JPWO2011089988A1 - 膵臓癌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法(以下、SDSポリアクリルアミド電気泳動法と記載する)による分子量が4,000〜40,000であり、
及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)の親和性を有する
で示されるフコースα1→6特異的レクチンを作用させることを特徴とする、膵臓癌の検出方法を提供する。
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量が4,000〜40,000であり、及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)の親和性を有する
で示されるフコースα1→6特異的レクチンを含む、膵臓癌及び/又は膵炎の検出用診断薬又はキットを提供する。このキットには、抗ハプトグロビン抗体及び/又は抗CA19−9抗体を含むことが好ましい。
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量が4,000〜40,000であり、及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)で示される
を有するフコースα1→6特異的レクチンを作用させて検出することを特徴とする。
(1)レクチンの由来
フコースα1→6特異的レクチンの由来となる原料は、担子菌である。担子菌の中でも、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科に属することが好ましい。モエギタケ科としては、ツチスギタケ、サケツバタケ、クリタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、ヌメリスギタケ等が挙げられる。キシメジ科としては、コムラサキシメジ等が挙げられる。タコウキン科としては、シロハカワラタケ、ツヤウチワタケ等が挙げられる。テングタケ科としては、ベニテングタケ等が挙げられる。これらの担子菌のうち、レクチンのフコースα1→6糖鎖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、モエギタケ科、キシメジ科又はテングタケ科が特に好ましく、さらに好ましくはツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。
前記フコースα1→6特異的レクチンのSDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、4,000〜40,000であり、好ましくは4,000〜20,000である。ここで、SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、例えばLaemmiの方法(Nature,227巻,680頁,1976年)に準じて測定されるものである。
前記フコースα1→6特異的レクチンのフコースα1→6糖鎖に対する結合定数は、1.0×104M−1以上であり、好ましくは1.0×105M−1以上、さらに好ましくは1.0×106M−1以上である。すなわち、フコースα1→6に親和性を有することが従来知られているAAL、麹菌レクチン(AOL)、LCA、ラッパズイセンレクチン(NPA)及びエンドウマメレクチン(PSA)と比べて、結合定数が著しく高い。これは、前記フコースα1→6特異的レクチンが、従来のレクチンと比べて極めて高い選択性をもってフコースα1→6糖鎖と結合することを意味する。
前記フコースα1→6特異的レクチンは、フコースα1→6糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び/又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。これにより、前記フコースα1→6特異的レクチンは、より一層高い結合特異性を有する。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、結合定数が1.0×103M−1以下、好ましくは1.0×102M−1以下、特に好ましくは0であることを意味する。
前記フコースα1→6特異的レクチンは、フコースα1→6N結合型の一本、二本、三本及び/又は四本糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)で示される親和性を有することが好ましく、より好ましくは結合定数1.0×105M−1以上で示される親和性を有する。
フコースα1→6特異的レクチンは、特に、表1の配列番号1に示すような共通のアミノ酸構造を有する。配列番号1の第4、5、6及び7番目のXaaは、それぞれ、Asp/Asn/Glu/Thr、Thr/Ser/Ala、Tyr/Phe及びGln/Lys/Gluを意味し、その斜線は「又は」を意味する。
& Imai)、サケツバタケ(Stropharia rugosoannulata Farlow in Murr.)、クリタケ(Naematoloma sublateritium (Fr.) Karst又はHypholoma sublateritium(Fr.)Quel)等のモエギタケ科、コムラサキシメジ(Lepista sordida (Schum. : Fr.) Sing.)等のキシメジ科、シロハカワラタケ(Trichaptum elongatum)、ツヤウチワタケ(Microporus vernicipes)等のタコウキン科、ベニテングタケ(Amanita muscaria)等のテングタケ科に属するものが好ましい。これらの担子菌の使用部位は、子実体であることが好ましい。
(精製方法1)
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、得られたレクチン画分を疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーで精製する。
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、チログロブリンをアガロース等に固定した担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーに供して精製する。
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、透析凍結乾燥を行った後、粗レクチン画分をトリス緩衝液に溶解後、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離する。
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量が4,000〜40,000であり、及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)の親和性を有する
で示されるフコースα1→6特異的レクチンを作用させることを特徴とする、膵臓癌と膵炎との判別方法を提供する。本判別方法の操作は、検体として血清中のCA19−9量が30U/mL以上である生体から取得したものを使用する以外は、前記膵臓癌の検出方法と同様である。従来の腫瘍マーカーCA19−9の単独使用では、表3及び図10に示すように、膵臓癌と膵炎との区別がつきにくかった。一方、マーカーCA19−9及びフコースα1→6特異的レクチンを併用する本発明の膵臓癌と膵炎との判別方法によれば、図8に示すように、膵臓癌と膵炎との判別が容易になる。
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量が4,000〜40,000であり、及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)で示される親和性を有する
フコースα1→6特異的レクチンを含む、膵臓癌及び/又は膵炎の検出用診断薬又はキットを提供する。上記レクチンは、標識されていることが好ましい。
上記診断薬又はキットには、適宜、標識(酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質)、緩衝液、プレート、反応停止液等の診断薬キットに公知のものを含む。特に、生体から取得した検体からハプトグロビンを抽出するための試薬(例えば抗ハプトグロビン抗体)を含むことが好ましい。
〔調製例1〕PTLの製造
以下に示す精製工程に従って、ツチスギタケからツチスギタケレクチン(PTL)を単離精製した。
ツチスギタケ約7.5gを凍結乾燥して得られたツチスギタケ凍結乾燥粉末2.5gに、10mM トリス緩衝液(pH7.2)50mLを加えて、4℃下で2時間抽出した。この液を、遠心分離(15,000rpm、20min、4℃)後、上清をガーゼろ過して1回目の抽出液を得た。この抽出残渣に、10mM トリス緩衝液(pH7.2)を50mL加えて、4℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離(15,000rpm、20min、4℃)後、上清をガーゼろ過して2回目の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせてろ紙でろ過し、ツチスギタケ抽出液とした。
上記抽出液87mLを、10mM トリス緩衝液(pH7.2)で平衡化したDEAE−セファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に供した。同緩衝液でカラムを洗浄後、0.1M NaClを含む10mM トリス緩衝液(pH7.2)で溶出した。赤血球凝集活性を示す画分(図1の←→部)を合一し、限外ろ過で脱塩後凍結乾燥した。
上記凍結乾燥粉末を、10mM リン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4、以後、PBSと略す)で溶解し、同緩衝液で平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。PBSでカラムを洗浄後、0.2M アンモニアで溶出した。赤血球凝集活性を示す画分(図2の←→部)を合一し、限外ろ過で純水に置換後凍結乾燥し、PTLを1.07mg得た。PTLの(2)分子量、(3)結合定数、(4)糖結合特異性、(5)分岐鎖への結合及び(6)アミノ酸配列に関する理化学的性質は、前述のPCT/JP2009/003346に記載されている。
以下に示す精製工程に従って、サケツバタケからサケツバタケレクチン(SRL)を単離精製した。
(抽出)
サケツバタケ約400gを凍結乾燥して得られたサケツバタケ凍結乾燥粉末40gに、1.6LのPBSを加え、4℃下で2時間抽出した。この液を、遠心分離(10,000rpm、20min、4℃)後、上清をガーゼろ過して1回目抽出液を得た。この抽出残渣にPBS 0.8Lを加え、4℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離(10,000rpm、20min、4℃)後、上清をガーゼろ過して2回目抽出液を得た。これらの抽出液をあわせてサケツバタケ抽出液とした。
上記抽出液2.4Lに対して、硫酸アンモニウム濃度が80%飽和になるように硫酸アンモニウム1.3kgを添加して攪拌した。完全に溶解したことを確認した後、7℃下で一晩静置した。この溶液を遠心(10,000rpm、20min、4℃)し、沈殿に純水を少量添加し、懸濁してサケツバタケ80% 硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。
上記サケツバタケ80% 硫酸アンモニウム沈殿画分を、2M 硫酸アンモニウム−PBSで平衡化したブチル−トヨパール650M(東ソー(株)製)に供して、疎水クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、純水溶出画分を合一し、透析及び凍結乾燥を行い、サケツバタケレクチン粗画分を得た(図3の←→部)。
上記サケツバタケレクチン粗画分を、0.05% トリフルオロ酢酸(TFA)−0% アセトニトリルで平衡化したC8カラム(和光純薬(株)製)に供して、逆相クロマトグラフィーで精製した。このクロマトグラフィーにおいて、0.05% TFA−30% アセトニトリル溶出画分(図4の←→部)を合一し、常温、減圧下で溶媒を除去して得られた乾燥粉末を合一して、SRLを7.5mg得た。SRLの(2)分子量、(3)結合定数、(4)糖結合特異性、(5)分岐鎖への結合及び(6)アミノ酸配列に関する理化学的性質は、前述のPCT/JP2009/003346に記載されている。
PTL(本発明に使用可能なフコースα1→6特異的レクチン)並びに、
従来、フコース特異的といわれている以下の市販のレクチン:
LCA(生化学バイオビジネス(株)−(株)J−オイルミルズ製)、
AAL(生化学バイオビジネス(株)−(株)J−オイルミルズ製)、
Lotus(生化学バイオビジネス(株)−(株)J−オイルミルズ製)、及び
UEA−I(生化学バイオビジネス(株)−(株)J−オイルミルズ製)
◎:0.5以上
○:0.2〜0.5、
△:0.1〜0.2、
×:0〜0.1
参考例1により、PTLは、ハプトグロビンに対して親和性を有しないことがわかった。そこで、膵臓癌細胞株(PSN−1、DS PHARMA社より入手)の培養上清から抽出したハプトグロビン、及び陰性対照としてヒト血清由来ハプトグロビン(BIODESIGN社より入手)に対して、それぞれ、PTLによる検出をELISA法で評価した。陽性対照としてLCA及びAALについても、PTLと同様の試験を行った。
膵臓癌細胞株の培養上清液1000 mLを、限外ろ過フィルター(製品名:VIVA SPIN 20‐10K、ザルトリウス社製)で1mLに濃縮した。予め抗ハプトグロビン抗体(The Binding Site社製)を固定化したゲル(NHS−activated Sepharose 4 Fast Flow(GEヘルスケア社製)に上記濃縮液を添加した。室温で10分毎に混和して1時間後、前記ゲルを含む溶液を0.45μmフィルターチューブ(ミリポア社製)に加え、400×g、温度4℃で5分間遠心し、ろ液を廃棄した。次に、PBS 200μLを加えて400×g、温度4℃で5分間遠心して、ろ液を廃棄した。これを2回繰り返した。次いで、Elution Buffer(100mM グリシン、0.5M NaCl、pH3.0)200μLを加えて、400×g、温度4℃で5分間遠心して、ろ液を回収した。これを2回繰り返した。この液を合わせて得たハプトグロビン(HP)溶液を3NのNaOHで中和した後、PBS 600μLを加えた。
HP溶液に含まれるハプトグロビンを以下のELISA法で定量した。標準ハプトグロビン溶液としてヒト血清由来ハプトグロビン(Biodeign社製)を1% BSA/PBSで0〜200ng/mLに溶解したものを使用した。マウスモノクローナル抗ハプトグロビン抗体(日本バイオテスト社製)を、0.1M 炭酸緩衝液(pH 9.5)で10,000倍希釈した。希釈液をマイクロタイタープレート(Nunc社製)に50μL添加し、37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで1回洗浄後、1% BSA/PBSをウェルに200μL添加して37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、標準ハプトグロビン溶液又はHP溶液を50μL添加して37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、1% BSA/0.05% Tween/PBSで適宜希釈したヒツジポリクローナル抗ハプトグロビン抗体(The Binding Site社製)溶液をウェルに50μL添加して室温で1時間放置した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、1% BSA/0.05% Tween/PBSで適宜希釈したHRP標識抗ヒツジIgG抗体(ミリポア社製)溶液を50μL添加して室温で30分間放置した。0.05% Tween/PBSで3回洗浄後、HRP用発色基質(製品名:TMB Peroxidase substrate system、KPL社製)を50μL添加し、室温で5分間放置した。1M リン酸を50μL添加し、反応を停止した。プレートリーダー(製品名:POWERSCAN(登録商標)HT、DS PHARMA社製)で450nmにおける吸光度を測定した。
HP溶液に含まれる病変ハプトグロビンを以下のELISA法で検出した。上記で得たHP溶液を0.1M 炭酸緩衝液(pH 9.5)でハプトグロビンが10ng/mLになるように希釈した(HP希釈溶液)。陰性対照としてヒト血清由来ハプトグロビン(Biodesign社製)も同様に10ng/mLになるように調製した(ヒト血清由来ハプトグロビン溶液)。HP希釈溶液及びヒト血清由来ハプトグロビン溶液をマイクロタイタープレート(Nunc社製)に50μL添加し、37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで1回洗浄後、1% BSA/PBSをウェルに200μL添加して37℃で1時間保温した。
実施例1によって、フコースα1→6特異的レクチンであるPTLを用いれば、膵臓癌の腫瘍マーカーとしての病変ハプトグロビンを検出可能であることが判明した。そこで実際に、健常者(n=9,男性6名、女性3名、平均年齢32.8歳)(略号:健常1〜9)、膵臓癌患者(n=8,男性4名、女性4名、平均年齢52.1歳)(略号:膵癌1〜8)及び、膵炎患者(n=4,男性1名、女性3名、平均年齢59.5歳)(略号:膵炎1〜4)から取得した血清に対して、それぞれ、PTLによる病変ハプトグロビンの検出をELISA法で評価した。比較のため、AALについても、PTLと同様の試験を行った。
健常者、膵臓癌患者及び膵炎患者の血清10μLを、PBS 190μLで希釈した。抗ハプトグロビン抗体(The Binding Site社製)固定化ゲルに上記血清希釈液を添加した。10分毎に混和しながら、室温で1時間放置した。前記ゲルを含む溶液を0.45μmフィルターチューブ(ミリポア社製)に加え、400×g、温度4℃で5分間遠心し、ろ液を廃棄した。次に、PBS200μLを加え、400×g、温度4℃で5分間遠心して、ろ液を廃棄した。これを2回繰り返した。Elution Buffer(100mM グリシン、0.5M NaCl、pH3.0)200μLを加え、400×g、温度4℃で5分間遠心して、ろ液を回収した。これを2回繰り返した。得られたろ液を合わせてHP溶液とし、3NのNaOHで中和し、PBS 600μLを加えた。
HP溶液に含まれる病変ハプトグロビンの検出を以下のELISA法で行った。まず、上記で得たHP溶液を、0.1M 炭酸緩衝液(pH 9.5)で10倍希釈した。希釈液をマイクロタイタープレート(Nunc社製)に50μL添加し、37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで1回洗浄後、1% BSA/PBSをウェルに200μL添加して37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、1% BSA/0.05% Tween/PBSで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液をウェルに50μL添加して室温で1時間放置した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、1% BSA/0.05% Tween/PBSで希釈したHRP標識ストレプトアビジン溶液(1μg/mL)を50μL添加して室温で30分間放置した。0.05% Tween/PBSで3回洗浄後、HRP用発色基質(製品名:TMB Peroxidase substrate system、KPL社製)を50μL添加し、室温で5分間放置した。1M リン酸を50μL添加し、反応を停止した。プレートリーダー(製品名:POWERSCAN(登録商標)HT、DS PHARMA社製)で450nmにおける吸光度を測定した。
健常者、膵臓癌患者及び膵炎患者の血清に含まれる腫瘍マーカーCA19−9の定量を以下のELISA法で行った。標準試料としてLyphocheck Tumor Maker Control(BIO−RAD社製)を使用した。マウスモノクローナル抗CA19−9抗体(Fitzgerald社製)を、0.1M 炭酸緩衝液(pH 9.5)で1000倍希釈した。希釈液をマイクロタイタープレート(Nunc社製)に50μL添加し、37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで1回洗浄後、1% BSA/PBSをウェルに200μL添加して37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、各血清を50μL添加して37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、1% BSA/0.05% Tween/PBSで適宜希釈したラビットポリクローナル抗CA19−9抗体(Acris社製)溶液をウェルに50μL添加して37℃で1時間保温した。0.05% Tween/PBSで2回洗浄後、1% BSA/0.05% Tween/PBSで適宜希釈したHRP標識抗ラビットIgG抗体(ケミコン社製)溶液を50μL添加して37℃で30分間保温した。0.05% Tween/PBSで3回洗浄後、HRP用発色基質(製品名:TMB Peroxidase substrate system、KPL社製)を50μL添加し、室温で5分間放置した。1M リン酸を50μL添加し、反応を停止した。プレートリーダー(製品名:POWERSCAN(登録商標)HT、DS PHARMA社製)で450nmにおける吸光度を測定した。
Claims (19)
- 生体から取得した検体に含まれる病変ハプトグロビンに、
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量が4,000〜40,000であり、及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)の親和性を有する
で示されるフコースα1→6特異的レクチンを作用させることを特徴とする、膵臓癌の検出方法。 - 前記フコースα1→6特異的レクチンは、さらに、(4)フコースα1→6糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び/又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌の検出方法。
- 前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属することを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌の検出方法。
- 前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケであることを特徴とする、請求項3に記載の膵臓癌の検出方法。
- 前記検体は、ヒトから採取した血清又は血漿であることを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌の検出方法。
- 前記フコースα1→6特異的レクチンと1種以上のレクチン又は抗体を用いて病変ハプトグロビンを検出することを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌の検出方法。
- 前記フコースα1→6特異的レクチンと抗ハプトグロビン抗体とを用いたアッセイにより、病変ハプトグロビンを検出することを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌の検出方法。
- 前記フコースα1→6特異的レクチンは、標識されていることを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌の検出方法。
- 血清中のCA19−9量が30U/mL以上である生体から取得した検体に含まれる病変ハプトグロビンに、
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量が4,000〜40,000であり、及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)の親和性を有する
で示されるフコースα1→6特異的レクチンを作用させることを特徴とする、膵臓癌と膵炎との判別方法。 - 前記フコースα1→6特異的レクチンは、さらに、(4)フコースα1→6糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び/又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とする、請求項9に記載の膵臓癌と膵炎との判別方法。
- 前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属することを特徴とする、請求項9に記載の膵臓癌と膵炎との判別方法。
- 前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケであることを特徴とする、請求項11に記載の膵臓癌と膵炎との判別方法。
- 前記検体は、ヒトから採取した血清又は血漿であることを特徴とする、請求項9に記載の膵臓癌と膵炎との判別方法。
- 前記フコースα1→6特異的レクチンと1種以上のレクチン又は抗体を用いて病変ハプトグロビンを検出することを特徴とする、請求項9に記載の膵臓癌と膵炎との判別方法。
- 前記フコースα1→6特異的レクチンと抗ハプトグロビン抗体とを用いたアッセイにより、病変ハプトグロビンを検出することを特徴とする、請求項9に記載の膵臓癌と膵炎との判別方法。
- 前記フコースα1→6特異的レクチンは、標識されていることを特徴とする、請求項9に記載の膵臓癌と膵炎との判別方法。
- フコースα1→6特異的レクチンであって、
(1)担子菌から抽出することができ、
(2)SDSポリアクリルアミド電気泳動法による分子量が4,000〜40,000であり、及び、
(3)フコースα1→6糖鎖に対して結合定数1.0×104M−1以上(25℃において)の親和性を有する
で示される前記フコースα1→6特異的レクチンを含む、膵臓癌及び/又は膵炎の検出用診断薬又はキット。 - さらに、抗ハプトグロビン抗体を含む、請求項17に記載の膵臓癌及び/又は膵炎の検出用診断薬又はキット。
- さらに、抗CA19−9抗体を含む、請求項17に記載の膵臓癌及び/又は膵炎の検出用診断薬又はキット。
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