CN101246172A - 叶酸免疫胶体金检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种叶酸免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。该试纸条是由底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有捕获线(4)和质控线(5)，涂覆胶体金标记特异抗体的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物；所述玻璃纤维胶体金结合垫(6)涂覆胶体金标记特异抗体为叶酸单克隆抗体。应用本发明所提供的试纸条检测人血清中叶酸水平，具有操作简单、快速、灵敏和特异性好等特点，具有良好的应用前景。

Description

叶酸免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种利用胶体金免疫层析技术检测血液中叶酸水平的试纸条及其制备方法，属于医学检验领域。

背景技术

叶酸是一组化学结构相似，生化特性相近的化合物统称，是由喋啶、对氨基苯甲酸和1个或多个谷氨酸结合而成。叶酸为机体细胞生长和繁殖所必须的物质，能够帮助蛋白质代谢，与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，同时还是制造红血球不可缺少的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化；在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色；是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质。叶酸对于孕妇尤其重要，能够满足新生儿的营养需求，减少新生儿的神经管畸形的发生，并促进乳汁分泌。此外，人们还发现叶酸可引发癌细胞凋亡，同时通过影响癌细胞的基因表达发挥抗肿瘤作用。对婴幼儿神经细胞与脑细胞发育有促进作用，还可作为精神分裂症病人的辅助治疗，以及用于治疗慢性萎缩性胃炎、抑制支气管鳞状转化以及防治因高同型半胱氨酸血症引起的冠状动脉硬化症、心肌损伤与心肌梗塞等。摄取不足、吸收障碍、需求量增加、利用障碍，如妊娠期、巨幼细胞贫血、肝硬化、各类急慢性白血病、慢性溶血等原因均可引起血清叶酸减少。血清叶酸缺乏会导致巨幼红细胞贫血；妇女孕前或妊娠早期缺乏叶酸是神经管畸形发生的重要病因之一；同时，叶酸与同型半胱氨酸代谢关系密切，叶酸缺乏可使同型半胱氨酸向蛋氨酸转化出现障碍，进而导致同型半胱氨酸血症，从而导致心血管发病风险，故检测叶酸水平对预防心血管疾病的发生亦具有重要意义。

叶酸检测目前主要采用的技术方法有：高效液相(HPLC)方法、荧光偏振免疫检测(FPLA)方法、酶联免疫技术(ELISA)、和化学发光法等。高效液相(HPLC)方法操作比较复杂，试验耗时比较长，且试验数据变异比较大。荧光偏振免疫检测(FPLA)方法检测费时，须配备专用全自动荧光分析仪器，设备昂贵，不宜普及。酶联免疫技术(ELISA)大部分操作为手工操作，比较耗时，定量检测需配备仪器，必须有专门的实验室。化学发光法，检测时间在2h以上，且价格昂贵。以上方法均不适于在基层检验场所应用。免疫胶体金层析技术操作简单、快速、敏感和特异性好，用于叶酸的快速检测，有益于叶酸基层医疗机构检测的普及，此项技术虽然是一种较为成熟的技术，但对不同的抗原抗体系统的应用有差异，包括原料来源，试剂配制，生产工艺等都不同，需进行新的设计和试验。目前国内外均未查到有用于检测叶酸的免疫胶体金层析快速诊断试纸条，包括文献报道和发明专利。

发明内容

为克服现有叶酸检测技术的不足，本发明提供一种检测叶酸的试纸条。本发明根据胶体金免疫层析技术特点和叶酸抗原抗体系统特点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试纸条检测叶酸水平，具有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，15分钟以内出结果，并且价格低，适用于基层检测和临床初筛。

本发明所述试纸条是由底板上依次接合吸水垫、特定包被的硝酸纤维膜、涂覆胶体金标记特异抗体的玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫而组成的条形物；所述玻璃纤维胶体金结合垫涂覆胶体金标记特异抗体为叶酸单克隆抗体。检测样品经过样品垫和结合垫再经层析作用在NC膜上出现捕获线和质控线，用肉眼判断结果。在NC膜上仅仅出现一条质控线，结果为阳性，在NC膜上同时出现捕获线和质控线，结果为阴性，不出现线条表示试纸条或测试卡失效。15分钟内出结果。

本发明所述试纸条吸水垫为一种滤纸，包括吸水纸和滤油纸，切成要求大小直接使用。贴在底板的末端，起吸水作用。

本发明所述试纸条上特定包被的NC膜是一种专门用于胶体金试纸条的材料，由一层滤膜和胶膜组成，成卷筒装，NC膜上喷2条线，分别为捕获线和质控线，捕获线喷涂的是叶酸-牛血清白蛋白抗原，质控线喷涂的是兔抗小鼠二抗；NC膜贴在底板的中间，两端分别与结合垫和吸水垫连接。

本发明所述试纸条上结合垫为玻璃纤维纸，用含聚乙烯醇的硼酸缓冲液浸泡处理后，37℃干燥过夜，喷涂上胶体金标记的叶酸单克隆抗体，再冷冻干燥，叶酸单克隆抗体是针对叶酸抗原表位，结合垫上与样品垫衔接，下与NC膜衔接。

本发明所述试纸条样品垫为玻璃纤维纸，用含聚乙烯醇的硼酸缓冲液浸泡处理，缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，37℃干燥过夜，在试剂条中起过滤样品的作用，位于结合垫上，贴在底板上。

本发明还提供上述试纸条在制备HCY诊断试纸条中的应用，诊断试纸条还包括标识条，此标识条为两个带有标识的不干胶纸，分别粘贴在试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。

本发明还提供上述试纸条在制备HCY测试卡中的应用，测试卡还包括塑料卡，此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔、一个样品孔以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示捕获线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。此塑料卡起保护试纸条的作用，并且更美观，减少污染和保护操作者的安全。

本发明所述试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1)叶酸-BSA抗原制备：

将BSA、叶酸和偶联剂于反应液中室温避光反应，凝胶层析分离偶联物，透析，浓缩，制成免疫抗原和包被抗原。

2)胶体金的制备：

a量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次酸洗液，煮沸5分钟；

b量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次超纯水，煮沸5分钟；

c弃去超纯水，称取适量三蒸水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入适量1％氯金酸，加热至沸腾；

d搅拌下加入6-10毫升2％柠檬酸三钠，沸腾5-10分钟。

3)胶体金探针标记：将叶酸单克隆抗体用0.005mol/L NaCl透析过夜，离心除去蛋白沉淀。取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值9.0，搅拌加入1毫升稀释的叶酸单克隆抗体，再缓慢加入1毫升10％BSA充分混匀，搅拌15分钟，4℃13000g/min离心40分钟；弃上清，加入工作液100毫升溶解；在容器上贴上标签，注上批号、批量及有效期；储存条件：4℃保存。

4)制备检测叶酸的胶体金免疫试纸条：

先将玻璃纤维膜放入质量百分比浓度为1％的牛血清白蛋白、质量百分比浓度为1％的TX-100的磷酸盐缓冲液中封闭30min，37℃烘干。再将玻璃纤维膜浸泡于标记叶酸单克隆抗体的胶体金探针中，真空干燥。将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上捕获抗原(叶酸-BSA偶联抗原)和质控抗体(兔抗Balb/c球蛋白抗体)。喷完后37℃干燥过夜。将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜(NC膜)、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫、标识条依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测叶酸的胶体金免疫试纸条。

上述胶体金制备过程中，优选三蒸水200毫升，氯金酸10毫升，柠檬酸三钠7.5毫升。

上述胶体金探针标记过程中，优选加入10％BSA后，再加入1毫升10％PEG20000充分混匀，离心弃上清，加入工作液溶解。

本发明的有益效果：应用本发明提供的试纸条检测人体内叶酸水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，不需要特殊检测仪器设备，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展。本发明有益于叶酸缺乏的筛查的普及，进而对于心脑血管事件发生，新生儿神经管畸形等疾病的预防有极为重要的意义。

附图说明

图1为本发明的结构示意图

1：底板；2：吸水垫；3：特定包被的硝酸纤维膜；4：捕获线；5：质控线；6：结合垫；7：样品垫。

图2为本发明的检测结果示意图

a：阴性；b：阳性；c：无效；4：捕获线；5：质控线

图3为本发明的试纸条外观示意图

a：样本垫；b：结合垫；c：捕获线；d：质控线；e：试纸条名称

图4为本发明的测试卡外观示意图

a：样本孔；b：测试孔；T：捕获线；C：质控线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

叶酸胶体金免疫试纸条制备方法，它包括如下步骤：

1、叶酸-BSA抗原制备：

取适量BSA和叶酸分别溶于12.5mlPBS锥形瓶中，各自磁力搅拌器搅拌10分钟，将叶酸溶液加入BSA溶液中，边加边搅拌，再加入25％戊二醛，避光反应5小时，凝胶层析分离偶联物，于PBS内透析24h，浓缩。

2、胶体金的制备：

量取一定量的洗液于洁净的250ml三角烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次酸洗液，煮沸5分钟；量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次超纯水，煮沸5分钟；弃去超纯水，称取200ml超纯水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入1％氯金酸10ml，边煮边搅拌，加热至沸腾；搅拌下加入2％柠檬酸三钠10ml，沸水下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色慢慢稳定，呈红色后，继续沸腾7分钟，制成小颗粒胶体金。

3、胶体金探针标记：

将叶酸单克隆抗体用0.005mol/LNaCl透析过夜，离心除去蛋白沉淀。取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值9.0，搅拌加入1毫升稀释的SAH单克隆抗体，再加入1毫升10％BSA充分混匀，缓慢加入，搅拌15分钟，离心，条件4℃13000g/min，40分钟；弃上清，加入工作液100毫升溶解；储存条件：4℃保存。

4、制备检测叶酸的胶体金免疫试纸条：

先将玻璃纤维膜放入质量百分比浓度为1％的牛血清白蛋白、质量百分比浓度为1％的TX-100的磷酸盐缓冲液中封闭30min，37℃烘干，再将玻璃纤维膜浸泡于标记叶酸单克隆抗体的胶体金探针中，真空干燥，将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上捕获抗原(叶酸-BSA偶联抗原)和质控抗体(兔抗Balb/c球蛋白抗体)。喷完后37℃干燥过夜。将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测叶酸的胶体金免疫试纸条。

实施例2：

叶酸胶体金免疫试纸条制备方法，它包括如下步骤：

叶酸-BSA抗原为实施例1制备。

1、胶体金的制备：

量取一定量的洗液于洁净的250ml三角烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次酸洗液，煮沸5分钟；量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次超纯水，煮沸5分钟；弃去超纯水，称取200ml超纯水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入1％氯金酸10ml，边煮边搅拌，加热至沸腾；搅拌下加入2％柠檬酸三钠7.5ml，沸水下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色慢慢稳定，呈红色后，继续沸腾9分钟，制成中等大小的胶体金颗粒。

2、胶体金探针标记：

将叶酸单克隆抗体用0.005mol/LNaCl透析过夜，离心除去蛋白沉淀。取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值9.0，搅拌加入1毫升稀释的叶酸单克隆抗体，再加入1毫升10％BSA充分混匀，再加入1毫升10％PEG20000充分混匀，缓慢加入，搅拌15分钟，离心，条件4℃13000g/min，40分钟；弃上清，加入工作液100毫升溶解；在容器上贴上标签，注上批号、批量及有效期；储存条件：4℃保存。

3、制备检测叶酸的胶体金免疫试纸条：

先将玻璃纤维膜放入质量百分比浓度为1％的牛血清白蛋白、质量百分比浓度为0.5％的TX-100的磷酸盐缓冲液中封闭30min，37℃烘干，再将玻璃纤维膜浸泡于标记叶酸单克隆抗体的胶体金探针中，真空干燥，将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上捕获抗原(叶酸-BSA偶联抗原)和质控抗体(兔抗Balb/c球蛋白抗体)。喷完后37℃干燥过夜。将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测叶酸的胶体金免疫试纸条。

实施例3：

叶酸胶体金免疫试纸条制备方法，它包括如下步骤：

叶酸-BSA抗原为实施例1制备。

1、胶体金的制备：

量取一定量的洗液于洁净的250ml三角烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次酸洗液，煮沸5分钟；量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次超纯水，煮沸5分钟；弃去超纯水，称取200ml超纯水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入1％氯金酸10ml，边煮边搅拌，加热至沸腾；搅拌下加入2％柠檬酸三钠6.6ml，沸水下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色慢慢稳定，呈红色后，继续沸腾9分钟，制成较大的胶体金颗粒。

2、胶体金探针标记：

将叶酸单克隆抗体用0.005mol/LNaCl透析过夜，离心除去蛋白沉淀。取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值9.0，搅拌加入1毫升稀释的叶酸单克隆抗体，再加入1毫升10％BSA充分混匀，再加入1毫升10％Casein充分混匀，缓慢加入，搅拌15分钟，离心，条件4℃13000g/min，40分钟；弃上清，加入工作液100毫升溶解；在容器上贴上标签，注上批号、批量及有效期；储存条件：4℃保存。

3、制备检测叶酸的胶体金免疫试纸条：

先将玻璃纤维膜放入质量百分比浓度为1％的牛血清白蛋白、质量百分比浓度为0.5％的TX-100的磷酸盐缓冲液中封闭30min，37℃烘干，再将玻璃纤维膜浸泡于标记SAH单克隆抗体的胶体金探针中，真空干燥，将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上捕获抗原(叶酸-BSA偶联抗原)和质控抗体(兔抗Balb/c球蛋白抗体)。喷完后37℃干燥过夜。将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测叶酸的胶体金免疫试纸条。

实施例4：

叶酸的胶体金免疫诊断试纸条制备方法，它包括如下步骤：

将两个带有标识的不干胶纸(标识条)分别粘贴在实施例2中所制备试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。即成一种检测叶酸的胶体金免疫诊断试纸条，见图3。

实施例5：

叶酸的胶体金免疫诊断测试卡制备方法，它包括如下步骤：

将实施例2中所制备试纸条放入塑料卡下片试纸条槽中，与上片嵌合，即成一种检测叶酸的胶体金免疫诊断测试卡，见图4。此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔(见图4b)、一个样品孔(见图4a)以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示捕获线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。

实施例6：

叶酸免疫胶体金诊断层析试纸条使用方法：如图1，2所示，将试纸条样品垫7插入待测液中，浸润后取出，水平放置，约10～15分钟后，在NC膜3上仅仅出现一条质控线5，见图2b，结果为阳性，在NC膜3上同时出现捕获线4和质控线5，见图2a，结果为阴性，不出现线条见图2c表示试纸条失效。试纸条检测灵敏度为1ng/ml。

实施例7：

叶酸免疫胶体金诊断层析测试卡使用方法：如图4所示，将样本加入样本孔a，加样量75微升～80微升，水平放置，约10～15分钟后，仅在测试孔b的质控线C处出现一条线，结果为阳性，在测试孔b的捕获线T和质控线C处分别出现一条线，结果为阴性，不出现线条表示测试卡失效。测试卡检测灵敏度为1ng/ml。

Claims (10)

1. 一种检测叶酸的免疫胶体金层析试纸条，其特征在于：所述试纸条是由底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有捕获线(4)和质控线(5)，涂覆胶体金标记特异抗体的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物；所述玻璃纤维胶体金结合垫(6)涂覆胶体金标记特异抗体为叶酸单克隆抗体。

2. 根据权利要求1所述试纸条，其特征在于：所述吸水垫(2)为一种滤纸，包括吸水纸和滤油纸；吸水垫贴在底板的末端。

3. 根据权利要求1所述试纸条，其特征在于：所述特定包被的NC膜(3)由一层滤膜和胶膜组成，NC膜上涂叶酸-牛血清白蛋白抗原和兔抗小鼠二抗；NC膜贴在底板的中间，两端分别与结合垫和吸水垫连接。

4. 根据权利要求1所述试纸条，其特征在于：所述结合垫(6)为玻璃纤维纸，用含聚乙烯醇的硼酸缓冲液浸泡处理后，37℃干燥过夜，喷涂上胶体金标记的叶酸单克隆抗体，再冷冻干燥，叶酸单克隆抗体是针对叶酸抗原表位，结合垫上与样品垫衔接，下与NC膜衔接。

5. 根据权利要求1所述试纸条，其特征在于：所述样品垫(7)为玻璃纤维纸，用含聚乙烯醇的硼酸缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，37℃干燥过夜；样品垫位于结合垫上。

6. 一种权利要求1所述的试纸条在制备叶酸诊断试纸条中的应用，其特征在于：诊断试纸条还包括标识条，此标识条为两个带有标识的不干胶纸，分别粘贴在试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。

7. 一种权利要求1所述的试纸条在制备叶酸测试卡中的应用，其特征在于：测试卡还包括塑料卡，此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔、一个样品孔以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示捕获线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。

8. 一种检测叶酸的免疫胶体金层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1)叶酸-BSA抗原制备：

将叶酸、BSA和偶联剂于反应液中室温避光反应，凝胶层析分离偶联物，透析，浓缩，制成免疫抗原和包被抗原；

2)胶体金的制备：

a量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次酸洗液，煮沸5分钟；

b量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟，再换一次超纯水，煮沸5分钟；

c弃去超纯水，称取适量三蒸水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入适量1％氯金酸，加热至沸腾；

d搅拌下加入6～10毫升2％柠檬酸三钠，沸腾5-10分钟；

3)胶体金探针标记：将叶酸单克隆抗体用NaCl透析过夜，离心除去蛋白沉淀；取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值9.0，搅拌加入1毫升稀释的叶酸单克隆抗体，再缓慢加入1毫升10％BSA充分混匀，搅拌，离心弃上清，加入工作液溶解；

4)制备检测叶酸的胶体金免疫试纸条：先将玻璃纤维膜放入质量百分比浓度为1％的牛血清白蛋白、质量百分比浓度为1％的TX-100的磷酸盐缓冲液中封闭30min，37℃烘干，再将玻璃纤维膜浸泡于标记叶酸单克隆抗体的胶体金探针中，真空干燥，将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上捕获抗原(叶酸-BSA偶联抗原)和质控抗体(兔抗Balb/c球蛋白抗体)，喷完后37℃干燥过夜；将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测叶酸的胶体金免疫试纸条。

9. 根据权利要求8所述制备方法，其特征在于：2)步中所述三蒸水为200毫升，所述氯金酸为10毫升，所述柠檬酸三钠为7.5毫升。

10. 根据权利要求8所述制备方法，其特征在于：3)步中所述加入10％BSA后，再加入1毫升10％PEG20000充分混匀，离心弃上清，加入工作液溶解。

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