CN104391118A

CN104391118A - 降钙素原检测方法与检测装置、以及检测材料的制备方法

Info

Publication number: CN104391118A
Application number: CN201410634789.6A
Authority: CN
Inventors: 郑焕巍; 夏峰; 安培; 刘玉芬
Original assignee: SHENZHEN GENIUS ELECTRONICS CO Ltd
Current assignee: Shenzhen Jinrui Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2014-11-12
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-11-12
Also published as: CN104391118B

Abstract

本发明公开了一种降钙素原的检测方法与检测装置、以及一种降钙素原检测材料的制备方法；其中，所述制备方法包括以下步骤：加热氯金酸溶液至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，制成胶体金颗粒；将降钙素原的抗体加入到胶体金颗粒；抗体标记完成后，加入牛血清白蛋白进行封闭；离心，弃去上清，得到沉淀物，采用冻干液复溶所述沉淀物，然后进行干燥，得到标记后的胶体金颗粒。采用上述方案，本发明提高胶体金颗粒的均一性和胶体金颗粒的偶联效率，从而提高试剂的灵敏度，具有很高的市场应用价值。

Description

降钙素原检测方法与检测装置、以及检测材料的制备方法

技术领域

本发明涉及降钙素原的检测，尤其涉及的是，一种降钙素原的检测方法与检测装置、以及一种降钙素原检测材料的制备方法。

背景技术

降钙素原(PCT)的检测，通常采用胶体金检测技术，目前市场上有此类的产品出现，但是检测灵敏度都在0.5ng/mL左右。例如，其检测的方法原理是，用一株特异性的降钙素原单抗偶联到烧制好的胶体金颗粒上面，并将其铺到金标垫上烘干，用另一株特异性的降钙素原单抗包被到NC膜上。当含有PCT的样本加入加样孔后，样本中的PCT与偶联到胶体金颗粒上的鼠抗PCT单克隆抗体结合，形成胶体金-抗体-抗原的复合物，该免疫复合物再沿着硝酸纤维素膜层析至检测区(T)，与预包被的鼠抗PCT单抗结合，在检测区呈现紫红色的反应线，其呈色深浅与样本中的PCT含量成正比。

现有技术方案通常采用以下步骤实现。

第一、胶体金纳米颗粒的烧制：用万分之四浓度的氯金酸溶液加入适量的还原剂，这样氯金酸被还原生成一定大小的胶体金纳米颗粒。胶体金纳米颗粒的大小和均一性对实验的结果影响非常大，主要是对灵敏度和测试的重复性的影响。

第二、胶体金纳米颗粒的标记：把一定浓度的降钙素原抗体偶联到胶体金颗粒上面。其偶联的条件和偶联的效率，会直接影响试剂检测PCT的性能---灵敏度。

第三、喷金、干燥：把标记好的胶体金纳米颗粒均匀喷在玻璃纤维上面，并用烘干或者冻干的方式将其干燥。

第四、包被：将一定浓度的降钙素原抗体用点膜仪均匀的在硝酸纤维素膜上划线，然后放入干燥箱干燥2-4小时。这个过程就是将抗体包被到硝酸纤维素膜上面的过程。

第五、组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸按照一定顺序贴在PVC板上面。贴好后，切条装卡，然后装袋封口。

例如，中国专利200510061471.4公开了降钙素原(PCT)的制备方法属于医药和生物工程技术领域，涉及一种临床上可以快速准确反应炎症指标的多肽PCT的制备方法，发明采用PCT cDNA以基因工程方法制备含116个氨基酸残基的PCT。用PCR技术将表达PCT的目的基因扩增，纯化其产物，将纯化的PCR产物予BamH I与Hind III双酶切后定向插入经同样双酶切的pet41a，获得重组质粒，再将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经培养扩增，抽提纯化，镍柱收集目标峰，真空冷冻干燥。本发明方法获得的降钙素原得率高、成本低，可以为制备临床诊断试剂提供大量的原材料。

又如，中国专利201080016842.6公开了用于检测降钙素原的免疫测定法，其涉及用于在源自于从对象获得的体液的生物样品中检测降钙素原或其长度为至少20个氨基酸残基的片段的体外方法，所述方法包含下列步骤：(i)将所述样品与针对降钙素原不同表位的至少两种抗体或其功能片段相接触，以及(ii)定性或定量检测所述至少两种抗体与降钙素原或其所述片段的结合，其中结合指示了所述样品中降钙素原或所述片段的存在或浓度，其中至少一种抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位。该发明还涉及针对降钙素原的N-末端表位的抗体以及包含针对PCT的抗体的试剂盒。

又如，中国专利201210464257.3涉及一种检测技术领域的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，所述试剂盒包含常规载体以及固定在所述常规载体上的对应降钙素原不同区域的单克隆或多克隆的捕获抗体；以及与所述的捕获抗体配伍的，以合适标记物标记的多个针对降钙素原相同或不同区域的单克隆或多克隆抗体。本发明的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，通过标记与包被多抗体对的不同识别区域及空间配伍，能够最大限度地捕捉样本中降钙素原，提高检测灵敏度；该发明的试剂盒将PCT的检测灵敏度提高至0.1ng/ml(实质上是0.2ng/ml)，拓展了PCT快速检测试剂在细菌性感染诊断、鉴别诊断及治疗中的应用价值及范围，可用于细菌性感染的诊断、鉴别诊断、治疗疗效监测及预后评估。

但是，现在技术存在以下问题：胶体金纳米颗粒的制作过程不易控制，颗粒的均一性不能得到保证，从而影响试剂卡的重复性；并且，胶体金颗粒的偶联效率偏低，导致灵敏度也会偏低，市场上产品的灵敏度多数在0.5ng/mL左右，较好的产品在0.2ng/mL左右。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的降钙素原的检测方法与检测装置、以及一种降钙素原检测材料的制备方法。

本发明的一个技术方案如下：一种降钙素原检测材料的制备方法，其包括以下步骤：加热氯金酸溶液至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，制成胶体金颗粒；将降钙素原的抗体加入到胶体金颗粒；抗体标记完成后，加入牛血清白蛋白进行封闭；离心，弃去上清，得到沉淀物，采用冻干液复溶所述沉淀物，然后进行干燥，得到标记后的胶体金颗粒。

优选的，所述冻干液的组成成分为：20mM pH6.8-8.2的PBS+0.5-5％的BSA+0.01-0.5％的吐温20。

优选的，所述冻干液的组成成分为：20mM pH8.0的PBS+2％的BSA+0.1％的吐温20。

优选的，所述制备方法包括以下步骤：将500mL质量体积比为0.04％的氯金酸溶液在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，开始沸腾时，将搅拌器的搅拌速度调整到每分钟100至400转，待沸腾0.5至3分钟后，迅速加入18至24mL质量比为2％的柠檬酸钠溶液，保持沸腾3至10分钟，制成胶体金颗粒；将胶体金溶液的PH值调整到pH7.2至8.9之间，并将降钙素原的抗体浓度控制在5至20μg/mL，将降钙素原的抗体加入到胶体金颗粒；抗体标记完成后，迅速加入0.5至5mg/mL的牛血清白蛋白进行封闭；离心，弃去上清，得到沉淀物，采用冻干液复溶所述沉淀物，然后进行干燥，得到标记后的胶体金颗粒。

优选的，开始沸腾时，将搅拌器的搅拌速度调整到每分钟120转，待沸腾1分钟后，迅速加入柠檬酸钠溶液，保持沸腾5分钟。

优选的，用碳酸钾将胶体金溶液的pH值调整到pH7.8-pH8.3之间，并将降钙素原的抗体浓度控制在12μg/mL；并且，抗体标记完成后，在10秒之内加入1mg/mL的牛血清白蛋白进行封闭。

优选的，所述制备方法还在硝酸纤维素膜上进行降钙素原抗体包被，然后进行干燥，得到包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜。

优选的，所述包被所采用的包被液的组成成分为：pH6.8-8.2的PBS+0.1-2％的酪蛋白+0.01-0.5％的吐温20。

优选的，所述包被液的组成成分为：pH7.2的PBS+0.5％的酪蛋白+0.2％的吐温20。

本发明的又一技术方案如下：一种降钙素原的检测方法，其包括以下步骤：将待检测的降钙素原样本加入包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜中，然后滴加上述任一制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒进行标记。

本发明的又一技术方案如下：一种降钙素原的检测装置，其包括承载板，以及设置在所述承载板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜；其中，所述金标垫设置上述任一制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒。

采用上述方案，本发明提高胶体金颗粒的均一性和胶体金颗粒的偶联效率，从而提高试剂的灵敏度，具有很高的市场应用价值。

附图说明

图1为本发明所述制备方法的一个实施例的示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明是基于抗原与抗体能特异性结合的原理，在胶体金检测技术的基础上进行了一定的改进，从而提高检测的灵敏度和特异性的一项技术。如图1所示，本发明的一个实施例是，一种降钙素原检测材料的制备方法，其包括以下步骤：加热氯金酸溶液至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，制成胶体金颗粒；将降钙素原的抗体加入到胶体金颗粒；抗体标记完成后，加入牛血清白蛋白进行封闭；离心，弃去上清，得到沉淀物，采用冻干液复溶所述沉淀物，然后进行干燥，得到标记后的胶体金颗粒。优选的，还在硝酸纤维素膜上进行降钙素原抗体包被，然后进行干燥，得到包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜。

例如，氯金酸，购自sigma，纯度要求99.99％。按照质量体积比为万分之四的比例加入到双蒸水中，即每四克的氯金酸加入到10000ml的双蒸水中。搅拌均匀后备用。

例如，还原剂包括柠檬酸钠，其中，柠檬酸钠纯度要求为99.9％，按照质量体积比2％的比例配制成柠檬酸钠溶液，即每100ml水中加入2g柠檬酸钠，备用。

例如，取500mL氯金酸溶液，放在磁力加热搅拌器上加热。优选的，采用温控磁力搅拌器。需要说明的是，该步骤非常重要，直接关系到纳米胶体金的颗粒均一性和大小。液体沸腾前，对磁力搅拌器的转速无要求，不搅拌也可以；当液体开始沸腾时，调整搅拌器的搅拌速度，调整到每分钟100至400转；优选的，转速为每分钟110至150转；优选的，转速为每分钟120转。然后，待沸腾0.5至3分钟后加入柠檬酸钠溶液到氯金酸溶液中；优选的，待沸腾一分钟后加入所述2％的柠檬酸钠溶液18-24ml，例如，一次性倒入所述2％的柠檬酸钠溶液；优选的，倒入的速度要快，越快越好；例如，在3秒钟以内将柠檬酸钠溶液加入到氯金酸溶液中；优选的，柠檬酸钠溶液为21mL。然后，保持沸腾时间3-10分钟，优选的，保持沸腾时间五分钟。经实验测试，液体充分沸腾，适当的搅拌速度，以及适量的还原剂，都是保证胶体金颗粒均一性的关键因素。

烧制好的胶体金颗粒平衡至室温后，就可以开始标记工作。为了提高标记的效率，优选的，采用碳酸钾将胶体金溶液的PH值调整到PH7.2-PH8.9之间，较好的pH值为7.8-8.3，并将降钙素原的抗体浓度控制在5-20μg/mL；例如，降钙素原的抗体浓度为10-15μg/mL；优选的，降钙素原的抗体浓度为12μg/mL。例如，对于1mL的胶体金溶液，加入12μg降钙素原的抗体。又如，对于100mL的胶体金溶液，加入1.2mg降钙素原的抗体。

待抗体标记完成后，迅速加入0.5-5mg/mL牛血清白蛋白进行封闭。优选的，牛血清白蛋白浓度是1mg/mL。例如，在10秒钟以内加入所述牛血清白蛋白进行封闭；优选的，在5秒钟以内加入所述牛血清白蛋白进行封闭。例如，对于100mL的胶体金溶液，加入100mg牛血清白蛋白。

经实验测试，上面的几个步骤紧密配合，各个条件之间相互作用，使95％以上的抗体可以偶联到胶体金颗粒上，并使96％以上的胶体金颗粒上面结合有抗体。而牛血清白蛋白封闭后，保证了抗体与金颗粒结合的稳定性。并且，标记过程基本无损耗，500毫升的氯金酸溶液最终得到的偶联好的胶体金颗粒也是500毫升。

将偶联好的胶体金颗粒在离心机上4000-8000转每分钟离心5-15分钟，留沉淀，弃去上清。其沉淀用PH6.8-8.2的冻干液复溶。优选的，所述冻干液的组成成分为：20mM pH6.8-8.2的PBS+0.5-5％的BSA+0.01-0.5％的吐温20。优选的，所述冻干液的组成成分为：20mM pH8.0的PBS+2％的BSA+0.1％的吐温20。此冻干液不但能保证反应的灵敏度，而且会提高反应的特异性降低非特异反应。例如，胶体金复溶的体积为标记时胶体金体积的10％到80％；优选的，胶体金复溶的体积为标记时胶体金体积的15％。

然后用复溶好的胶体金颗粒均匀喷在玻璃纤维上，然后放到28-45℃的烤箱或者零下10-25℃的冻干机中干燥，干燥时间为烤箱中放置4-12小时，冻干机中1-4小时。

优选的，开始沸腾时，将搅拌器的搅拌速度调整到每分钟120转，待沸腾1分钟后，迅速加入柠檬酸钠溶液，保持沸腾5分钟。优选的，用碳酸钾将胶体金溶液的pH值调整到pH7.8-pH8.3之间，并将降钙素原的抗体浓度控制在12μg/mL；并且，抗体标记完成后，在10秒之内加入1mg/mL的牛血清白蛋白进行封闭。这样，提高了胶体金颗粒的均一性和胶体金颗粒的偶联效率，从而提高了试剂的灵敏度；并且，通过改进胶体金颗粒的冻干液配方，从而提高了灵敏度特异性。

优选的，所述制备方法还在硝酸纤维素膜上进行降钙素原抗体包被，然后进行干燥，得到包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜。优选的，所述包被所采用的包被液的组成成分为：pH6.8-8.2的PBS+0.1-2％的酪蛋白+0.01-0.5％的吐温20。优选的，所述包被液的组成成分为：pH7.2的PBS+0.5％的酪蛋白+0.2％的吐温20。例如，在硝酸纤维素膜上进行抗体包被时，降钙素原抗体的包被浓度为0.2-1.6mg/mL，优选的，降钙素原抗体的包被浓度为0.8-1.2mg/mL；优选的，每毫升的包被液中含有1mg的抗体，即最佳包被量1.0，包被完成后，烘干，例如在32-45℃的烤箱中烤2-6小时。此包被液的主要成份为PH6.8-8.2的PBS+0.1-2％的酪蛋白+0.01-0.5％的吐温20；优选的，包被液的主要成份为PBS+0.5％的酪蛋白+0.2％的吐温20。这样，通过改进包被液配方，提高了包被的效率和包被抗体的稳定性，正常情况下，包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜的稳定有效期约为18个月，有效期约为24个月。

本发明的又一实施例如下：一种降钙素原的检测方法，其包括以下步骤：将待检测的降钙素原样本加入包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜中，然后滴加上述任一实施例所述制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒进行标记。优选的，所述硝酸纤维素膜为上述任一实施例所述制备方法所制得的包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜。

这样，通过将降钙素原抗体包被在硝酸纤维素膜中央，滴加待检样本，若样本中存在待测降钙素原抗原，则在渗滤过程中与硝酸纤维素膜上的降钙素原抗体结合，然后滴加标记后的胶体金颗粒，加洗涤液洗涤后，阳性者即在硝酸纤维素膜中央呈红色斑点，即胶体金聚集。这样，可以迅速、高效、高灵敏度地检测降钙素原。

本发明的又一实施例如下：一种降钙素原的检测装置，其包括承载板，以及设置在所述承载板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜；其中，所述金标垫设置上述任一实施例所述制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒。优选的，所述硝酸纤维素膜为上述任一实施例所述制备方法所制得的包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜。例如，承载板为PVC板，又如，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸按照一定顺序贴在PVC板上面；优选的，贴好后，切条装卡，然后装袋封口。这样，有利于制备适用于包装和销售使用的市场化产品。

下面采用所述制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒、以及采用所述制备方法所制得的包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜，采用降钙素原的检测方法对10个样本进行了检测，结果如下表一所示(单位：ng/ml)。

表一

由表一可见，降钙素原的检测灵敏度可以达到0.05ng/mL，相对于市场上主流的灵敏度为0.5ng/mL的产品，检测灵敏度提升了一个数量级，即大大提高了降钙素原检测的灵敏度。

进一步地，本发明的实施例还包括，上述各实施例的各技术特征，相互组合形成的降钙素原的检测方法与检测装置、以及一种降钙素原检测材料的制备方法。上述制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒以及包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜，有效期长达18个月，经久耐用，灵敏度高。

需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种降钙素原检测材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

加热氯金酸溶液至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，制成胶体金颗粒；

将降钙素原的抗体加入到胶体金颗粒；

抗体标记完成后，加入牛血清白蛋白进行封闭；

离心，弃去上清，得到沉淀物，采用冻干液复溶所述沉淀物，然后进行干燥，得到标记后的胶体金颗粒。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述冻干液的组成成分为：20mM pH6.8-8.2的PBS+0.5-5％的BSA+0.01-0.5％的吐温20。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述冻干液的组成成分为：20mM pH8.0的PBS+2％的BSA+0.1％的吐温20。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将500mL质量体积比为0.04％的氯金酸溶液在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，开始沸腾时，将搅拌器的搅拌速度调整到每分钟100至400转，待沸腾0.5至3分钟后，迅速加入18至24mL质量比为2％的柠檬酸钠溶液，保持沸腾3至10分钟，制成胶体金颗粒；

将胶体金溶液的PH值调整到pH7.2至8.9之间，并将降钙素原的抗体浓度控制在5至20μg/mL，将降钙素原的抗体加入到胶体金颗粒；

抗体标记完成后，迅速加入0.5至5mg/mL的牛血清白蛋白进行封闭；

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，开始沸腾时，将搅拌器的搅拌速度调整到每分钟120转，待沸腾1分钟后，迅速加入柠檬酸钠溶液，保持沸腾5分钟。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，用碳酸钾将胶体金溶液的pH值调整到pH7.8-pH8.3之间，并将降钙素原的抗体浓度控制在12μg/mL；并且，抗体标记完成后，在10秒之内加入1mg/mL的牛血清白蛋白进行封闭。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，还在硝酸纤维素膜上进行降钙素原抗体包被，然后进行干燥，得到包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述包被所采用的包被液的组成成分为：pH6.8-8.2的PBS+0.1-2％的酪蛋白+0.01-0.5％的吐温20。

9.一种降钙素原的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将待检测的降钙素原样本加入包被有降钙素原抗体的硝酸纤维素膜中，然后滴加如权利要求1至8任一所述制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒进行标记。

10.一种降钙素原的检测装置，其特征在于，包括承载板，以及设置在所述承载板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜；

其中，所述金标垫设置如权利要求1至8任一所述制备方法所制得的标记后的胶体金颗粒。