CN107490683A

CN107490683A - 一种唾液降钙素原胶体金检测方法

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Publication number: CN107490683A
Application number: CN201610404111.8A
Authority: CN
Inventors: 李亚星; 刘凤鸣; 刘冰
Original assignee: CHANGZHOU BIOWIN BIOPHARM Co Ltd
Current assignee: CHANGZHOU BIOWIN BIOPHARM Co Ltd
Priority date: 2016-06-09
Filing date: 2016-06-09
Publication date: 2017-12-19

Abstract

本发明涉及免疫检测分析的技术领域，尤其是一种唾液降钙素原胶体金检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、胶体金试剂和检测器。唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；胶体金试剂为含有所述胶体金物质的液相和/或固相材料；检测器为胶体金检测器。以人体唾液为检测样本，可有效监测唾液中降钙素原，特异性强，重复性好，灵敏度高，操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

Description

一种唾液降钙素原胶体金检测方法

技术领域

本发明涉及免疫检测分析技术领域，尤其是一种唾液降钙素原胶体金检测方法。

背景技术

降钙素原(PCT)是一种含116个氨基酸的无激素活性糖蛋白，分子量为13KD。其半衰期为25～30h。在生理情况下由甲状腺-C细胞产生，含量极少，在健康人群的血清或脑脊液中几乎不能被检出。据文献介绍, 在细菌、真菌、寄生虫等感染性疾病并有全身和中枢神经系统性炎症反应时，病菌的内毒素可促使甲状腺-C细胞、肝脏巨噬细胞和单核细胞、肺和肠道组织的淋巴细胞以及神经内分泌细胞等甲状腺以外的组织大量产生PCT，而导致其血清和脑脊液中的含量升高或持续性升高，且与感染的程度、进展或消退呈正相关。在病毒感染、慢性非生物性炎症、癌性发热、药热、自身免疫性疾病以及手术创伤患者的PCT水平却不增高或仅有轻度短暂性增高。其敏感度和特异性远高于传统的C-反应蛋白和外周血白细胞计数的检测，因而具有重要的临床诊断和鉴别诊断价值。

目前检测PCT常用的实验室方法有放射免疫学分析法（RIA）、化学发光免疫分析法(CLIA)、胶体金比色法（GICA）和酶联免疫法（ELISA），众多血液样本PCT检测技术与产品已广泛应用于临床，这些产品取得了比较满意的准确率。但采用唾液进行PCT快速检测的产品还鲜有面市。

其实，唾液与广泛应用于临床检测的血液(包括全血、血清与血浆)均是人体体液的一部分，都属于细胞外液，其大多数成分类似，尤其是临床检测中具有重大意义目标物质的出现时机具有一致性，只是含量存在一定差异。因而唾液被认为是人体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。Challacombe的研究结果证实唾液中IgG可及时反映体内IgG的存在；Parry通过RIA及ELISA对唾液的特异性抗体水平进行研究表明：唾液中抗体含量虽远低于血清，IgA、IgG与IgM分别大约为血清含量的1/10、1/800、1/400，但已足够用于某些免疫学诊断。另外在临床中，于唾液中寻找诊断标志物是最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者易于掌握等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中之不足，提供一种特异性强，重复性好，灵敏度高，操作简单，不需特殊仪器设备的唾液降钙素原胶体金检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种唾液降钙素原胶体金检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、胶体金试剂和检测器。所述唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；所述抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；所述胶体金试剂为含有所述胶体金的液相和/或固相材料；所述检测器为胶体金检测器。

进一步的，所述的检测方法包括如下步骤：

1) 制备降钙素原的单克隆抗体；

2) 硝酸纤维膜的制备：用划膜液将与羊抗人降钙素原多抗稀释为浓度为0.2～1.0mg/ml、将羊抗鼠IgG抗体稀释为浓度为0.2～1.0mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和质控线，且于37℃中干燥4小时，备用；所述划膜液由终浓度为0.01胶体金试剂0.2mol/lTris，1％胶体金试剂3％海藻糖或1％胶体金试剂3％蔗糖或0.1％胶体金试剂1％EDTA，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.2～7.8；

3) 金标垫的制备：降钙素原的单克隆抗体标记胶体金的pH值为8.0～8.5，以2～12μg/ml胶体金加入降钙素原的单克隆抗体，摇匀后静置，按质量比0.5‰～1‰，加入10％的脱脂奶粉，摇匀、静置，离心，取沉淀，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％复溶，将复溶后的胶体金标记物喷涂于玻璃纤维膜上，37℃，烘干4h，得到金标垫；所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/LTris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％～3％海藻糖或1％～5％蔗糖或0.1％～1％EDTA，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～1％柠檬酸钠，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％水解干络素，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氯化钾或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0；

4) 在反应支持物上依次相互搭接粘贴上样垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水垫；

5）所述步骤(4)中把上样垫处理液涂于玻璃纤维上，37℃，烘干4h，室温密封保存；

6）依次将上样垫、胶体金标记的降钙素原单克隆抗体玻璃纤维膜、包被有羊抗人降钙素原多抗和羊抗鼠IgG多克隆抗体的反应膜、吸水垫在反应支持物上进行组装；用切条机按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状，待检验合格后铝箔袋封存。

本发明的有益效果是：本发明以人体唾液为检测样本，可有效监测唾液中降钙素原，特异性强，重复性好，灵敏度高，操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

具体实施方式

实施例1.降钙素原胶体金检测试纸条的制备。

1、胶体金的制备：准确量取100mL的纯化水，放入圆底烧瓶中，加热、搅拌至沸腾。将2mL 1％氯金酸溶液加入到沸水中，继续加热、搅拌。当溶液再次沸腾时，准确量取2mL1.0％柠檬酸三钠溶液快速加入到溶液中，继续煮沸。仔细观察溶液颜色，当溶液由黄色变成紫黑色，最后变成酒红色稳定后，开始计时，继续加热10min即可。待溶液温度恢复至室温后，停止搅拌，用纯化水恢复体积至100mL，放置在4℃条件下避光保存备用。

2、降钙素原单克隆抗体金标垫的制备

所需原料：降钙素原单克隆抗体；上述步骤1制得的胶体金溶液；1.0％K2CO3；10％脱脂奶粉；复溶液；玻璃纤维；

复溶液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.01mol/L Tris，2％BSA，2％海藻糖，2％曲拉通X-100，0.2％β-环糊精，0.5％柠檬酸钠，0.5％PEG20000，0.2％水解干络素，0.1％氯化钠，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4；

具体配置方法为：取100ml纯化水，依次加入0.001mol的Tris、2g BSA、2g海藻糖、0.2g β-环糊精、0.5g柠檬酸钠、0.5gPEG20000、0.2g解干络素，0.1g氯化钠，常温搅拌溶解后按体积比加入2ml曲拉通X-100，均匀搅拌30min，后加入0.05g叠氮钠均匀搅拌10min，用HCl调节pH值为7.4，4℃条件下避光保存备用；

胶体金降钙素原抗体标记过程降钙素原抗体标记的过程：取2mL制备好的胶体金溶液，用1.0％K2CO3调pH值至8.2后，移液器准确吸取5mg/mL降钙素原单克隆抗体0.8μL，缓慢加到胶体金溶液中，摇匀后静置30min。然后取10μL的10％脱脂奶粉(终浓度质量比0.5‰)逐滴加入溶液中，摇匀后静置30min。然后放入离心机，在12000rpm温度为4℃的条件下离心30min。完毕后，吸取上清液，弃掉，沉淀用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的60％复溶，混匀；

胶体金标记物固相化把1.25ml的复溶好的胶体金标记物喷涂于0.6cm×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干4h。铝箔袋密封，室温保存备用；

经实验确定，降钙素原单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8.2，胶体金和抗体的配比为8μg/ml胶体金。标记胶体金经复溶液处理后，按每平方厘米70μl的量，取胶体金抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上。

3、包被硝酸纤维素膜制备反应膜

将羊抗人降钙素原多克隆抗体(用于包被检测线T)、羊抗鼠IgG多克隆抗体(用于包被质控线C)用划膜液分别稀释至0.4mg/mL，然后分别加入到自动划膜仪的T杯和C杯中；调试自动划膜仪，喷液量设定为1.0μL/cm，导轨速度8.0cm/sec，喷嘴1与2间隔6mm。调试完成后，划膜包被，形成检测线(T线)和质控线(C线)，37℃，烘干4小时。待检验合格后铝箔袋密封，室温存放备用；

划膜液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.1mol/lTris，2％海藻糖、0.4％EDTA，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。

4、上样垫的制作

上样垫处理液配制方法为按以下组分终浓度进行配制：0.03mol/lTris，2％曲拉通X-100，0.5％柠檬酸钠，0.2％柠檬酸，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.15％β-环糊精，0.1％明胶，0.15％α淀粉酶，0.2％氯化钠，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为8.0；

具体配置方法为：取100ml纯化水，边加热边加入0.1g明胶后搅拌溶解，溶解后恢复体积和室温，依次加入0.003mol的Tris、0.5g柠檬酸钠、0.2g柠檬酸、0.1g的聚乙烯吡咯烷酮、0.15g β-环糊精、0.15gα淀粉酶、0.2g氯化钠，常温搅拌溶解后按体积比加入2ml曲拉通X-100，均匀搅拌30min，后加入0.05g叠氮钠均匀搅拌10min，用HCl调节pH值为8.0，2～8℃条件下避光保存备用；

取上述上样垫处理液45ml，喷涂于25×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干4h，得到上样垫。铝箔袋密封，室温保存备用。

5、降钙素原胶体金检测试纸条组成

反应支持物为6.5cm×0.4cm PCV板；

上样垫为2cm×0.4cm的玻璃纤维；

0.4cm×0.4cm的金标垫含有胶体金标记的降钙素原单抗玻璃纤维膜；

1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被羊抗人降钙素原多克隆抗体，羊抗鼠IgG，二者间隔6mm；

吸水垫为2.7cm×0.4cm的吸水滤纸；

上样垫为加样区，反应膜为反应区，即形成了降钙素原检测试纸条(胶体金法)。

实施例2.唾液降钙素原胶体金检测试纸条的检测方式

将待检唾液标本滴加到实施例1制得的试纸条加样区处或唾液收集装置中，样品液通过毛细作用沿膜前移，待反应20min后，用胶体金定量检测仪判读检测线和质控线，以得出结果。

实施例3.试纸条性能评估试验

1、标准曲线的制作

取降钙素原标准品用正常人唾液配制成如下浓度的样品：0.5、1、2、5、10ng/mL，再分别测定其降钙素原浓度，以配成值为X，胶体金定量检测信号值为Y绘制标准曲线，经统计拟合标准曲线的表达式列出回归方程为：Y=0.0693X+0.113，相关系数为R²= 0.988（见附图1）。降钙素原测定范围为0.5～10ng/ml

2、准确性试验

取同一患者唾液标本，用同一批次的试纸条重复检测3次，计算出相对偏差B值为10.9%，符合产品设计要求；

3、重复性试验

取同一患者唾液标本，用同一批次的试纸条同时检测20次，计算出变异系数CV值为3.15%，符合产品设计要求。

本发明通过优化胶体金标抗体复溶液、划膜液配方，优化标记过程和包被过程的工艺参数，使唾液检测试纸条能够满足产品设计的性能指标要求；通过优化上样垫处理液配方，解决了唾液样本粘稠、含有多种干扰物质等阻碍因素。在本发明提供的复溶液配方中，与传统配方相比增加了β-环糊精、海藻糖和水解干络素等成分；在划膜液配方中增加了海藻糖成分；整个试纸条反应系统中选用Tris-HCl缓冲系统替代了传统方法使用的磷酸缓冲液系统；在标记过程中，选用脱脂奶粉替代BSA作为稳定剂，能对降钙素原单克隆抗体和氯金酸溶液的结合过程起到更好的保护。

本发明提供的检测试纸条检测，以人体唾液为检测样本，可有效监测唾液中降钙素原，特异性强，重复性好，灵敏度高，该试纸条操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种唾液降钙素原胶体金检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、胶体金试剂和检测器，具有如下特征：

1）所述唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；

2）所述抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；

3）所述胶体金试剂为含有所述胶体金的液相和/或固相材料；

4）所述检测器为胶体金检测器。

2.根据权利要求1所述的一种唾液降钙素原胶体金检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

1) 制备降钙素原的单克隆抗体；

2) 硝酸纤维膜的制备：用划膜液将与羊抗人降钙素原多抗稀释为浓度为0.2～1.0mg/ml、将羊抗鼠IgG抗体稀释为浓度为0.2～1.0mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和质控线，且于37℃中干燥4小时，备用；所述划膜液由终浓度为0.01～0.2mol/lTris，1％～3％海藻糖或1％～3％蔗糖或0.1％～1％EDTA，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.2～7.8；

3）金标垫的制备：降钙素原的单克隆抗体标记胶体金的pH值为8.0～8.5，以2～12μg/ml胶体金加入降钙素原的单克隆抗体，摇匀后静置，按质量比0.5‰～1‰，加入10％的脱脂奶粉，摇匀、静置，离心，取沉淀，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％复溶，将复溶后的胶体金标记物喷涂于玻璃纤维膜上，37℃，烘干4h，得到金标垫；所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/LTris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％～3％海藻糖或1％～5％蔗糖或0.1％～1％EDTA，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～1％柠檬酸钠，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％水解干络素，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氯化钾或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0；

3.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原胶体金检测方法，其特征在于：所述的玻璃纤维膜中胶体金标记的降钙素原的单克隆抗体的pH值为8.0～8.5，胶体金和降钙素原单克隆抗体的配比为2～12μg/ml胶体金。

4.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原胶体金检测方法，其特征在于：所述的金标垫是将胶体金标记的降钙素原单克隆抗体加入脱脂奶粉，离心后取沉淀，沉淀用复溶液复溶后喷涂于玻璃纤维膜上制得，所述脱脂奶粉加入量为按质量比0.5‰～1‰加入10％的脱脂奶粉。

5.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原胶体金检测方法，其特征在于：所述的复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/LTris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％～3％海藻糖或1％～5％蔗糖或0.1％～1％EDTA，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～1％柠檬酸钠，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％水解干络素，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氯化钾或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0。

6.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原胶体金检测装置及制备方法，其特征在于：所述的抗降钙素原多克隆抗体的包被浓度为0.2～1.0mg/ml，所述羊抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.2～1.0mg/ml。

7.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原胶体金检测方法，其特征在于：所述的包被浓度是由划膜液稀释获得的，划膜液是终浓度为0.01～0.2mol/1Tris，1％～3％海藻糖或1％～3％蔗糖或0.1％～1％EDTA，0.05％～0.1％叠氮钠；HCl调节pH值为7.2～7.8。

8.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原胶体金检测方法，其特征在于：所述的上样垫含有上样垫处理液，处理液配方为：0.01～0.2mol/LTris，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～2％柠檬酸钠，0.1％～2％柠檬酸，0.05％～0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％明胶，0.1％～2％α淀粉酶，0.1％～1％氯化钠或者0.1％～1％氯化钾或0.1％～1％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠，所述浓度均为配置后的终浓度；HCl调节pH值为8.0～9.0。