CN110734491A - 检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法。本发明人筛选获得一株独特的抗副溶血性弧菌的单克隆抗体，对于不同型别的副溶血性弧菌具有广谱结合/识别能力，而对于副溶血性弧菌以外的其它菌株则不发生结合/识别，特异性和敏感性俱佳。本发明还提供了含有该单克隆抗体的试剂盒以及利用该单克隆抗体进行副溶血性弧菌检测的方法。

Description

检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，更具体地，本发明涉及检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

弧菌(Vibrio)是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带鞭毛的革兰氏阴性菌。弧菌属(Vibrio)为弧菌科的1属。弧菌属细菌种类多，分布广泛，尤其是水中最为常见。

副溶血性弧菌是一种嗜盐性海洋弧菌，易引起食物中毒，其污染主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。临床症状以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。在中国，副溶血弧菌是细菌性食物中毒事件最主要病原菌。因此，针对食品及环境中污染的副溶血性弧菌，建立快速有效的检测技术，实现副溶血弧菌的有效监控，对降低微生物性的食源性疾病的发生，有极其重大的意义。

目前我国食品中副溶血弧菌的检测主要依据“金标准”的是国标GB/T 4789-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》或PCR检测方法，国标方法检测需要专业的微生物技术人员，而PCR方法对仪器设备和检测环境要求很高。

基于免疫学的ELISA方法操作简便，检测时间短，可实现样品的高通量(最高可达96个样品)检测，在食源性致病菌检测监测与控制体系中发挥着至关重要的作用。但是，ELISA检测方法中使用的结果的准确性取决于抗体的质量。弧菌类细菌有大量的同源蛋白，而副溶血性弧菌这一种属又有多个血清型，要筛选出能同时检测多种血清型的副溶血性弧菌而不与其他细菌发生交叉反应的抗体并非易事。

综上，本领域很有必要针对副溶血性弧菌开发特异性好且交叉干扰少的抗体，以满足食品检测等方面的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能特异性识别副溶血性弧菌的单克隆抗体及其应用。

一种结合分子，包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8所示的重链CDR1，SEQ IDNO:9所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3，SEQ ID NO:14所示的轻链CDR1，SEQID NO:15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:16所示的轻链CDR3。

上述结合分子，包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

上述结合分子，包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子是单克隆抗体。

编码上述结合分子的核酸分子。

上述结合分子在制备用于检测副溶血性弧菌的试剂中的用途。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有编码所述的结合分子的DNA。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体。

一种免疫辍合物，其特征在于，所述的免疫辍合物包括：

所述的结合分子；以及与所述结合分子连接的可检测标记物；较佳地，所述可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物；更佳地包括：生物素。

一种用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其包括所述的结合分子；或所述的免疫辍合物。

所述试剂盒中还包括：捕获抗体，其为抗副溶血性弧菌外膜蛋白K的多克隆抗体；所述的捕获抗体被固定在固相载体上；优选的，所述固相载体包括(但不限于)：试纸(如胶体金试纸)、微球、包被板、玻片或芯片。

进一步优选的，所述的多克隆抗体为利用外膜蛋白K免疫动物获得；较佳地，所述的动物为兔。

一种检测副溶血性弧菌的方法，利用所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测所述的结合分子或所述的免疫辍合物与待测样品的结合情况，获得副溶血性弧菌的存在情况以及存在量。

优选的，所述方法包括：

(1)以多克隆抗体作为捕获抗体(第一抗体)，捕获副溶血性弧菌。

(2)以所述的结合分子或所述的免疫辍合物作为检测抗体(第二抗体)进行特异性检测，获得副溶血性弧菌的存在情况以及存在量。

在另一优选例中，所述的待测样品不是来自动物或人的样品；较佳地所述的待测样品包括：食品、乳品、饮料或药品等。

在另一优选例中，所述的检测副溶血性弧菌的方法为非诊断性的方法；较佳地，所述的方法应用于针对含菌场所、含菌环境、物品(如器皿)或食品、乳品、饮料或药品等的检测。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明人经过广泛而深入的研究，筛选获得一株独特的杂交瘤细胞株，其产生抗副溶血性弧菌的抗体，该抗体具有独特的互补决定区(CDR区)，对于不同型别的副溶血性弧菌具有广谱结合/识别能力，而对于副溶血性弧菌以外的其它菌株则不发生结合/识别，特异性和敏感性俱佳。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括各种需要进行微生物特别是副溶血性弧菌检测的样品。例如，所述的“待测样品”可以来自于含菌场所、含菌环境、物品(如器皿)或食品、乳品、饮料或药品等。

如本文所用，“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一抗体”、与“一抗”可互换使用，都是指用于从样品中富集副溶血性弧菌的抗体。在本发明的优选方式中，所述的一抗为抗OMPK的多克隆抗体。

如本文所用，“检测抗体”、“第二抗体”、与“二抗”可互换使用，都是指特异性抗外膜蛋白K(OMPK)、与相应的第一抗体配合进行识别或结合的抗体。对于本发明中感兴趣的副溶血性弧菌而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于副溶血性弧菌的OMPK的不同表位。在本发明的优选方式中，所述的二抗为本发明的结合分子(抗OMPK的单多克隆抗体)。

如本文所用，所述的“可检测信号”是指与第二抗体连接并用于显示第二抗体与副溶血性弧菌特异性结合的信号。

结合分子

尽管现有的免疫检测方法例如酶联免疫检测法(ELISA)已经广泛地被研究和适用，但是其检测的准确性依赖于抗体的质量。当进行微生物检测时，鉴于微生物种类繁多，种属之间即存在共性又存在个性，使得此方面的检测仍需不断探索。弧菌类细菌有大量的同源蛋白，而副溶血性弧菌这一种属又有多个血清型，要筛选出能同时检测多种血清型的副溶血性弧菌而不与其他细菌发生交叉反应的抗体非常困难。面对现有技术的这些问题，本发明人致力于寻找实现副溶血性弧菌的特异性鉴定、能避免其它菌株(特别是近缘菌株)的交叉干扰的抗体，分离了副溶血性弧菌的多种蛋白，以它们作为免疫原制备抗体，考察所获得的抗体的特异性。经过广泛地实验和论证，确定了以外膜蛋白K(OMPK)作为免疫原以及由此筛选获得的特异性抗体。

本发明提供了能结合副溶血性弧菌的结合分子。优选地，本发明的结合分子呈现对于副溶血性弧菌的特异性结合/识别活性。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与副溶血性弧菌的特异性抗原结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列，本发明的抗体的CDR区是全新的。所述抗体可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。

本发明的另一方面包括本文所述抗体的功能变体。所述变体能与亲代抗体竞争特异性结合OMPK，且其识别副溶血性弧菌的OMPK的能力接近于本发明实施例中提供的具体的抗体。所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。较佳地，序列的修饰发生在所述抗体的CDR区以外的区域上。

本发明还提供了一种免疫缀合物，其包含本文所述抗体以及进一步包含至少一种其它类型的功能性分子。所述的功能性分子包括但不限于：可检测标记物。所述抗体与所述功能性分子可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合物。

在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与本发明的结合分子结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中目标菌株的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的可检测标记物可包括但不限于：荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

所述的标记物可直接被设置于第二抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗第二抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示第二抗体与目标菌株发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(MB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。

作为一种具体的实例，所述的可检测标记物是生物素，该生物素作为显示标志，当与链霉菌亲和素偶联的藻红蛋白(链亲和素-藻红蛋白，又称为PE标记的链亲和素，SA-R-PE)结合后，通过激光激发产生荧光信号。

检测试剂和试剂盒

本发明的结合分子可用于制备检测副溶血性弧菌的试剂或试剂盒。以所述的结合分子为基础，可制备方便、快速且准确地检测副溶血性弧菌的试剂盒。在本发明的优选方式中，还包括同时应用一种结合抗副溶血性弧菌的多克隆抗体。

因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在副溶血性弧菌的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗副溶血性弧菌的结合分子。

作为本发明的一种检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的结合分子进行检测。

所述的固相载体的包括但不限于：试纸或试纸条，微球，玻片，孔板(如48孔板，96孔板)，芯片等。

作为本发明的一种进一步优选的方式，根据双抗夹心法的原理来实施检测。所述的双抗夹心法是将一抗(抗副溶血性弧菌的多克隆抗体)固定于载体，然后使一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应，所述的二抗为本发明的抗副溶血性弧菌的单克隆抗体(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。

为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、增敏剂、杂交液、抗原修复液、封闭液、PBS、二甲苯、乙醇、H₂O₂甲醇液等等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别副溶血性弧菌的试剂。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中副溶血性弧菌存在情况或其存在量，从而得知待测样品的供体是否含有副溶血性弧菌，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。

作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：

(a1)将所述抗副溶血性弧菌的多克隆抗体包被于固相载体；

(a2)将待测样品加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的副溶血性弧菌与多克隆抗体结合，形成带有“副溶血性弧菌-多克隆抗体”二元复合物的固相载体；

(a3)将本发明的结合分子(携带可检测标记物)加样于加样于(a2)的固相载体，形成带有“多克隆抗体-副溶血性弧菌-本发明的结合分子”复合物的固相载体；本发明的结合分子上携带一可检测标记物；

(a4)检测(a3)复合物中的标记物，确定待检测样品中副溶血性弧菌的存在与否以或存在的量。

作为一种测定方法，通过设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，之后比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的副溶血性弧菌含量。

有益效果：

(1)提供了一种具有全新的结合分子，其是以副溶血性弧菌OMPK蛋白为抗原筛选获得，对于副溶血性弧菌广谱可识别，而对于副溶血性弧菌以外的近缘种属的菌株则无交叉反应性，特异性和灵敏度均非常高。

(2)所述的结合分子与抗OMPK的多克隆抗体能够良好地配合，特别适用于双抗夹心法ELISA检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

图1、实施例1中获得的表达产物进行纯化后，SDS-PAGE检测的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

本实施例中用到的抽提副溶血性弧菌和其它菌株均购买自中国工业微生物菌种保藏中心；小鼠购买自斯莱克实验动物有限责任公司。

实施例1

抗体的获得

针对多种多样的微生物菌株，本发明人致力于寻找实现副溶血性弧菌的特异性鉴定、能避免其它菌株的交叉干扰的抗体。由于菌株自身存在非常多的蛋白，而其作为免疫原的免疫效果差异很大，本发明人分离了副溶血性弧菌的多种蛋白，以它们作为免疫原制备抗体，考察所获得的抗体的特异性。经过广泛地实验和论证，确定了以外膜蛋白K(OMPK)作为免疫原以及由此筛选获得的特异性抗体。

1、OMPK重组蛋白(32KD)的表达和纯化

抽提副溶血性弧菌的基因组DNA，制备引物：

Nompku：5’CCCGGATCCATGCGTAAATCACTTCTAGCTCT3’；

Nompkd：5’CCCCTCGAGGAATTTGTAAGTTACAGCTACG3’；

以上述副溶血性弧菌的基因组DNA为模板，以上述引物进行PCR，扩增OMPK基因，扩增产物经BamHI/XhoI限制性内切酶消化后，插入BamHI/XhoI消化的PET-28a载体中，转化进E.coli BL21感受态中，37℃过夜培养后，筛选阳性克隆子，经IPTG诱导表达融合His-tag标签的OMPK蛋白。

表达的蛋白进行镍柱纯化，之后进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示。

2、杂交瘤细胞株的筛选

将前述获得的纯化OMPK蛋白经腹腔免疫注射6-8周大的Balb/c雌性小鼠，每只小鼠免疫6次，每次免疫间隔2周。首次免疫剂量100μg/只，后面5次免疫剂量50μg/只。最后一次免疫三天后检测小鼠血清效价，取血清效价>10万的小鼠脾脏与SP2/0细胞进行杂交瘤细胞融合，融合7-10天后，采用间接ELISA筛选分泌抗副溶血性弧菌抗体的杂交瘤细胞，完成3轮“亚克隆-筛选”循环，获得阳性杂交瘤细胞株。

运用间接ELISA试验，本发明人对杂交瘤细胞株进行了大量筛选，去除与弧菌属非副溶血性弧菌发生交叉反应的菌株。所述的弧菌属非副溶血性弧菌包括：霍乱弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等。

经过上述筛选以及去除发生交叉的细胞株，获得了一株特异性良好、无交叉反应的杂交瘤细胞株，其产生的抗体称为VP3抗副溶血性弧菌抗体。其呈现对于多达约20株非副溶血性弧菌不具有交叉反应性。所述约20株非副溶血性弧菌包括：霍乱弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等。

实施例2、抗体的测序

针对前述筛选获得的杂交瘤细胞株，对其产生的单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)分别进行测序，并且确定其CDR区。

VH核酸序列如下(SEQ ID NO:1)(其中下划线依次为CDR1、CDR2、CDR3)：

GAGGGACGAGTCGCATGCTCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTCTTCCGGAATTCCAGGTTCAGCTGGAGGAGTCAGGACCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGCGAC TCCATCACCAGTGGTTGG(CDR1)TGGAACTGGATCCGGAAATTCCCAGGGAATAAACTTGAGTACATGGGGTACA TAAGCTACAGTGGTACCTCC(CDR2)TACTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTACTACCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATATAGC GGGGACGACGGGCGGTTTGCTTAC(CDR3)TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTAGATCTTCCAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCAT

CDR1核苷酸序列：GGCGACTCCATCACCAGTGGTTGG(SEQ ID NO:5)；

CDR2核苷酸序列：ATAAGCTACAGTGGTACCTCC(SEQ ID NO:6)；

CDR3核苷酸序列：GCAAGATATAGCGGGGACGACGGGCGGTTTGCTTAC(SEQ ID NO:7)。

VH氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)(其中下划线依次为CDR1、CDR2、CDR3)：

QLEESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGW(CDR1)WNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGTW(CDR2)YYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTAT YYCARYSGDDGRFAY(CDR3)WGQGTLVTVSA

其中，CDR1氨基酸序列：GDSITSGW(SEQ ID NO:8)；

CDR2氨基酸序列：ISYSGTW(SEQ ID NO:9)；

CDR3氨基酸序列：ARYSGDDGRFAY(SEQ ID NO:10)。

VL核酸序列如下(SEQ ID NO:3)(其中下划线依次为CDR1、CDR2、CDR3)：

GGGAATTCGATATTGTGCTGACCCAATCTACAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCGAGGACAGAGAGCCACTATCTTCTGCAGAGCCAGTCAGTCTGTCGATTATAATGGAATTAGTTTC(CDR1)ATGCACTGGCTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCAGGCATCC(CDR2)AACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAAGATGCTGCAACCTATTACTGTATGCAAAGTATTGAGGATCCGTGGACG(CDR3)TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCAGATCTA

其中，CDR1核苷酸序列：CAGTCTGTCGATTATAATGGAATTAGTTTC(SEQ ID NO:11)；

CDR2核苷酸序列：CAGGCATCC(SEQ ID NO:12)；

CDR3核苷酸序列：ATGCAAAGTATTGAGGATCCGTGGACG(SEQ ID NO:13)。

VL氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4)(其中下划线依次为CDR1、CDR2、CDR3)：

DIVLTQSTASLAVSRGQRATIFCRASQSVDYNGISF(CDR1)MHWLQQKPGQPPKLLIYQAS(CDR2)NLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCMQSIEDPWT(CDR3)FGGGTKLEIK

其中，CDR1氨基酸序列：QSVDYNGISF(SEQ ID NO:14)；

CDR2氨基酸序列：QAS(SEQ ID NO:15)；

CDR3氨基酸序列：MQSIEDPWT(SEQ ID NO:16)。

将上述抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列插入到表达载体中，重组表达，获得重组单克隆抗体。

实施例3、副溶血性弧菌多克隆抗体的制备

将纯化OMPK蛋白经皮下免疫注射2KG的新西兰大白兔，免疫6次，每次免疫间隔2周。首次免疫剂量1mg/只，后面5次免疫剂量500μg/只。最后一次免疫三天后检测兔子血清效价，当血清效价>100万时，从兔子耳缘静脉取外周血，血液冰箱放置过夜，3000g/min离心分离血清，取100μl血清ELISA实验分析其检测副溶血性弧菌的光谱性和特异性，其余血清冻存于-80℃冰箱。

实施例4、应用本发明的抗体进行副溶血性弧菌特异性检测

1、间接ELISA方法检测副溶血性弧菌

OD600为0.2的煮沸的副溶血性弧菌包被96孔酶标板过夜，1％的明胶封闭2小时，加入1:10000稀释的羊抗鼠二抗反应45min，显色，OD450读值，结果如表1。

表1

	OD450
		VP3	3.24
PBS	0.09

2、Sandwich ELISA方法检测副溶血性弧菌

将VP3单抗以生物素进行标记，获得生物素标记的VP3(VP3-biotin)。将该VP3-biotin作为检测抗体，将实施例3制备的OMPK多克隆抗体作为捕获抗体。针对待测样品，进行基于Sandwich ELISA方法的检测。

Sandwich ELISA结果显示，生物素标记的VP3(VP3-biotin)与OMPK多克隆抗体联合使用，检测副溶血性弧菌灵敏度高(+++，OD450>2.0)，如表2。

表2

	OMPK多克隆抗体
		VP3-biotin	+++

实施例5、抗体检测的交叉反应性

以副溶血性弧菌以及其它类型的菌株(表3)作为检测对象，测试本发明的抗体的交叉反应性。

将实施例3制备的OMPK多克隆抗体作为捕获抗体，将该VP3-biotin作为检测抗体，进行基于Sandwich ELISA方法的检测。

Sandwich ELISA结果显示，生物素标记的VP3(VP3-biotin)与OMPK多克隆抗体进行检测，仅识别出副溶血性弧菌，与非副溶血性弧菌不发生交叉反应(++OD450>1.5，-OD450<0.1)。

表3(以下菌株购自中国微生物菌种保藏中心)

表3中的结果显示，不会与非副溶血性弧菌不发生交叉反应，导致假阳性出现。

实施例6、抗体检测的种内适用性鉴定

以6种副溶血性弧菌(表4)作为检测对象，测试本发明的抗体的交叉反应性；同时，以1株志贺邻单胞菌作为阴性参照。将实施例3制备的OMPK多克隆抗体作为捕获抗体，将该VP3-biotin作为检测抗体，进行基于Sandwich ELISA方法的检测。

Sandwich ELISA结果显示，生物素标记的VP3(VP3-biotin)可以和多克隆抗体联合应用检测多株副溶血性弧菌，在副溶血性弧菌中检测范围具有广谱性(+++OD450>2.0，++OD450>1.5，-OD450<0.1)，如表4。

表4

	VP3-biotin/多克隆抗体
		副溶血性弧菌CGMCC1.1614	+++
副溶血性弧菌CGMCC1.1615	++
		副溶血性弧菌CGMCC1.1616	+++
副溶血性弧菌ATCC17802	++
		副溶血性弧菌CICC10552	++
副溶血性弧菌CICC21618	++
		志贺邻单胞菌ATCC 51903	-

实施例7、食品检测应用

称取25g三文鱼，在无菌条件下剪碎加入无菌袋，用均质仪拍打均匀后加入225mlLB培养基(含3％NaCl)。取副溶血性弧菌标准株ATCC17802，过夜培养后，稀释至10-100CFU接种到上述培养基中，37℃培养过夜，取1ML培养上清，收集细菌，加入1mL PBS煮沸；进行灵敏度检测。

Sandwich ELISA检测结果显示，生物素标记的VP3(VP3-biotin)和OMPK多克隆抗体联合应用检测副溶血性弧菌的灵敏度为10～100CFU/25g食品，如表5。

表5

10-100CFU/25g	+++
		PBS	-

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院

<120> 检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法

<141> 2019-11-21

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> VH 核酸()

<400> 1

gagggacgag tcgcatgctc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat tcttccggaa 60

ttccaggttc agctggagga gtcaggacct agcctcgtga aaccttctca gactctgtcc 120

ctcacctgtt ctgtcactgg cgactccatc accagtggtt ggtggaactg gatccggaaa 180

ttcccaggga ataaacttga gtacatgggg tacataagct acagtggtac ctcctactac 240

aatccatctc tcaaaagtcg aatctccatc actcgagaca catccaagaa ccagtactac 300

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagatatagc 360

ggggacgacg ggcggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420

aaaacaacac ccccatcagt ctatccactg gcccctagat cttccaatca ctagtgaatt 480

cgcggccgcc tgcaggtcga ccatatggga gagctcccaa cgcgttggat gcatagcttg 540

agtattctat agtgtcacct aaatagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 600

tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 660

gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 720

ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cat 753

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> VH 氨基酸()

<400> 2

Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Trp Trp

20 25 30

Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met Gly Tyr

35 40 45

Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Trp Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg

50 55 60

Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu

65 70 75 80

Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr

85 90 95

Ser Gly Asp Asp Gly Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 375

<212> DNA

<213> VL核酸()

<400> 3

gggaattcga tattgtgctg acccaatcta cagcttcttt ggctgtgtct cgaggacaga 60

gagccactat cttctgcaga gccagtcagt ctgtcgatta taatggaatt agtttcatgc 120

actggctcca acagaaacca ggacagccac ccaaactcct catctatcag gcatccaacc 180

tagaatctgg gatccctgcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca 240

acatccatcc tgtggaggag gaagatgctg caacctatta ctgtatgcaa agtattgagg 300

atccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa 360

ctgtatccag atcta 375

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> VL 氨基酸()

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Ala Ser Leu Ala Val Ser Arg Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Phe Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> CDR1核苷酸()

<400> 5

ggcgactcca tcaccagtgg ttgg 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> CDR2核苷酸()

<400> 6

ataagctaca gtggtacctc c 21

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> CDR3核苷酸()

<400> 7

gcaagatata gcggggacga cgggcggttt gcttac 36

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> CDR1氨基酸()

<400> 8

Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Trp

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> CDR2氨基酸()

<400> 9

Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Trp

1 5

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> CDR3氨基酸()

<400> 10

Ala Arg Tyr Ser Gly Asp Asp Gly Arg Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> VL-CDR1核苷酸()

<400> 11

cagtctgtcg attataatgg aattagtttc 30

<210> 12

<211> 9

<212> DNA

<213> VL-CDR2核苷酸()

<400> 12

caggcatcc 9

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> VL-CDR3核苷酸()

<400> 13

atgcaaagta ttgaggatcc gtggacg 27

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> VL-CDR1氨基酸()

<400> 14

Gln Ser Val Asp Tyr Asn Gly Ile Ser Phe

1 5 10

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> VL-CDR2氨基酸()

<400> 15

Gln Ala Ser

1

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> VL-CDR3氨基酸()

<400> 16

Met Gln Ser Ile Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

Claims (9)

1.一种结合分子，包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8所示的重链CDR1，SEQ ID NO:9所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3，SEQ ID NO:14所示的轻链CDR1，SEQ IDNO:15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:16所示的轻链CDR3。

2.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的结合分子，其特征在于，包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

4.权利要求1-3任一所述的结合分子在制备用于检测副溶血性弧菌的试剂中的用途。

5.一种免疫辍合物，其特征在于，所述的免疫辍合物包括：

权利要求1-3任一所述的结合分子；以及与所述结合分子连接的可检测标记物。

6.一种用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其包括权利要求1-3任一所述的结合分子或权利要求5所述的免疫辍合物。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：捕获抗体，其为抗副溶血性弧菌外膜蛋白K的多克隆抗体。

8.一种检测副溶血性弧菌的方法，利用所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测权利要求1-3任一所述的结合分子或权利要求5所述的免疫辍合物与待测样品的结合情况，获得副溶血性弧菌的存在情况以及存在量。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括，

(1)以多克隆抗体作为捕获抗体，捕获副溶血性弧菌；

(2)以权利要求1-3任一所述的结合分子或权利要求5所述的免疫辍合物作为检测抗体进行特异性检测，获得副溶血性弧菌的存在情况以及存在量。

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