CN103348247B

CN103348247B - 胰脏癌的检测方法

Info

Publication number: CN103348247B
Application number: CN201180005002.4A
Authority: CN
Inventors: 小林夕香; 草间健; 龟井麻直
Original assignee: J Oil Mills Inc
Current assignee: J Oil Mills Inc
Priority date: 2010-01-21
Filing date: 2011-01-17
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2031-01-17
Also published as: US20120244563A1; RU2013105265A; ES2572127T3; KR20120130795A; US8481275B2; CN103348247A; EP2498094A1; WO2011089988A1; EP2498094A4; RU2533219C2; KR101298579B1; JP4900983B2; EP2498094B1; JPWO2011089988A1

Abstract

为了高精度检测病态触珠蛋白，本发明提供一种利用有强亲和力和对海藻糖有高特异性的凝集素的检测方法。本发明的检测胰脏癌的方法，其特征是将一种海藻糖α1→6特异性凝集素作用于包含在取自活体的样品中的病变触珠蛋白，所述凝集素(1)提取自担子菌类，(2)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其分子量为4000-40000，(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和力，其结合常数(在25℃时)为1.0×10⁴M^-1或更大。

Description

胰脏癌的检测方法

技术领域

本发明涉及胰脏癌的检测方法，更具体地，涉及一种以病变触珠蛋白为肿瘤标志物来检测胰脏癌的方法。

背景技术

由于胰脏位于身体中心深处，胰脏发生癌变是难以检测的。用于诊断胰脏癌的肿瘤标志物有CEA(标准值：5.0ng/mL)和CA 19-9(标准值：37U/mL)等。但是，假阳性也会被包括在来至这些肿瘤标志物的结果内，因此单独使用肿瘤标志物可能得不到可靠的结果。为了确诊胰脏癌，还必须进行昂贵而彻底的检查，例如：电子计算机断层扫描(CT)、内镜逆行胰胆管造影(ERCP)、超声内镜(EUS)和血管造影术等等。其中，EPCR和EUS是侵入性的，可能给病人加重负担。

最近的报道声明随着胰脏癌的发展，海藻糖附于一种糖蛋白即触珠蛋白的糖链上(非专利文献1和2，以及专利文献1)上。根据非专利文献1，这种病变触珠蛋白随着胰脏癌的进展而增多，并且它在胰脏癌的肿瘤部位被手术摘除后会消失。

人触珠蛋白是一种包括406个氨基酸的糖蛋白，在它的β链(分子量：40000)上包含四个N链接的糖基化位点。人触珠蛋白在健康成年人的血清中含量丰富，浓度在0.7-1.7mg/mL之间。用病变触珠蛋白作为检测胰脏癌包括早期胰脏癌的肿瘤标志物可以通过精确检测其它触珠蛋白分子中的病变触珠蛋白来达到。

可以想象结合凝集素的糖可以用于获得与癌变有关的细胞表面的糖链的结构的变化和转移的信息。通常地，橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)、小扁豆外源凝集素(LCA)，百脉根凝集素(Lotus)、荆豆凝集素(UEA-I)等等是已知的测定海藻糖的凝集素。但是，使用这些传统凝集素的检测方法经常不能在健康者和胰脏癌病人中显示出显著的差异。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利申请，公开号：2009-168470

非专利文献

非专利文献1：糖基化触珠蛋白是一种新的胰脏癌的标志物：寡糖结构的详细分析和一种可能的糖基化机制(“Fucosylated haptoglobin is a novel marker forpancreatic cancer：a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possiblemechanism for fucosylation”)。Okuyama N，et.al.，Int J Cancer.2006 Jun 1；118(11)：2803-8.

非专利文献2：胰脏癌病人血清中触珠蛋白上N-多糖的特定位点分析：一种肿瘤标志物开发的新进展(“Site-specific analysis of N-glycans on haptoglobinin sera of patients with pancreatic cancer：a novel approach for the development oftumor markers”)。Nakano M，et.al.，Int J Cancer.2008 May 15；122(10)：2301-9

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种精确检测病变触珠蛋白的方法，其中，使用一种特异性结合病变触珠蛋白的凝集素。

问题的解决方案

经过广泛的研究，本发明者们发现这个目标可以通过以下发明实现。本发明提供了一种胰脏癌的检测方法，其中一种海藻糖α1→6特异性凝集素会作用于取自活体的样品中的病变触珠蛋白，所述凝集素：

(1)提取自担子菌，

(2)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(后文称作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)确定其分子量为4000-40000，并且

(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和性，其结合常数(在25℃时)为1.0×10⁴M^-1或更大。

此外，所述海藻糖α1→6特异性凝集素优选(4)不实质性结合不含海藻糖α1→6糖链的高甘露糖链和/或糖脂类。

所述担子菌类优选球盖茹科、口蘑科、鹅膏菌科或多孔菌类。更具体的，担子菌是金囊环锈伞菌、翘鳞伞、金毛环锈伞、皱环球盖菇、砖红韧伞、花脸香蘑或毒蝇伞。

所述样品是例如采自人体的血清或血浆。

具体地，本发明的检测胰脏癌的方法优选通过使用所述的海藻糖α1→6特异性凝集素和抗触珠蛋白抗体的分析测定病变触珠蛋白。

所述海藻糖α1→6特异性凝集素优选是被标记的。

进一步地，提供一种判别胰脏癌和胰脏炎的方法，其中，海藻糖α1→6特异性凝集素作用于病变触珠蛋白，所述病变触珠蛋白包含在从其血清中含有30U/mL以上浓度的肿瘤标志物CA19-9的活体中取来的样品中。血清中的肿瘤标志物CA19-9的量进一步优选高于32U/mL，更进一步优选高于35U/mL。于是，健康者、胰脏癌病人和胰脏炎病人可以被清楚地区分。

本发明还提供一种测定胰脏癌和/或胰脏炎的诊断试剂或试剂盒，包含海藻糖α1→6特异性凝集素，此凝集素：

(1)提取自担子菌类，

(2)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其分子量为4000-40000，并且

(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和性，其结合常数大于1.0×10⁴M^-1(在25℃时)。优选地，该试剂盒包括抗触珠蛋白抗体和/或抗CA19-9抗体。

发明的有益效果

本发明的检测胰脏癌的方法比传统的海藻糖特异性凝集素能更精确地检测有望作为胰脏癌的肿瘤标志物的病变触珠蛋白。其结果是之前难以发现的胰脏癌会更容易地被检测出来。

具体地，本发明的方法在使用血清用于癌症筛检这一点上更为方便。进一步地，根据使用本发明中的利用海藻糖α1→6特异性凝集素和抗触珠蛋白抗体的分析法，使快速又简单地检测胰脏癌成为可能。胰脏癌和胰脏炎通过单独使用传统的肿瘤标志物CA19-9很难区分。另一方面，在本发明中的方法，通过联合使用海藻糖α1→6特异性凝集素和CA19-9可以简单地区分胰脏癌和胰脏炎。

附图说明

图1是准备例1中，PTL的离子交换色谱洗脱曲线。

图2是准备例1中，PTL的亲和色谱洗脱曲线。

图3是准备例2中，SRL的疏水色谱洗脱曲线。

图4是准备例2中，SRL的反相色谱洗脱曲线。

图5示出使取至人血清的触珠蛋白(血清触珠蛋白)和取至胰脏癌细胞上清液的触珠蛋白(癌细胞触珠蛋白)分别与根据本发明的PTL结合时的反应值(吸光度)。

图6示出与图5中同样的，使血清触珠蛋白和癌细胞触珠蛋白分别比较例的LCA结合时的反应值。

图7示出与图5中同样的，使血清触珠蛋白和癌细胞触珠蛋白分别比较例的AAL结合时的反应值。

图8示出取至健康个体血清中的触珠蛋白和取至胰脏癌病人血清中的触珠蛋白与根据本发明的PTL的结合实验中的反应值(吸光度)。

图9以比较例的AAL替代图8中的PTL的结合实验中的反应值。

图10示出通过利用小鼠单克隆抗CA19-9抗体和兔多克隆抗CA19-9抗体的夹心法分析，得到的健康个体、胰脏癌病人和胰脏炎病人血清中CA19-9的定量结果。

图11示出抗触珠蛋白抗体(抗-HP抗体)的结合实验中计算出的血清中的触珠蛋白相对量。

图12示出图8中PTL的反应值除以图11中相应的触珠蛋白相对量的计算所得值。

图13示出图9中AAL的反应值除以图11中相应的触珠蛋白相对量的计算所得值。

具体实施方式

本发明中检测胰脏癌方法的一个具体实施例详细描述如下。本发明的方法的特征在于：是以有以下物理性质

(1)取自担子菌类，

(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和力，其结合常数大于1.0×10⁴M^-1(在25℃时)

的海藻糖α1→6特异性凝集素作用于取自活体的样品中的病变触珠蛋白，从而检测病变触珠蛋白。

本发明的检测方法需要使用一种凝集素，此凝集素特异性识别用以下化学式表示的海藻糖α1→6连接。

[公式1]

其中，Man代表甘露醇，GlcNAc代表N-乙酰基葡萄糖酰胺以及Fuc代表海藻糖。

使用本发明者发现的这一新的海藻糖α1→6特异性凝集素，胰脏癌可以被简单地检测。该凝集素的物理和化学性质具体描述如下。

(1)凝集素的起源

海藻糖α1→6特异性凝集素的来源可以是担子菌类。在担子菌类中，凝集素优选属于球盖茹科、口蘑科、多孔菌科和鹅膏菌科。球盖茹科例如金囊环锈伞、皱环球盖菇、砖红韧伞、翘鳞伞、金毛环锈伞和多脂鳞伞等。口蘑科包括花脸香蘑等。多孔菌科包括勺形囊孔菌和环纹小孔菌等。鹅膏菌科包括毒蝇伞等。基于凝集素对海藻糖α1→6糖链的特异性识别和凝集素的净化效率，在这些担子菌类中，特别优选球盖茹科、口蘑科或鹅膏菌科，更优选金囊环锈伞、翘鳞伞、金毛环绣伞、皱环球盖菇、砖红韧伞、花脸香蘑和毒蝇伞。

(2)凝集素的分子量

所述海藻糖α1→6特异性凝集素的用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的分子量为4000-40000，优选4000-20000。在这里，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的分子量是以例如，根据Laemmi方法(Nature，227卷：第680页，1976)为基准的。

(3)凝集素的结合常数

所述海藻糖α1→6特异性凝集素对海藻糖α1→6糖链的结合常数为1.0×10⁴M^-1或更大，优选1.0×10⁵M^-1或更大，更优选1.0×10⁶M^-1或更大。既是，它显著地高于之前已知与海藻糖α1→6有亲和力的AAL、曲霉菌凝集素(AOL)、LCA、水仙花凝集素(NPA)和豌豆凝集素(PSA)的结合常数。这就意味着相比于传统的凝集素，所述海藻糖α1→6特异性凝集素有极高的选择性地与海藻糖α1→6糖链结合。

上述结合常数可以被测定，例如，通过前文所述亲和色谱(FAC)法。此FAC法在例如PCT/JP2009/003346中被详细地描述，PCT/JP2009/003346通过引用被包含在本发明中。

海藻糖α1→6糖链在非还原端可以含有唾液酸。传统的海藻糖α1→6特异性凝集素(例如LCA、NPA和PSA)对非还原端含有唾液酸的海藻糖α1→6糖链显示出较低的亲和性。另一方面，本发明所述的海藻糖α1→6特异性凝集素优于传统的凝集素，对此种糖链仍有较高的亲和性。

(4)凝集素的糖结合特异性

所述海藻糖α1→6特异性凝集素优选不实质地与不含海藻糖α1→6糖链的高甘露糖链和/或醣脂类结合。这样，所述的海藻糖α1→6特异性凝集提供有更高结合特异性。在此使用的“不实质地结合”的意思是指结合常数是1.0×10³M^-1或更低，优选1.0×10²M^-1或更低，特别优选为0。

(5)凝集素对支链的结合

所述海藻糖α1→6特异性凝集素优选对海藻糖α1→6N结合型的单、双、三和/或四根分支糖链有亲和性，其结合常数为1.0×10⁴M^-1或更大(在25℃时)，进一步优选结合常数为1.0×10⁵M^-1或更大。

(6)凝集素的氨基酸序列

海藻糖α1→6特异性凝集素具有表1的序列号1所示的共通的氨基酸结构。序列号1中4、5、6和7位的Xaa分别代表Asp/Asn/Glu/Thr、Thr/Ser/Ala、Tyr/Phe和Gln/Lys/Glu，其中斜线符号意思是“或”。

可以被本发明方法使用的海藻糖α1→6特异性凝集素具体实例如序列号2-6中所示。序列号2所示的凝集素(PTL)是一种新的分子量为4500的凝集素，可以从金囊环锈伞中提取所得。序列号2中第10和17位的Xaa可以是任何氨基酸残基，同时它们优选Cys。在第20、23、27、33、35和39位的Xaa分别是Tyr/Ser、Phe/Tyr、Arg/Lys/Asn、Asp/Gly/Ser、Asn/Ala和Thr/Gln。

序列号3所示的凝集素是一种新的分子量为4500的从皱环球盖菇中提取而得的凝集素(SRL)。序列号3中第10和17位的Xaa可以是任何氨基酸残基，同时它们优选为Cys。在第4、7、9、13、20、27、29、33、34和39位的Xaa分别是Pro/Gly、Glu/Lys、Val/Asp、Asn/Asp/Glu、His/Ser、Lys/His、Val/Ile、Gly/Asn/Ser、Ala/Thr和Arg/Thr。

序列号4所示的凝集素是一种新的分子量为4500的从花脸香蘑中提取而得的凝集素(LSL)。序列号4中第10和17位的Xaa可以是任何氨基酸残基，同时它们优选Cys。第1、4、7、8、9、13、16、20、22、25、27、31和34位的Xaa分别是Ala/Gln、Pro/Lys、Ala/Ser、Met/Ile/Val、Tyr/Thr、Asp/Asn、Lys/Glu、Ala/Asn、Val/Asp/Asn、Asp/Asn、Arg/His/Asn、Gln/Arg和Thr/Val。

序列号5所示的凝集素是一种新的从砖红韧伞中提取而得的凝集素(NSL)。序列号5中第10和17位的Xaa可以是任何氨基酸残基，同时它们优选Cys。第13、14和16位的Xaa分别是Asp/Thr、Ser/Ala和Gln/Lys。

序列号6所示的凝集素也是一种新的分子量为4500的从砖红韧伞中提取而得的凝集素(NSL)。序列号6是将一个Asn插入序列号5的肽链中而得到的一个变体。因此，序列号6中第10和18位的Xaa可以是任何氨基酸残基，同时它们优选Cys。第14、15和17位的Xaa分别是Asp/Thr、Ser/Ala和Gln/Lys。

海藻糖α1→6特异性凝集素通常是以序列号2-6中所示的凝集素为亚基，包括2-10个，优选2-4个结合在一起的序列号2-6中所示的凝集素。

表1

海藻糖α1→6特异性凝集素可以是(a)一个包含任一一个序列号2-5中呈现的氨基酸序列的蛋白或肽链，也可以是(b)任一一个序列号2-5中呈现的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被删除、插入或替换的序列号2-5中任一一个所示的氨基酸序列，此外，功能上等同于包含任一序列号2-5所示氨基酸序列的蛋白质或肽链。此处，“功能上等同于”意思是此蛋白质或肽链对海藻糖α1→6糖链有亲和性，其结合常数为1.0×10⁴M^-1或更大，优选1.0×10⁵M^-1或更大，进一步优选1.0×10⁶M^-1或更大。(b)中一个变体的实例是如序列6所示的蛋白质或肽链。

海藻糖α1→6特异性凝集素优选PTL，SRL，NSL，LSL和毒蝇伞凝集素(AML)，并且进一步优选PTL和SRL。PTL和SRL是最适合在本发明区别方法中应用的海藻糖α1→6特异性凝集素，因为它们既不与除海藻糖α1→6之外的其它海藻糖结合也不与不含海藻糖的高甘露糖链结合，这一点上显示出与传统海藻糖α1→6亲和凝集素不同的性能。

海藻糖α1→6特异性凝集素可以使用已知的提取、分离、纯化等方法或将它们适当的结合从担子菌类中分离。例如，它包括一个用水介质作为萃取溶剂从担子菌中获得水介质萃取物的步骤。通过萃取，一种凝集素可以被得到，通过SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法测量此凝集素的分子量为4000-40000，优选4000-20000，并对海藻糖α1→6糖链有亲和性，25℃时其结合常数为1.0×10⁴M^-1或更大，优选1.0×10⁵M^-1或更大，进一步优选1.0×10⁶M^-1或更大。

所述担子菌类优选选自至少球盖茹科、口蘑科、多孔菌科和鹅膏菌科中的一种。具体优选属于球盖菇科的例如金囊环锈伞、翘鳞伞(Pholiota squarrosa(Fr.)Kummer)、多脂鳞伞(Pholiota adiposa(Fr.)Kummer)、供应滑子菇(Pholiotanameko(T.Ito)S.Ito&Imai)、大球盖菇(Stropharia rugosoannulata Farlow in Murr.)和砖红韧伞(Naematoloma sublateritium(Fr.)Karst or Hypholoma sublateritium(Fr.)Quel)，口蘑科的例如花脸香蘑(Lepista sordida(Schum.：Fr.)Sing.)，多孔菌科的例如勺形囊孔菌和环纹小孔菌，和鹅膏菌科的例如毒蝇伞。这些担子菌的使用部位优选子实体。

只要水介质可以和担子菌类的子实体接触，对从担子菌类的子实体和水介质中获得水溶性萃取物的方法没有特别的限制。考虑到萃取率，优选粉碎担子菌类的子实体并在水介质中形成悬浮液的方法。此外，粉碎的方法诸如包括使用混合器、高速搅拌器等传统的粉碎方法。

所述水介质包括诸如缓冲剂、与水混合的有机溶剂和水或缓冲剂的混合物。优选地，它是缓冲剂或者缓冲剂和有机溶剂的混合物。

任何已知的缓冲剂可以用作所述缓冲剂，没有特别的限制。其中，优选在PH 3-10的范围内具有缓冲能力的缓冲溶液，进一步优选在PH 6-8的范围内具有缓冲能力的缓冲溶液。具体地，它们包括磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸缓冲剂和氨丁三醇缓冲剂。考虑到萃取率，特别优选磷酸盐缓冲剂。

所述缓冲溶液中盐的浓度，没有任何特别的限制，考虑到萃取率和缓冲能力，优选1-100mM，进一步优选5-20mM。

所述缓冲溶液可以进一步含有盐。例如，将氯化钠另外加入到磷酸盐缓冲剂中的磷酸盐缓冲盐水等等，是优选作为水介质的。

任何与水互溶得到的有机溶液可用作此处的有机溶剂，没有任何特别的限制。具体的，优选丙酮、甲醇、乙醇、2-丙醇和乙腈。在混合一种有机溶剂和水或缓冲剂的情况中，有机溶剂的含量优选质量百分数为10-40％。

优选地，所述萃取步骤进一步包含从水介质和担子菌类的子实体的混合物中移除对水介质不溶性物质的步骤。移除不溶性物质的方法包括例如过滤和离心分离等方法，但是考虑到移除效率优选离心分离法。

具体地，所述萃取步骤优选为在磷酸盐缓冲盐水中粉碎担子菌类的子实体，通过离心分离移除不溶性物质以获得水介质萃取物的步骤。

对于所述的制造海藻糖α1→6特异性凝集素的方法，使用以下任一纯化方法可以得到更高效率的纯化。

(纯化方法1)

通过上述步骤得到的水介质萃取物经过硫酸铵沉淀法得到含有凝集素的部分，然后通过疏水色谱法和反向色谱法纯化。

(纯化方法2)

通过上述步骤得到的水介质萃取物经过甲状腺球蛋白固定在琼脂糖上或类似的支持结构的亲和色谱法。

(纯化方法3)

通过上述步骤得到的水溶性的萃取物经过硫酸铵沉淀法得到含凝集素的部分，随后被透析和冻干。然后粗凝集素部分溶于氨丁三醇缓冲剂并且随后经过离子交换色谱，再浓缩得到的活性部分，随后使用凝胶过滤色谱分离。

制造海藻糖α1→6特异性凝集素的方法中可能包含透析从上述纯化步骤中获得的含凝集素部分的步骤，和冻干经过透析处理后的凝集素溶液的步骤。从而，凝集素可以简单地被分离。透析步骤和冻干步骤可以通过常用已知的方法实施。

海藻糖α1→6特异性凝集素，可以是(a)包含任一序列号2-5呈现的氨基酸序列的蛋白质或肽链，或者是(b)在任一序列号2-5所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被删除、插入或替换的、此外其功能上具有等同于包含任一序列号2-5所示的氨基酸序列的蛋白质或肽链的蛋白质或肽链，除了可以从自然植物中萃取而得，也可以是在不同于天然由来的非天然寄主中人工发现或化学合成。在寄主中发现或化学合成可以通过常用已知的方法实施。

优选地，一种标记工具被预包含在用于检测的所述海藻糖α1→6特异性凝集素上。此凝集素后文称为被标记的凝集素。一种被标记的凝集素包含至少一个海藻糖α1→6特异性凝集素和一个标记工具，并且标记可被检测。

对于上述标记工具，可以使用任何已知的标记方法，没有特别的限制，包括例如放射性同位素标记法和连接一个示踪化合物的方法。

对于上述示踪化合物，任何通常用于此目的的化合物均可以应用，没有任何特殊的限制，包括例如直接或间接被标记的化合物、酶、荧光化合物等。具体地，例如生物素、异羟基洋地黄素苷、辣根派生过氧化物酶、异硫氰酸荧光素和CyDye。这些示踪化合物可以用通用的方法与凝集素结合。

只要是从包括人的动物的活体中取得，对于上述样品没有特殊的限制，样品包括例如血液、血浆、血清、眼泪、唾液、体液、乳液、尿液、细胞培养上清液和转基因动物的分泌物等。当本发明的方法用于胰脏癌的筛选时，取自人体的血清或血浆可以用作样品。从血液中萃取血清通过常用的方法而得。

海藻糖α1→6特异性凝集素将对任何含有海藻糖α1→6连接的糖链(例如表1所示的免疫球蛋白G、甲胎蛋白、前列腺特异性抗原等等，)显示出高的亲和性。为了消除对这些糖链的测定，本发明的方法优选通过使用海藻糖α1→6特异性凝集素和抗触珠蛋白抗体的夹心法测定病变触珠蛋白。

对于夹心法，首先，使抗触珠蛋白抗体与样品例如细胞培养上清液和血清反应，以获得触珠蛋白或病态触珠蛋白和抗触珠蛋白抗体的复合体。这些复合体通过亲和色谱法、免疫沉淀法等等分离和纯化。然后，使此复合体与海藻糖α1→6特异性凝集素反应，以获得凝集素-病变触珠蛋白-抗触珠蛋白抗体复合物。

另一种选择，在夹心法中，使含有病变触珠蛋白的样品先与海藻糖α1→6特异性凝集素反应，得到凝集素-病变触珠蛋白复合物，然后，使凝集素-病变触珠蛋白复合物和抗触珠蛋白抗体反应得到凝集素-病变触珠蛋白-抗触珠蛋白抗体复合物。

可以特异性识别触珠蛋白的抗触珠蛋白抗体可以基于常规的方法得到。一个方法的例子是以触珠蛋白为抗原使动物发生免疫反应以获得抗触珠蛋白抗体。抗触珠蛋白抗体既可以是一种多克隆抗体也可以是一种单克隆抗体。

检测海藻糖α1→6特异性凝集素和病变触珠蛋白结合的方法包括酶标记免疫吸附测定法(夹心酶联免疫吸附测试法等等)、凝集素色谱分析法、凝集素印迹法、凝集素染色法、凝集素芯片法、冷凝法和表面等离子体共振法如Biacore^(R)体系。具体地，由于有高的灵敏性，优选使用抗生物素蛋白-生物素或链酶亲和素-生物素体系的方法。

在夹心酶联免疫吸附测试法中，在加入样品例如血清之前，抗触珠蛋白抗体被加入和固定在一个板上。然后加入生物素标记的海藻糖α1→6特异性凝集素，使海藻糖α1→6特异性凝集素与血清中的病变触珠蛋白反应，一种HRP(辣根过氧化物酶)标记的链霉亲和素溶液作为第二示踪物被加入，使得生物素与链霉亲和素发生反应。接着，加入此HRP显色底物以通过吸光光度计(对于HRP，波长为450nm)测量颜色的强度。如果使用含有已知浓度的病变触珠蛋白的标准材料预先生成了校正曲线，则对病变触珠蛋白的定量化成为可能。

凝集素色谱法是利用载体固定的凝集素与糖链的特异性的结合的特性的亲和色谱法。结合HPLC可以得到高的产量。

凝胶材料例如琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉和聚丙烯酰胺一般用作载体，其上固定海藻糖α1→6特异性凝集素。市场上可买到的产品，没有特别限制，可以用于此目的，包括琼脂糖4B和琼脂糖6B(皆来自GE医疗集团生命科学部制)。凝集素色谱柱包括将凝集素固定在微板或纳米井上的结构。

被固定的海藻糖α1→6特异性凝集素的浓度通常是0.001-100mg/mL，优选0.01-20mg/mL。当载体是琼脂糖凝胶时，它被CNBr等活化，然后凝集素偶合在上面。也可以将凝集素固定在引入活化的空间的凝胶内。此外，将凝集素固定在有醛基引入的凝胶之后，还可以被NaCNBH₃还原。此外，可以使用市场上可买到的活化的凝胶例如NHS-琼脂糖(GE医疗集团生命科学部制造)。

将海藻糖α1→6糖链样品负载到柱子上，然后用缓冲溶液冲洗。示范缓冲溶液是这样一种缓冲溶液：摩尔浓度5-500mM，优选10-500mM，并且PH为4.0-10.0，优选6.0-9.0，并且NaCl含量为0-0.5M，优选0.1-0.2M，并且CaCl₂，MgCl₂或MnCl₂含量为0-10mM，优选0-5mM。

经过冲洗亲和层析柱后，海藻糖α1→6糖链的洗脱在能够有效地洗脱糖链的中性的非变性缓冲剂中使用例如氯化钠、半抗原糖以及诸如此类的洗脱剂实施。此缓冲剂可以同上所述。洗脱剂的浓度优选1-500mM，特别优选10-200mM。

本发明还提供区别胰脏癌和胰脏炎的方法，其中海藻糖α1→6特异性凝集素作用于从血清中含有30U/mL或更多CA 19-9的活体中取得的样品中的病变触珠蛋白，此凝集素：

(1)提取自担子菌类。

(2)通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法测定分子量为4000-40000，并且

(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和性，其亲和常数为1.0×10⁴M^-1或更大(在25℃时)。

此区别方法的操作和上述检测胰脏癌的方法一致，除了使用的样品取自血清中含有30U/mL或更多CA 19-9的活体。如表3和图10所示，胰脏癌和胰脏炎通过单独使用传统的肿瘤标示物CA 19-9是很难区分的。另一方面，根据本发明的方法，将标志物CA 19-9和海藻糖α1→6特异性凝集素结合使用，如图8所示可以容易地区别胰脏癌和胰脏炎。

本发明还提供一种用于检测胰脏癌和/或胰脏炎的诊断试剂或试剂盒，其包含海藻糖α1→6特异性凝集素，此凝集素：

(1)提取自担子菌类。

(2)通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法测定分子量为4000-40000，并且

上述凝集素优选是被标记的。

上述诊断试剂或试剂盒选择性地包含那些包括在已知诊断试剂盒中的材料

例如标记(酶及其显色底物、放射性同位素、发光材料、荧光材料、有色材料)、缓冲剂、板和淬灭溶液。具体地，它优选包括从从活体中取得的样品中提取触珠珠蛋白的试剂(例如，抗触珠蛋白抗体)。

实施例

本发明的实施例见下文所示，以详细说明本发明。但是，本发明并不局限于以下实施例中。

(准备例1)PTL的制备

根据下文所示的纯化步骤，从金囊环锈伞菌中分离和纯化金囊环锈伞菌凝集素(PTL)。

(萃取)

通过冻干金囊环锈伞菌(7.5g)得到的冻干的粉末(2.5g)在4℃时用50ml，10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(pH 7.2)萃取2个小时。得到的萃取物离心分离(15000rpm，20min，4℃)。然后，上清液经过纱布过滤从而得到第一次萃取液。萃取的残渣在4℃时，用50ml，10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(pH 7.2)萃取，过夜。萃取后离心分离(15000rpm，20min，4℃)，上清液纱布过滤从而得到第二次萃取液。然后，这些萃取液共同通过滤纸过滤从而得到金囊环锈伞菌萃取液。

(离子交换色谱分析法)

上述萃取液(87ml)施加在用10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(pH 7.2)平衡的DEAE琼脂糖凝胶柱(GE医疗集团生命科学部门制造)上。在柱子用相同的缓冲剂冲洗过后，结合的部分用含有0.1M NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂释放。然后，显示出红血球凝聚活性(如图1的←→部所示)的部分用超滤进行脱盐后，并冻干。

(亲和色谱分析法)

将上述冻干的粉末再溶解在磷酸盐缓冲盐水中(pH 7.4，下文简称PBS)。然后萃取液施加于用同样缓冲剂平衡的甲状腺球蛋白琼脂糖固定相柱子上。在柱子用PBS冲洗过之后，结合的部分用0.2M的氨水释放。然后显示出红血球凝聚的活性(图2的←→部所示)的部分被收集、以超滤器过滤并冻干，从而得到1.07mg PTL。PLT的关于(2)分子量、(3)结合常数、(4)糖结合特异性、(5)与支链的结合及其(6)氨基酸序列的物理和化学性质在上文所述PCT/JP2009/003346中描述。

(准备例2)SRL的制备

根据下文所示的纯化步骤，从皱环球盖菇分离和纯化皱环球盖菇凝集素(SRL)。

(萃取)

400g皱环球盖菇冷冻干燥得到的粉末40g，( )用1.6L PBS在4℃时萃取2小时。所得的液体离心机离心分离(15000rpm，20min，4℃)。然后，上清液用纱布过滤从而得到第一次萃取液。萃取残渣用0.8L PBS在4℃时萃取，过夜，萃取液离心机离心分离(15000rpm，20min，4℃)。然后，上清液用纱布过滤从而得到第二次萃取物。将这些萃取物混合从而得到皱环球盖菇萃取液。

(硫酸铵沉淀法)

固体(NH₄)₂SO₄(1.3kg)加入上述所得上清液2.4L以至80％饱和度。确认完全溶解后在7℃时放置过夜，沉淀物通过离心分离(10,000rpm，20min，4℃)收集，在沉淀物中添加少量纯水，从而收集皱环球盖菇-80％硫酸铵沉淀部分。

(疏水色谱分析法)

将上述皱环球盖菇-80％硫酸铵沉淀部分施加于用2M硫酸铵-PBS平衡的Butyl-TOYOPEARL 650M疏水柱(东曹公司(TOSOH CORPORATION))，实施疏水色谱纯化。在此色谱分析法中，蒸馏水洗脱部分被收集、进行超滤器过滤和冻干，从而得到皱环球盖菇凝集素粗产物(如图3的←→部所示)。

(反相色谱分析法)

将上述大球盖菇凝集素粗产物施加于用0.05％三氟乙酸(TFA)/乙腈(100/0)平衡的C8柱(和光纯药(株式会社)制造)上，用反相色谱分析法纯化。在此分析法中，收集0.05％TFA/乙腈(70/30)洗脱部分(如图4的←→部所示)。然后室温情况下蒸发移除溶剂并且收集得到的干燥粉末，从而得到7.5mg SRL。SRL的关于(2)分子量、(3)结合常数、(4)糖结合特异性、(5)与支链的结合和(6)氨基酸序列的物理和化学性质在上述PCT/JP2009/003346中有所描述。

参考例1：通过凝集素检测血清中的多种糖蛋白。

通过ELISA研究如表1所示的糖蛋白与下文所示的生物素标记的凝集素的亲和性通过ELISA研究：

PTL(一种可以在发明中使用的海藻糖α1→6特异性凝集素)，和

以下市场上可买到的被认为是海藻糖特异性的凝集素：

LCA(日本生化学工业株式会社，J-制油株式会社制造)、

AAL(日本生化学工业株式会社，J-制油株式会社制造)、

Lotus(日本生化学工业株式会社，J-制油株式会社制造)和

UEA-I(日本生化学工业株式会社，J-制油株式会社制造)。

血清糖蛋白(人血清白蛋白(CALBIOCHEM公司制造)、免疫球蛋白G(Sigma公司制造)、转铁蛋白(Sigma公司制造)、纤维蛋白原(AbD Serotec公司制造)、免疫球蛋白A(BETYL公司制造)、α2-巨球蛋白(BMO公司制造)、免疫球蛋白M(ROCKLAND公司制造)、补体C3(CALBIOCHEM公司制造)、触珠蛋白(BIODESIGN公司制造)、α1-酸性糖蛋白(Sigma公司制造)、甲胎蛋白(Fitzgerald公司制造)、甲胎蛋白L3(和光纯药(株式会社)制造)和前列腺特异性抗原(Scipac公司制造)溶于PBS，浓度1mg/mL，并进一步用0.1M的碳酸盐缓冲剂(pH9.5)稀释至10ng/mL。50μL稀溶液加入一个微量滴定板(Nunc 439454)，然后37℃温育1小时。用0.05％的吐温20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)(此后简写为Tween)/PBS冲洗一次，将200μL 1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS加入孔中，然后37℃温育1小时。此板用0.05％Tween/PBS洗两次。

50μL生物素标记的凝集素溶液用1％BSA/0.05％Tween/PBS制备成1μg/mL，加入上述的孔中，然后室温放置1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次，用1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释的50μL HRP标记的链霉亲和素溶液(1μg/mL)加入孔中，然后在室温中放置30分钟。用0.05％Tween/PBS洗三次，加入50μL HRP显色底物(产品名称：TMB Peroxidase substrate system，KPL公司制造)，然后室温下放置5分钟。

为了淬灭反应，加入50μL浓度为1M的磷酸。450nm处的吸光度用POWERSCAN(R)HT酶标仪(plate reader)(DS PHARMA公司制造)测量。

450nm处的吸光度减去没有固定糖蛋白的孔的吸光度，所得的值被认为是反应值。亲和性通过根据以下标准分类被排名。结果见表2。

◎高：0.5或更高

○中等：0.2-0.5

△低：0.1-02

×无结合：0-0.1

表2

PTL对含有海藻糖α1→6的甲胎蛋白L3(AFP-L3)和前列腺特异性抗原(PSA)有亲和性，同时对本来不含海藻糖的触珠蛋白没有亲和性。LCA仅对AFP-L3显示出亲和性。AAL对多个海藻糖化的蛋白质例如IgA和α2MG有亲和性。它与PTL有相似的结合模式，然而它经常显示出明显的非特异性吸收。Lotus和UEA-I对血清中的糖蛋白有低的亲和性

将这些结果整合，已知对海藻糖有亲和力的LCA，Lotus和UEA-I也可能不能检测含海藻糖α1→6糖链的糖蛋白。而且，AAL除了检测含有海藻糖α1→6糖链的糖蛋白，也可以检测其他的糖蛋白。另一方面，PTL只对含有海藻糖α1→6糖链的糖蛋白有亲和力。

(实施例1)使用PTL的ELISA法检测胰脏癌细胞系的培养上清液的病变触珠蛋白。

参考例1说明PTL对触珠蛋白没有亲和力。因此，PTL检测从胰脏癌细胞系(PSN-1，购至DS PHARMA)培养基上清液中萃取的触珠蛋白和作为阴性对照的从人血清中萃取的触珠蛋白(购至BIODESIGN公司)的能力分别通过ELISA评估。与PTL相似的测试对作为阳性对照的LCA和AAL同样执行。

(从胰脏癌细胞中萃取触珠蛋白)

1000mL的胰脏癌细胞系的培养上清液用超滤器(产品名称：VIVA SPIN20-10K，SARTORIUS公司制造)过滤，浓缩至1mL。上述的浓缩液加入到抗触珠蛋白抗体(The Binding Site公司制造)预先固定其中的凝胶(NHS-活化琼脂糖4快速流动(GE healthcare公司制造)中。室温下每10分钟混合搅拌，这样1小时后，含凝胶的溶液加入到0.45μm滤管(Millipore公司制造)中，在4℃时400×g离心5分钟，然后滤液丢弃。紧接着，加入200μL PBS，在4℃时400×g离心5分钟，滤液丢弃。此过程重复两次。接着，加入200μL洗脱缓冲剂(100mM甘氨酸，0.5M NaCl，pH 3.0)，在4℃时400×g离心5分钟，收集滤液。此步骤重复两次。用3N NaOH中和合并的这些溶液所得的触珠蛋白(HP)溶液后，加入600μL PBS。

(ELISA法对触珠蛋白的定量)

HP溶液包含的触珠蛋白的总量通过如下的ELISA法定量。用溶解于1％BSA/PBS中的浓度为0-200ng/mL的人血清中的触珠蛋白(BIODESIGN公司制造)用作标准触珠蛋白溶液。小鼠单克隆抗触珠蛋白抗体(Nippon BiotestLaboratories inc制造)用0.1M碳酸盐缓冲剂(pH 9.5)稀释10000倍。50μL稀释液加入到微量滴定板(Nunc公司制造)中，37℃时温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗一次，200μL的1％BSA/PBS加入到孔中，37℃时温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次，加入50μL标准触珠蛋白溶液或HP溶液，并且37℃时温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次后，将50μL的经1％BSA/0.05％Tween/PBS适当稀释后的绵羊多克隆抗触珠蛋白抗体(The BindingSite公司制造)溶液加入孔中，在室温中放置1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次后，加入50μL用1％BSA/0.05％Tween/PBS适当稀释后的HRP标记的抗绵羊IgG抗体(Millipore公司制造)溶液，室温放置30分钟。用0.05％Tween/PBS洗三次后，加入50μL的HRP显色底物(产品名称：TMB Peroxidase substratesystem，KPL公司制造)，室温放置5分钟。为了淬灭反应，加入50μL 1M磷酸。450nm处的吸光度在酶标仪(plate reader)中被测量(产品名称：POWERSCAN^(R)HT，DS PHARMA公司制造)。

校正曲线通过标准触珠蛋白溶液的吸光度生成，源于胰脏癌细胞的HP溶液的触珠蛋白浓度依此计算。

(PTL与病变触珠蛋白的反应)

HP溶液中的病变触珠蛋白通过如下的ELISA法检测。上文所得的HP溶液用0.1M碳酸盐缓冲剂稀释(pH 9.5)以至触珠蛋白浓度为10ng/mL(HP稀释液)。类似的，人血清中触珠蛋白(BIODESIGN公司制造)也制备成10ng/mL作为阴性对照(人血清派生的触珠蛋白溶液)。向一个微量滴定板(Nunc公司制造)，加入50μL HP稀释液和人血清派生的触珠蛋白溶液，37℃下温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗一次，将200μL 1％BSA/PBS加入到孔中，37℃温育1小时。

用0.05％Tween/PBS洗两次后，将50μL用1％BSA/0.05％Tween/PBS适当稀释的生物素标记的PTL加入到孔中，并且室温放置1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次后，将50μL用1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释的HRP标记的链霉亲和素溶液(1μg/mL)加入到孔中，室温放置30分钟。用0.05％Tween/PBS洗三次后，加入50μL HRP显色底物(产品名称：TMB Peroxidasesubstrate system，KPL公司制造)，室温放置5分钟。为了淬灭反应，加入50μL1M磷酸。450nm处的吸光度在酶标仪(plate reader)中测量(产品名称：POWERSCAN^(R)HT，DS PHARMA公司制造)。

为了对照，用LCA和AAL替代PTL，相似的测试被执行。

450nm处的吸光度减去没有固定糖蛋白的孔测定的吸光度，所得到的值被称为反应值。源至人血清和胰脏癌细胞的触珠蛋白的反应值如图5-7所示。

如图5-7，PTL对人血清中的触珠蛋白没有亲和力。但是，它对胰脏癌细胞的培养上清液的触珠蛋白有亲和力。LCA对胰脏癌细胞和人血清的触珠蛋白的结合力都较低。AAL也可以检测出他们中的不同，尽管他们的比率比PTL的比率小。从上述结果，清晰可见胰脏癌可以通过使用海藻糖α1→6特异性凝集素的PTL作用于胰脏癌细胞中的触珠蛋白来检测。

(实施例2)使用PTL通过ELISA法检测胰脏癌病人的血清中的病变触珠蛋白

根据实施例1，清晰可见作为胰脏癌肿瘤标志物的病变触珠蛋白可以通过使用一种海藻糖a1-6特异性凝集素PTL检测。于是PTL对如下个体血清中病变触珠蛋白的检测能力通过ELISA法评估：健康个体(n＝9，6名男性，3名女性，平均年龄：32.8岁)(简称：健康者1-9)，胰脏癌病人(n＝8，4名男性，4名女性，平均年龄：52.1岁)(简称：胰脏癌1-8)和胰脏炎病人(n＝4，1名男性，3名女性，平均年龄：59.5岁)(简称：胰脏炎1-4)。为了对照，对AAL同样执行与PTL相似的测试。

(血清中萃取触珠蛋白)

10μL健康个体、胰脏癌病人和胰脏炎病人的血清样品用190μL PBS稀释。稀释的血清溶液加入到抗触珠蛋白抗体(The Binding Site公司制造)固定凝胶中。每10分钟混合搅拌同时，室温放置1小时。将上述含有凝胶的溶液加入到0.45μL滤管(Millipore公司制造)中，然后400×g在4℃时离心5分钟，滤液丢弃。接着，加入200μL PBS，400×g在4℃时离心5分钟，滤液丢弃。此步骤重复两次。然后加入200μL洗脱缓冲剂(100mM甘氨酸，0.5M NaCl，pH3.0)，然后400×g在4℃时离心5分钟，收集滤液。此过程重复两次。所得滤液合并，并作为HP溶液，用3N NaOH中和后加入600μL PBS。

(ELISA法检测病变触珠蛋白)

HP溶液中的病变触珠蛋白通过ELISA法检测如下。首先，上文所述得到的HP溶液用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.5)稀释10倍。50μL稀释液加入到微量滴定板(Nunc公司制造)中，37℃温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗一次后，200μL 1％BSA/PBS加入到孔中，37℃下温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次，50μL用1％BSA/0.05％Tween/PBS适当稀释的生物素标记的凝集素溶液加入孔中，室温放置1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次，50μL用1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释的HRP标记的链霉亲和素溶液(1μg/mL)加入到孔中，室温放置30分钟。用0.05％Tween/PBS洗三次后，加入50μL HRP显色底物(产品名称：TMB Peroxidase substrate system，KPL)，室温放置5分钟。为了淬灭反应，加入50μL 1M磷酸。450nm处的吸光度在酶标仪(plate reader)(产品名称：POWERSCAN^(R)HT，DS PHARMA公司制造)中测量。

450nm处的吸光度减去没有固定HP溶液的孔测定的吸光度，所得到的值被称为反应值。结果见图8、9。

如图8、9所示，通过PTL测定的病变触珠蛋白的反应值显示，胰脏癌病人血清的值区别性的高于健康个体和胰脏炎病人血清的值。AAL可以检测出健康个体和胰脏癌病人的不同，然而对于一些病人，它检测出的值比健康个体的值低。

(ELISA法对CA 19-9的定量)

使用ELISA法对健康个体、胰脏癌病人和胰脏炎病人血清中包含的肿瘤标志物CA19-9的定量如下。将Lyphocheck Tumor Maker Control(BIO-RAD公司制造)用作标准样品。小鼠单克隆抗CA19-9抗体(Fitzgerald公司制造)用0.1M碳酸盐缓冲剂(pH 9.5)稀释1000倍。50μL稀释液加入到微量滴定板(Nunc公司制造)中，37℃时温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗一次，200μL 1％BSA/PBS加入孔中，37℃时温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次，50μL各血清加入。用0.05％Tween/PBS洗两次，50μL用1％BSA/0.05％Tween/PBS适当稀释的一种兔多克隆抗CA19-9抗体(Acris公司制造)溶液加入到孔中，37℃下温育1小时。用0.05％Tween/PBS洗两次，加入50μL用1％BSA/0.05％Tween/PBS适当稀释的一种HRP标记的抗兔IgG抗体(日本CHEMI-CON株式会社制造)溶液，37℃时放置30分钟。用0.05％Tween/PBS洗三次，加入50μL HRP用显示底物(产品名称：TMB Peroxidase substrate system，KPL公司制造)，室温放置5分钟。为了淬灭反应，加入50μL 1M磷酸。450nm处的吸光度在酶标仪(plate reader)(产品名称：POWERSCAN^(R)HT，DSPHARMA)中测量。

由标准样的反应值生成校正曲线，每个血清中的CA19-9浓度依此计算。结果见表3和图10。

表3

样品	CA 19-9的量(U/mL)
		健康者1	28.6
健康者2	19.1
		健康者3	6.5
健康者4	9.5
		健康者5	20.5
健康者6	23.9
		健康者7	21.2
健康者8	22.0
		健康者9	24.3
胰脏癌1	56.3
		胰脏癌2	42.6
胰脏癌3	46.8
		胰脏癌4	41.6
胰脏癌5	43.5
		胰脏癌6	68.4
胰脏癌7	45.8
		胰脏癌8	52.3
胰脏炎1	35.1
		胰脏炎2	37.0
胰脏炎3	39.0

胰脏炎4

35.7

如图10所示，健康个体、胰脏癌病人和胰脏炎病人血清中CA19-9的量显示胰脏癌病人和胰脏炎病人血清的值均明显高于健康个体血清的值。因此，明显可见通过仅仅检测CA19-9来区分胰脏癌和胰脏炎是困难的。

另一方面，如图8、10所示，对于含CA19-9的量高于健康个体的患病个体，胰脏癌病人和胰腺炎病人可以通过使用海藻糖α1→6特异性凝集素检测病变触珠蛋白来区别。

(ELISA法检测病变触珠蛋白)

用抗触珠蛋白抗体代替凝集素，测定触珠蛋白。以健康者1的反应值(吸光度)为1进行标准化的相对值见图11的触珠蛋白的相对量(相对HP量)。此外，“吸光度/相对HP量”通过图8、9所示反应值(吸光度)除以相对HP量计算所得。“吸光度/相对HP量”代表每个样品中触珠蛋白的海藻糖基化相对程度。结果见图12、13。

如图12、13所示，明显可见PTL比传统的凝集素可以更精确地检测当正常细胞变为胰脏癌细胞时触珠蛋白的糖链的变化。吸光度/相对HP量作为胰脏癌临床阶段的指示值，因为它可以代表触珠蛋白海藻糖基化的程度。通过每份触珠蛋白中通过使用海藻糖a1-6特异性凝集素检测出的病变触珠蛋白的量也可检测胰脏癌。

从上述结果，清晰可见，通过使用PTL检测病变触珠蛋白，可以从胰脏癌患者的血清检测胰脏癌。在正常细胞到胰脏癌的癌化进程中，PTL可以检测作为肿瘤标志物的病变触珠蛋白，比先前已知的海藻糖α1→6特异性凝集素更精确。由于PTL的高的特异性，PTL可以在混有海藻糖α1→6糖链化合物和其它糖链化合物的糖链化合物群中检测目标的海藻糖α1→6糖链化合物，比其它的凝集素更精确。进一步地，通过结合使用PTL检测病变触珠蛋白和对在胰脏疾病的个体中比健康个体中显示出较高值的另一肿瘤标志物CA19-9的检测，可以区分胰脏癌和胰脏炎。它可以作为胰脏癌或胰脏炎的诊断试剂或试剂盒，此试剂或试剂盒基于PTL和一种糖链的相互作用。

Claims

1.海藻糖α1→6特异性凝集素在制造用于检测胰脏癌的试剂盒中的用途，其中，使下述海藻糖α1→6特异性凝集素作用于从活体中取来的样品中的病变触珠蛋白，所述凝集素：

(1)提取自担子菌，

(2)通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法确定其分子量为4000—40000，并且

(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和性，在25℃时，其结合常数为1.0×10⁴M^-1或更大；

(4)所述海藻糖α1→6特异性凝集素与不含α1→6糖链的高甘露糖链和/或糖脂类的结合的结合常数是1.0×10³M^-1或更低。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于：所述担子菌属于球盖菇科、口蘑科、鹅膏菌科或多孔菌类。

3.权利要求2所述的用途，其特征在于：所述担子菌是金囊环锈伞菌、翘鳞伞菌、金毛环锈伞、皱环球盖菇、砖红韧伞、花脸香蘑或毒蝇伞。

4.权利要求1所述的用途，其特征在于：所述样品是采自人体的血清或血浆。

5.权利要求2所述的用途，其特征在于：所述样品是采自人体的血清或血浆。

6.权利要求3所述的用途，其特征在于：所述样品是采自人体的血清或血浆。

7.权利要求1-6中任一项所述的用途，其特征在于：其中病变触珠蛋白的检测使用所述海藻糖α1→6特异性凝集素和一种以上的抗体。

8.权利要求7所述的用途，其特征在于：病变触珠蛋白通过使用所述海藻糖α1→6特异性凝集素和抗触珠蛋白抗体的分析法检测。

9.权利要求1-6中任一项所述的用途，其特征在于：所述海藻糖α1→6特异性凝集素是被标记的。

10.权利要求7所述的用途，其特征在于：所述海藻糖α1→6特异性凝集素是被标记的。

11.权利要求8所述的用途，其特征在于：所述海藻糖α1→6特异性凝集素是被标记的。

12.海藻糖α1→6特异性凝集素在制造用于判别胰脏炎和胰脏癌的试剂盒中的用途，其中，使海藻糖α1→6特异性凝集素作用于从血清中含有30U/mL或更高浓度CA19-9的活体中取的样品中的病变触珠蛋白，所述凝集素

(1)提取自担子菌，

(2)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其分子量为4000—40000，并且

(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和性力，在25℃时，其结合常数为1.0×10⁴M^-1或更大，

13.权利要求12所述的用途，其特征在于：所述担子菌优选球盖菇科、口蘑科、鹅膏菌科或多孔菌类。

14.权利要求13所述的用途，其特征在于：所述担子菌是金囊环锈伞菌、翘鳞伞、金毛环锈伞、皱环球盖菇、砖红韧伞、花脸香蘑或毒蝇伞。

15.权利要求12所述的用途，其特征在于：所述样品是采自人体的血清或血浆。

16.权利要求13所述的用途，其特征在于：所述样品是采自人体的血清或血浆。

17.权利要求14所述的用途，其特征在于：所述样品是采自人体的血清或血浆。

18.权利要求12-17中任一项所述的用途，其特征在于：病变触珠蛋白的检测使用所述海藻糖α1→6特异性凝集素和一种以上抗体。

19.权利要求18所述的用途，其特征在于：病变触珠蛋白通过使用所述海藻糖α1→6特异性凝集素和抗触珠蛋白抗体的分析法检测。

20.权利要求12-17中任一项所述的用途，其特征在于：所述海藻糖α1→6特异性凝集素是被标记的。

21.权利要求18所述的用途，其特征在于：所述海藻糖α1→6特异性凝集素是被标记的。

22.权利要求19所述的用途，其特征在于：所述海藻糖α1→6特异性凝集素是被标记的。

23.一种检测胰脏癌和/或胰脏炎的诊断试剂或试剂盒，其特征在于：包含抗触珠蛋白抗体和下述海藻糖α1→6特异性凝集素，所述凝集素：

(1)提取自担子菌类，

(3)对海藻糖α1→6糖链有亲和性，在25℃时，其结合常数为1.0×10⁴M^-1或更大，

24.权利要求23所述的检测胰脏癌和/或胰脏炎的诊断试剂或试剂盒，其特征在于：进一步包括抗CA19-9抗体。