料卡盒内，盒盖上加样孔2正对检测条加样端吸水层4，观察孔3正对检测层8。

所述的金标抗原层5的制备方法包括下述步骤：i胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、在浓度为1％的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，可得到15～50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记弓形虫抗原，取100ml胶体金溶液，用0.2m碳酸钾溶液调PH8.2，入4mg弓形虫抗原，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白(BSA)，继续搅拌5分钟，4℃静置2-4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10～15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心得沉淀物；v将沉淀物溶于4ml 0.02MPH7.4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0.25％BSA和0.02％叠氮钠；vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥2小时形成金标抗原层5。

所述胶体金标记抗原为弓形虫分泌抗原。

所述的检测层8是在硝酸纤维膜(NC)上设有弓形虫分泌抗原构成的检测线7和有羊抗弓形虫分泌抗原抗体形成的控制线6。其制备方法是取弓形虫分泌抗原，调浓度为1mg/ml，加入0.2％甲醛，用专用喷膜机在NC膜中断喷检测线7；取羊抗弓形虫分泌抗原抗体，调浓度为2mg/ml，加入0.2％甲醛，用专用喷膜机在NC膜中断，距检测线0.5cm处喷控制线6，检测线和控制线均按20ul/ml设置喷量，喷膜在37℃干燥2小时，再用含10％小牛血清的0.01mPH7.0PBS液封闭37℃30分钟，0.01mPH7.0PBS漂洗、37℃干燥。

实施例二：

弓形虫抗体检测方法及其金标快速检测卡与例一同。

该检测卡的制备方法除包被检测层8上控制线6的抗体为兔抗弓形虫分泌抗原抗体外，其他条件与例一同。

Claims

1.一种弓形虫抗体检测方法，包括下述步骤：(1)将胶体金标记的弓形虫抗原载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金载体相连的硝酸纤维膜(NC)载体上包被弓形虫分泌抗原形成的检测线和由抗弓形虫抗体形成的控制线；(2)取人血清滴于胶体金标记的载体上，如血清中有弓形虫抗体则在检测载体上形成检测线，检测载体上检测线、控制线双线为阳性，否则为阴性。

2.一种弓形虫抗体金标快速检测卡(1)，其特征在于该检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。

3.如权利要求2所述的弓形虫抗体金标快速检测卡，其特征在于所述弓形虫抗体金标快速检测卡(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层(4)、检测层(8)和吸水端吸水层(9)，在检测层(8)和吸水端吸水层(9)之间设有金标弓形虫抗原层(5)，在检测层(8)上包被有检测线(7)和控制线(6)。

4.如权利要求2所述的弓形虫抗体金标快速检测卡的制备方法，其特征在于包括金标抗原层(5)和检测层(8)及其上包被检测线(7)和控制线(6)的制备，在衬板(10)上组合弓形虫抗体金标检测条和检测卡(1)。

5.如权利要求4所述的弓形虫抗体金标快速检测卡的制备方法，其特征在于所述的金标抗原层(5)的制备方法包括下列步骤：i胶体金的制备：在浓度为0.004％～0.012％的氯金酸中加入其体积的1.3％～2％、浓度为1％～3％的柠檬酸三钠，煮沸10～20分钟，可得到15～50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记弓形虫抗原，在胶体金溶液中用0.2m碳酸钾溶液调PH8.0～8.4，按4～12mg/100ml加入弓形虫抗原，搅拌后，再在溶液中按0.1～0.6g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2～4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10～15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60～80分钟离心得沉淀物；v将沉淀物按4～10ml/100ml溶于0.02MPh7.4Tris-Hcl缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0.2％～0.6％的动物血清蛋白和0.01％～0.06％叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥过滤形成金标抗原层。

6.如权利要求4或5所述的弓形虫抗体金标检测卡的制备方法，特征在于所述胶体金标记抗原为弓形虫分泌抗原。

7.如权利要求4所述的弓形虫抗体金标检测卡的制备方法，其特征在于所述的检测层(8)是在硝酸纤维膜上设有弓形虫分泌抗原构成的检测线(7)和由羊、兔抗弓形虫抗体形成的控制线(6)。

8.如权利要求7所述的弓形虫抗体金标检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的弓形虫抗原为弓形虫分泌抗原。