CN101793895A - 弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学和生物学检测领域，涉及一种检测弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。该试纸条是由PVC底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有检测线(4)和质控线(5)，喷涂胶体金标记弓形虫P35基因重组抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。应用本发明所提供的试纸条检测人血清中弓形虫IgM抗体水平，具有操作简单、快速、灵敏和特异性好等特点，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作，具有良好的应用前景。

Description

弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种利用胶体金免疫层析技术检测血液中弓形虫IgM抗体水平的试纸条及其制备方法，属于医学和生物学检验领域。

背景技术

弓形虫是由一种弓形虫寄生引起的感染，世界各地的弓形虫感染非常普遍。1985-1990年我国的23个省、市、自治区的调查，大都在10％以下。正常人感染弓形虫绝大多数没有症状，或者症状很轻，不知道是什么时候感染的，只有少数人初次感染(或称原发性感染)时有发热、淋巴结肿大、头痛、肌肉关节痛和腹痛，几天或数周后随着人体产生免疫力，症状小时，只是形成的包囊在身体里存在几个月、好几年或者更长时间，一般都是自愈。吃未煮熟的肉，特别是猪、羊。几乎所有哺乳动物和鸟类，如鼠类、猪、羊、牛、家兔和鸡、鸭、鹅等，都可以传染弓形虫，而且感染率很高。人的传染来源主要来自于这些动物的肉类，如涮肉的温度不够和时间过短，其中的弓形虫没有杀死，就有传染的危险。生肉或切肉案板的污染同样可以传染。污染的羊、牛奶也可以传染。

现有检测弓形虫抗体的方法主要是通过酶联免疫吸附(EIA)来检测，该方法有不足之处。主要表现以下几方面：需要专门的仪器设备来配合使用；试剂要求低温保存；检测人员需要经过专业的培训；操作过程相对比较复杂，检测所需的时间较长；检测所需费用较高，不能实现单人份检测；不利于在基层单位及临床的推广使用。也有采用虫体抗原的胶体金诊断试剂，但由于抗原是多种蛋白的复合物，假阳性较多，采用基因重组抗原则可以有效克服以上缺陷。弓形虫表面抗原P35可以有效激发机体的免疫反应，可用来检测人血清中的抗P35抗体，用于弓形虫感染的诊断。

发明内容

为克服现有弓形虫抗体检测技术的不足，本发明提供一种快速检测弓形虫P35血清IgM抗体的试纸条。不需要任何仪器设备辅助的快速检测试剂。本发明根据胶体金免疫层析技术特点和弓形虫P35基因重组抗原系统特点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试纸条检测弓形虫IgM抗体水平，具有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，30分钟以内出结果，并且价格低，适用于基层检测和临床初筛。

本发明所述试纸条是由PVC底板(1)上依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(3)、涂覆胶体金标记弓形虫P35基因重组抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。检测样品经过样品垫和结合垫再经层析作用在NC膜上出现检测线和质控线，用肉眼判断结果。在NC膜上仅仅出现一条质控线，结果为阴性，在NC膜上同时出现检测线和质控线，结果为阳性性，不出现线条表示试纸条或测试卡失效。30分钟内出结果。

本发明所述试纸条吸水垫为一种滤纸，包括吸水纸和滤油纸，切成要求大小直接使用。贴在底板的末端，起吸水作用。

本发明所述试纸条上特定包被的NC膜是一种专门用于胶体金试纸条的材料，由一层滤膜和胶膜组成，成卷筒装，NC膜上喷2条线，分别为检测线和质控线，检测线喷涂的是鼠抗人IgM(μ链)，质控线喷涂的是兔抗P35；NC膜贴在底板的中间，两端分别与结合垫和吸水垫连接。

本发明所述试纸条上结合垫为玻璃纤维纸，喷涂上胶体金标记弓形虫P35基因重组抗原，再37℃干燥，结合垫上与样品垫衔接，下与NC膜衔接。

本发明所述试纸条样品垫为玻璃纤维纸，用硼酸缓冲液浸泡处理，缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，37℃干燥过夜，在试剂条中起过滤样品的作用，位于结合垫上，贴在底板上。

本发明还提供上述试纸条在制备弓形虫P35血清IgM抗体诊断试纸条中的应用，诊断试纸条还包括标识条，此标识条为两个带有标识的不干胶纸，分别粘贴在试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。

本发明还提供上述试纸条在制备弓形虫P35血清IgM抗体测试卡中的应用，测试卡还包括塑料卡，此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔、一个样品孔以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示检测线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。此塑料卡起保护试纸条的作用，并且更美观，减少污染和保护操作者的安全。

本发明所述试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1)弓形虫P35基因重组抗原，自制或购买，分子量：35kDa，纯度：10ug上样SDS-PAGE一条带。

2)鼠抗人-IgM(μ链)，自制或购买。

3)兔抗P35制备方法：通过弓形虫P35基因重组抗原免疫家兔，提取兔血清，纯化后得到兔抗P35。

4)胶体金的制备：

a量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中，煮沸5分钟；

b量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟；

c弃去超纯水，称取适量三蒸水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入适量1％氯金酸，加热至沸腾；

d搅拌下加入6～10毫升1％柠檬酸三钠，沸腾5-10分钟；

5)胶体金探针标记：

取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值8.0，搅拌加入1毫升弓形虫P35基因重组抗原，再缓慢加入1毫升10％BSA充分混匀，搅拌，离心弃上清，加入工作液溶解；

6)制备检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条：

用喷涂机将标记弓形虫P35基因重组抗原的胶体金溶液喷在玻璃纤维膜上，37℃干燥；将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(μ链)和质控抗体(兔抗P35)，喷完后37℃干燥过夜；将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条。

上述胶体金制备过程中，优选后的条件为：三蒸水200毫升，氯金酸10毫升，柠檬酸三钠7.5毫升。

本发明的有益效果：应用本发明提供的试纸条检测人体内弓形虫P35血清IgM抗体水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，不需要特殊检测仪器设备，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展。本发明有益于弓形虫IgM抗体筛查的普及，进而对于弓形虫事件发生的预防有极为重要的意义。

附图说明

图1为本发明的结构示意图

1：PVC底板；2：吸水垫；3：特定包被的硝酸纤维膜；4：检测线；5：质控线；6：结合垫；7：样品垫。

图2为本发明的检测结果示意图

a：阳性；b：阴性；c：无效；4：检测线；5：质控线。

图3为本发明的试纸条外观示意图

a：样本垫；b：结合垫；c：检测线；d：质控线；e：试纸条名称

图4为本发明的测试卡外观示意图

a：样本孔；b：测试孔；T：检测线；C：质控线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

弓形虫P35血清IgM抗体胶体金免疫试纸条制备方法，它包括如下步骤：

1、胶体金的制备：

量取一定量的洗液于洁净的250ml三角烧瓶中，煮沸5分钟；量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟；弃去超纯水，称取200ml超纯水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入1％氯金酸10ml，边煮边搅拌，加热至沸腾；搅拌下加入1％柠檬酸三钠10ml，沸水下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色慢慢稳定，呈红色后，继续沸腾5分钟，制成小颗粒胶体金。

2、制备检测弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条：

用喷涂机将标记弓形虫P35基因重组抗原的胶体金溶液喷涂在玻璃纤维膜上，37℃干燥；将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(μ链)和质控抗体(兔抗P35)。喷完后37℃干燥过夜。将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条。

实施例2：

弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫诊断试纸条制备方法，它包括如下步骤：

将两个带有标识的不干胶纸(标识条)分别粘贴在实施例2中所制备试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。即成一种检测弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫诊断试纸条。

见图3。

实施例3：

弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫诊断测试卡制备方法，它包括如下步骤：

将实施例2中所制备试纸条放入塑料卡下片试纸条槽中，与上片嵌合，即成一种检测同型半胱氨酸的胶体金免疫诊断测试卡，见图4。此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔(见图4b)、一个样品孔(见图4a)以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示检测线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。

实施例4：

弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金诊断层析试纸条使用方法：

如图3所示，将试纸条样品垫插入待测液中，浸润后取出，水平放置，约30分钟后，仅在质控线C处出现一条线，结果为阴性；在检测线T和质控线C处分别出现一条线，结果为阳性；不出现线条表示测试条失效。

实施例5：

弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金诊断层析测试卡使用方法：

如图4所示，将样本加入样本孔a，加样量75微升～80微升，水平放置，约30分钟后，仅在测试孔b的质控线C处出现一条线，结果为阴性；在测试孔b的检测线T和质控线C处分别出现一条线，结果为阳性；不出现线条表示测试卡失效。

Claims (2)

1.一种检测弓形虫P35血清IgM抗体的免疫胶体金层析试纸条，其特征在于：所述试纸条是由PVC底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有检测线(4)和质控线(5)，喷涂胶体金标记弓形虫P35基因重组抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。

所述试纸条其特征在于：所述吸水垫(2)为一种滤纸，包括吸水纸和滤油纸；吸水垫贴在底板的末端。

所述试纸条其特征在于：所述特定包被的NC膜(3)由一层滤膜和胶膜组成，NC膜上喷涂鼠抗人-IgM(μ链)和兔抗P35；NC膜贴在底板的中间，两端分别与结合垫和吸水垫连接。

所述试纸条其特征在于：所述结合垫(6)为玻璃纤维纸，喷涂上胶体金标记的弓形虫P35基因重组抗原，再37℃干燥，结合垫上与样品垫衔接，下与NC膜衔接。

所述试纸条，其特征在于：所述样品垫(7)为玻璃纤维纸，用硼酸缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，37℃干燥过夜；样品垫位于结合垫上。

所述的试纸条在制备弓形虫血清IgM抗体诊断试纸条中的应用，其特征在于：诊断试纸条还包括标识条，此标识条为两个带有标识的不干胶纸，分别粘贴在试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。

所述的试纸条在制备弓形虫血清IgM抗体测试卡中的应用，其特征在于：测试卡还包括塑料卡，此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔、一个样品孔以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示检测线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。

2.一种检测弓形虫血清IgM抗体的免疫胶体金层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：1、弓形虫P35基因重组抗原：自制或购买，分子量：35kDa，纯度：10ug上样SDS-PAGE一条带。2、鼠抗人-IgM(μ链)：自制或购买。3、兔抗P35制备方法：通过形虫P35基因重组抗原免疫家兔，提取兔血清，纯化后得到兔抗P35。4、胶体金的制备：a)量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中，煮沸5分钟；b)量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟；c)弃去超纯水，称取适量三蒸水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入适量1％氯金酸，加热至沸腾；d)搅拌下加入6～10毫升1％柠檬酸三钠，沸腾5-10分钟；5、胶体金探针标记：取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值8.0，搅拌加入1毫升弓形虫P35基因重组抗原，再缓慢加入1毫升10％BSA充分混匀，搅拌，离心弃上清，加入工作液溶解；6、制备检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条：用喷涂机将标记弓形虫P35基因重组抗原的胶体金溶液喷涂在玻璃纤维膜上，37℃干燥；将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(μ链)和质控抗体(兔抗P35)，喷完后37℃干燥过夜；将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条。

所述制备方法其特征在于：c)步中所述三蒸水为200毫升，所述氯金酸为10毫升，d)步中所述柠檬酸三钠为7.5毫升。

Images