KR101736420B1 - 파툴린 특이적인 항체 및 이를 이용한 파툴린의 검출 방법 - Google Patents

파툴린 특이적인 항체 및 이를 이용한 파툴린의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파툴린에 대한 높은 친화력을 가져 특이적으로 인식할 수 있는 파툴린 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이들을 포함하는 파툴린 검출용 조성물 및 이들을 이용한 파툴린 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 파툴린 특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 파아지 디스플레이법에 의해 제조된 것으로, 종래 하이브리도마법에 의해 제조된 항체들에 비해 탁월한 파툴린에 대한 친화력을 가지는 것으로, 이를 이용하는 경우 종래 검출이 어려웠던 곰팡이 독소인 파툴린의 검출에 매우 유용하게 응용될 수 있다.

Description

파툴린 특이적인 항체 및 이를 이용한 파툴린의 검출 방법{Patulin-specific antibody and method for detecting patulin using the same}
본 발명은 파툴린에 특이적인 항체 및 이를 이용하는 파툴린의 검출 방법에 관한 것이다.
곰팡이 독소(mycotoxin)는 곰팡이가 생산하는 2차 대사산물로 오염된 농산물 및 식품을 통하여 미량으로도 인간과 가축에게 독성과 암 유발원, 변이 유발원 등으로서 직접적인 위해 작용을 일으킬 뿐만 아니라 일부 독소들은 축산식품의 조직이나 우유 등에 잔존하여 인간에게 2차적인 위해를 일으킬 가능성이 큰 물질이다.
이러한 곰팡이 독소는 농산물의 생육기간 및 저장, 유통 중에 곰팡이에 의해서 생성되는데, 곰팡이 독소 생성은 온도, 습도와 같은 환경적 요인에 의해 영향을 받으며, 일단 생성된 독소는 열에 안정하여 조리나 가공 후에도 분해되지 않는 특성이 있다. 자연계에는 수만 종의 곰팡이가 존재하여 300여종 이상의 곰팡이 독소를 생성하는데, 이들 중 식품 및 사료 등에 오염되어 잠재적으로 사람의 건강에 유해한 영향을 줄 수 있는 곰팡이 독소는 약 10 내지 20 종류이다. 농산물에서 곰팡이 독소 오염은 완전히 피할 수 없으며, FAO에 의하면, 세계 농작물의 25% 이상이 곰팡이 독소에 감염되어 있다고 보고되어 있다.
이와 관련하여, WHO 등에서는 식품관련 위해 요소 중 식품첨가물이나 잔류농약보다 오히려 이러한 곰팡이 독소의 위험성이 더 높은 것으로 평가하고 있고(Mycotoxins in food, Ed. N. Magan and M. Olsen, Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC (2004)), 국제적으로 99개국 이상에서 아플라톡신(aflatoxins), 파툴린(patulin), 오크라톡신 A(ochratoxin A, OTA), 데옥시니발레놀(deoxynivalenol), 푸모니신(fumonisines), 제랄레논(zearalenone), T-2 toxin, 스테리그마토시스틴(sterigmatocystin), HT-2 toxin, 디아세톡시시르페놀(diacetoxyscirpenol), 맥각 알칼로이드(ergot alkaloids), 포몹신(phomopsins), 아가르산(agaric acid) 등 십여 종을 규제하고 있으며, 우리나라도 현재 아플라톡신, 파툴린, 푸모니신, 오크라톡신, 데옥시니발레놀, 제랄레논을 농식품 및 사료에서 규제하고 있다.
곰팡이 독소 중 파툴린은 독소 생성 곰팡이인 페니실리움 파툴럼(Penicillium patulum)에서 이름이 명명되었고 1986년 이후부터　파툴린을 생성하는 다른 속의 균들이 추가적으로 등록되었다. 파툴린은 초기 연구에서는 일부 세균에 대한 항생제로 작용하는 것으로 밝혀졌으나, 이후에는 동물과 사람에 대한 독성도 매우 강한 것으로 보고되었고, 랫트(Rat)에서 피하주사에 의한 파툴린의 LD50은 15 내지 20 mg/kg 이며, 피하 육종(肉腫)을 유발하기도 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 사람에게 발암성을 나타낸 뚜렷한 결과는 없어, 현재 IARC(The International Agency for Research on Cancer)는 파툴린을 인체 발암 물질로 분류할 수 없는 Group 3으로 분류하고 있는 상황이다.
이러한 파툴린은 폴리케타이드 락톤(polyketide lactone)으로 P. expansum, P. patulum 등을 포함한 Penicillium 속 곰팡이와 Aspergillus clavatus 등의 Aspergillus 속 및 Byssochlamys 속 균들에 의해 생성된다. 파툴린이 가장 흔히 발견되는 식품은 사과이며 배, 포도와 다른 과일을 포함한 상한 과일류와 상한 과일류로 제조된 쥬스와 과일 가공품에서 발견되고 있고, 또한 채소류, 곡류와 사일로에 저장된 사료에서 때때로 파툴린 오염이 보고되고 있다. 사과 쥬스에서의 파툴린 생성균은 주로 P. expansum으로 알려져 있다.
일반적으로 보고된 파툴린의 독성은 중간 정도의 세포독성, DNA손상, 면역억제 작용과 최기형성 등이고, 동물시험에서 꾸준히 보고되고 있는 급성 독성증세는 초조, 일부의 경우 경련, 호흡곤란, 폐울혈, 부종, 궤양형성, 충혈과 내장의 팽창 등이다. 실제로 낮은 농도로 지속적으로 파툴린에 노출될 수 있으므로 사람에게도 같은 현상을 일으킬 가능성이 있다.
우리나라에서는 식품위생법 제 13조 1항에 의거하여 곰팡이 독소를 위해 평가 대상으로 지정하여 관리하고 있으며 그 중, 파툴린 기준은 사과 및 사과주스, 사과주스 농축액에 대해 50 μg/kg 이하로 규제하고 있다. 이와 관련하여, 식품공전 제 10-6의 "식품 중 자연독소 시험법 6.1 곰팡이 독소"에 등재된 방법인 HPLC 등을 이용한 기기분석법은 시료의 전처리 컬럼과 분석기기를 사용하여 곰팡이 독소를 분석하는 방법이다. 그 중 오크라톡신 A, 데옥시니발레놀, 제랄레논은 항체를 이용한 전처리 컬럼을 사용하는데, 파툴린의 경우 이에 대한 우수한 항체가 개발이 되지 않아 항체를 이용한 전처리 컬럼이 없는 상황이므로 HPLC만을 이용하여 분석하는 방법이 등재되어 있다. 그러나, 파툴린의 경우에도 전처리 컬럼을 사용하게 된다면 분석의 정확성 및 편리성을 증대시킬 수 있게 될 것이다.
이러한 파툴린의 분석과 관련하여, 파툴린의 분자량은 154.13으로 다른 곰팡이 독소와 비교하여 작기 때문에, 동물 면역을 위하여 캐리어 단백질(carrier protein)에 컨주게이션(conjugation) 하는 것이 필요하다. 그러나 파툴린의 화학구조상 직접적인 컨주게이션이 불가능하기 때문에 화학 구조에 변형을 주어 컨주게이션을 해야 하는데, 이렇게 파툴린 자체가 아닌 변형된 형태로 캐리어 단백질에 컨주게이션된 경우 동물 면역을 하더라도, 파툴린에 대한 항체가 아닌 파툴린과 캐리어 단백질을 연결하는 링커, 또는 컨주게이트 자체에 결합하는 항체가 주요 비율을 차지할 가능성이 크기 때문에, 파툴린 자체에 대한 항체 생성이 어려워진다. 이와 같은 여러 가지 문제로 파툴린에 대한 우수한 항체는 아직 개발되어 있지 않은 상태이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자는 기존의 파툴린 검출 방법상의 단점을 극복할 수 있는 새로운 방법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 신규한 파툴린 특이적인 항체 제조하였으며, 이러한 파툴린 특이적인 항체가 파툴린에 대하여 높은 결합 친화도를 가져 파툴린의 검출에 우수한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 파툴린에 대해 높은 친화력을 갖는 파툴린 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 파툴린 특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 이용하여 파툴린을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 파툴린에 대한 높은 친화력을 가져 특이적으로 인식할 수 있는 파툴린 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 파툴린 특이적 항체는 이하와 같이 특정 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이다.
본원에서 용어, "가변 영역"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변 영역에는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2, LCDR3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당 업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편일 수 있다. 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
구체적으로, 바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 파툴린 특이적인 항체는 서열번호 1 의 아미노산 서열(GFNIKDTYIH)로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2 의 아미노산 서열(RIYPTNGYTRYADSVKG)로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열(GRLHRRRHKFDY)로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 4의 아미노산 서열(RASQDVNTAVA)로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열(SASFLYS)로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열(QQHYTTPPT)로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 중쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 19번(GGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCAC), 중쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 20번(CGGATCTACCCTACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCCGTGAAGGGC), 중쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 21번(GGTCGTCTGCATCGTCGTCGTCATAAATTCGACTAC)의 핵산 서열로 암호화될 수 있고, 경쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 22번(CGGGCCTCCCAGGACGTGAACACCGCCGTGGCC), 경쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 23번(TCCGCCTCCTTCCTGTACTCC), 경쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 24번(CAGCAGCACTACACCACCCCTCCTACC)의 핵산 서열로 암호화될 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 파툴린 특이적인 항체를, 본 명세서에는 "클론 10"로 명명하기로 한다.
또한, 바람직한 또 하나의 양태로서, 본 발명의 파툴린 특이적인 항체는 서열번호 7 의 아미노산 서열(GFSFSDRGMH)로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열(SISGGSRYTGYGSAVKG)로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열(AAYRTTWGTIDE)로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 10의 아미노산 서열(SGGGRWYG)로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열(ANTKRPS)로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열(GSFDSSSGAGI)로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 중쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 25번(GGGTTCTCCTTCAGTGACCGTGGCATGCAC), 중쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 26번(AGTATTAGTGGTGGTAGTAGATACACAGGCTACGGGTCGGCGGTGAAGGGC), 중쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 27번(GCTGCTTATAGGACTACTTGGGGTACTATCGACGAA)의 핵산 서열로 암호화될 수 있고, 경쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 28번(TCCGGGGGTGGCAGGTGGTATGGC), 경쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 29번(GCTAACACCAAGAGACCCTCG), 경쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 30번(GGGAGCTTCGACAGCAGCAGTGGTGCTGGTATA)의 핵산 서열로 암호화될 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 파툴린 특이적인 항체를, 본 명세서에는 "클론 11"로 명명하기로 한다.
나아가, 바람직한 또 하나의 양태로서, 본 발명의 파툴린 특이적인 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열(GFTFSSYAMH)로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열(GIGSSGSSTYYGAAVKG)로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열(AAGGYCGWGVNRSVYSCAAYTAGSIDA)로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 10의 아미노산 서열(SGGGRWYG)로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열(ANTKRPS)로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열(GSFDSSSGAGI)로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 중쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 31번(GGGTTCACCTTCAGCAGTTACGCCATGCAC), 중쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 32번(GGTATTGGCAGCAGTGGTAGTAGCACATACTACGGGGCGGCGGTGAAGGGC), 중쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 33번(GCTGCTGGTGGTTACTGTGGTTGGGGTGTTAATCGTAGTGTTTACAGTTGTGCTGCTTATACTGCTGGTAGCATCGACGCA)의 핵산 서열로 암호화될 수 있고, 경쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 28번(TCCGGGGGTGGCAGGTGGTATGGC), 경쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 29번(GCTAACACCAAGAGACCCTCG), 경쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 30번(GGGAGCTTCGACAGCAGCAGTGGTGCTGGTATA)의 핵산 서열로 암호화될 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 파툴린 특이적인 항체를, 본 명세서에는 "클론 13"으로 명명하기로 한다.
또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명의 파툴린 특이적인 항체는 서열번호 16 의 아미노산 서열(GFTFSDRGMH)로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 아미노산 서열(GISSSGRYTYYAPAMKG)로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열(DYDTGGWNAGRIDA)로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 10의 아미노산 서열(SGGGRWYG)로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열(ANTKRPS)로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열(GSFDSSSGAGI)로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 중쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 34번(GGGTTCACCTTCAGTGACCGTGGCATGCAC), 중쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 35번(GGTATTAGCAGCAGTGGTAGATACACATACTACGCGCCGGCGATGAAGGGC), 중쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 36번(GATTATGATACTGGTGGTTGGAATGCTGGTAGGATCGACGCA)의 핵산 서열로 암호화될 수 있고, 경쇄 CDR1의 아미노산은 서열번호 28번(TCCGGGGGTGGCAGGTGGTATGGC), 경쇄 CDR2의 아미노산은 서열번호 29번(GCTAACACCAAGAGACCCTCG), 경쇄 CDR3의 아미노산은 서열번호 30번(GGGAGCTTCGACAGCAGCAGTGGTGCTGGTATA)의 핵산 서열로 암호화될 수 있다.
상기와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 특정되는 파툴린 특이적인 항체를, 본 명세서에는 "클론 14"로 명명하기로 한다.
상기 항체는 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
상기 항체 또는 이들의 항원 결합 단편들은 파툴린에 특이적으로 결합할 수 있으므로 파툴린을 인지하여 이를 검출하는데 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 파툴린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 파툴린 검출용 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 파툴린 검출 방법에 관한 것이다.
상기 검출용 조성물은 파툴린에 특이적인 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신,이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다.
리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는
3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
한편, 상기 검출용 조성물은 검출의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다 (Antibodies: A Labotory Manual, Harlow＆Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
바람직하게는, 상기 검출용 조성물은 검출용 키트, 마이크로어레이, 단백질 칩의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트로는 예를 들면, 샘플 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 샘플에 적용되는 샘플패드 (sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 샘플이 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 파툴린 특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 파아지 디스플레이법에의해 제조된 것으로, 종래 하이브리도마법에 의해 제조된 항체들에 비해 탁월한 파툴린에 대한 친화력을 가지는 것으로, 이를 이용하는 경우 종래 검출이 어려웠던 곰팡이 독소인 파툴린의 검출에 매우 유용하게 응용될 수 있다.
도 1은 Pat-HG 햅텐의 화학적 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 Pat-HG 햅텐의 생성여부를 확인한 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 파툴린에 대한 결합력을 나타내는 클론들의 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 시판되는 토끼 면역 폴리클로날 항체인 ABIN343806과 본 발명에 따른 선별된 클론들과의 A. direct ELISA 및 B. ic ELISA 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 완전항체로 개발한 본 발명에 따른 클론들의 A. direct ELISA 및 B. ic ELISA 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 실시예 1: 파툴린 헤미글루타레이트 ( Patulin hemiglutarate ) 제작
파툴린은 그 화학구조상 캐리어 단백질(carrier protein)으로 사용하는 BSA에 결합이 어려우므로 파툴린 헤미글루타레이트(Pat-HG) 형태로 변형시켜야 하므로, 이를 제작하였다. 구체적으로, 총 5 mg의 파툴린을 1 ml anhydrous pyridine에 녹인 후 5.5 mg의 glutaric anhydride를 첨가하고 상온에서 밤새 교반하였다. Pat-HG conjugate는 클로로포름을 이용하여 liquid-liquid 방법으로 추출하였다. 즉, Pat-HG가 포함되어 있는 액체 시료에 클로로포름를 첨가한 후, 충분한 시간 동안 교반하여 원심분리하였고 상층액(클로로포름층)을 새 용기에 옮긴 후 클로로포름을 증발시켰다. 농축시킨 용기에 소량의 용매를 가하여 재용해 하였다. Pat-HG은 도 1과 같은 화학 구조를 갖는데, 그 생성여부는 1H-NMR을 통하여 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 하기 표 1에서 파툴린과 Pat-HG 햅텐의 화학적 이동(chemical shifts (δppm))을 비교한 결과를 나타내었다.
　
Protons		 δppm in patulin
(Chemyshev　　 et al. 1988)		 　
δppm in Pat-HG hapten
H1a 4.76 4.75
H1b 4.41 4.47
H2 5.92 6.00
H6 6.05 6.05
H5 6.07 6.99
OH5 3.19 -
H9+H11 - 2.50
H10 - 2.00
H12 - -
2. 실시예 2: 파툴린 양성 클론 스크리닝( Patulin positive clone screening )
2-1) 파툴린 면역 라이브러리 제작
A. Pat - HG - BSA 면역 및 cDNA 라이브러리 제작
파툴린에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 동물에 항원을 면역한 면역세포로부터 mRNA를 얻은 후 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 통해 항체 유전자를 증폭시키고 파아지 디스플레이를 위한 벡터 내로 클로닝하는 방식으로 수행되었다.
구체적으로, 화이트 레그혼종의 닭 3마리에 Pat-HG-BSA를 완전 프로인트 보강제(complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 보강제(Sigma, 미국)와 혼합하여 3주 간격으로 4회 피하 주사하였다. 면역한 동물의 혈청을 얻은 후, 3% 우혈청알부민 (bovine serum albumin)을 포함하는 인산완충용액를 이용하여 1:100, 1:500, 1:2500 및 1:12500, 1:62500의 농도로 희석하였고, Pat-HG-BSA 의 결합여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. ELISA 플레이트에 Pat-HG-BSA 1 ug/ml을 4℃에서 각각 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. PBST(0.5% tween-20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 항-닭 면역글로블린-HRP(horse radish peroxidase)(1:3000)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척하였고 ABTS(Amresco, 미국)을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청 대비 면역 후 Pat-HG-BSA 와 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.
마지막 주사 후 5일 후에 선별된 닭의 골수, 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 조직을 10ml TRI 시약(Invitrogen, 미국)과 혼합하여 호모게나이저로 분쇄한 후 20ml TRI 시약을 추가한 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모-3-클로로프로판(1-bromo-3-chloropropane, BCP) 3ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이소프로판올 15ml로 전체 RNA를 침전시켜 얻었다. Oligo dT를 프라이머로 이용하여 프라임스크립트 전사 시스템(Takara, 일본)을 이용하여 역전사 반응(65℃에서 5분; 4℃에서 5분; 42℃에서 50분; 95℃에서 5분; 및 4℃)을 수행하였다. 역전사 반응의 결과물인 cDNA를 포함하는 반응액 2μl를 1% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동 후 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다.
B. 면역 항체 유전자 증폭
닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 VH와 VL 도메인을 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 반응은 상기 항목 A에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여, VH와 VL 도메인을 먼저 증폭하고 이들 각각을 정제 후 PCR을 통해 scFv(single chain Fv)를 제작하였다. cDNA 라이브러리 0.5ul, VH와 VL 도메인에 대한 각각의 30 pmole 순방향 및 역방향 프라이머(표 2), 5x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시킨 후, 94℃에서 15초, 65℃에서 5초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 과정을 25 사이클 반복하였다. PCR 증폭된 항체 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, LaboPass, 한국)를 이용하여 정제하였다.
scFv DNA를 얻기 위해, 정제된 VH 50ng, VL 50ng DNA를 주형으로 하여 30 pmole scFv 순방향 및 역방향 프라이머(표 2), 5x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시키고, 94℃에서 30초, 65℃에서 5초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 과정을 25사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, LaboPass, 한국)를 이용하여 정제하였다.
PCR 반응에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
VH 정방향 GGT CAG TCC TCT AGA TCT TCC GGC GGT GGT GGC AGC TCC GGT GGT GGC GGT TCC GCC GTG ACG TTG GAC GAG 37
역방향 CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GGA GAC GAT GAC TTC GGT CC 38
VL 정방향 GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TC 39
역방향 GGA AGA TCT AGA GGA CTG ACC TAG GAC GGT CAG G 40
scFv 정방향 GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG 41
역방향 GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GG 42
2-2) 합성 항체 라이브러리 제작
A. 합성 항체 유전자 증폭
현재 치료용으로 사용되고 있는 항체의 backbone에 HCDR3 부분의 아미노산을 다양화시킨 합성항체 라이브러리를 제작하였다. HCDR3의 아미노산 길이는 12개이며 아미노산의 다양성은 올리고뉴클레오타이드를 복잡화시키는 NNK (N = A, T, G, C, K = G 또는 T) 도입방법을 통해 확보하였다. HCDR3가 다양화된 항체유전자 증폭과 HCDR3 이외의 항체유전자 부분은 표 3의 프라이머를 통해 상기의 PCR조건을 통하여 증폭하였고 각각의 PCR product를 overlap PCR을 통하여 HCDR3가 다양화된 scFv 항체 유전자를 제작하였다.
PCR 반응에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
HCDR3 정방향 GTG TAC TAC TGT AGT AGA NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK TGG GGC CAG GGC ACA CTA 43
역방향 CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG 44
LFR1-HFR3 정방향 GGC CCA GGC GGC CGA CAT CCA GAT GAC CCA G 45
역방향 TCT ACT ACA GTA GTA CAC 46
B. 항체 DNA 의 제한효소 절단
상기에서 제조된 scFv와 파지미드 벡터인 pComb3X(the Scripps Research Institute, CA, 미국)를 제한효소 SfiI (Roche, 미국)로 절단하였다.
scFv를 코딩하는 PCR 절편 10ug, 360 units SfiI (Roche, 미국), 20ul 10x 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤새 반응시켰다.
또한, pComb3X 벡터 20ug, 120 units SfiI 및 20ul 10x buffer를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 아가로스 젤에 전기영동한 후 겔 추출 키트(LaboPass, 한국)를 이용하여 정제하였다.
C. 항체 DNA 의 라이게이션 및 라이브러리의 제조
상기에서 제한효소 SfiI를 이용하여 절단한 scFv 절편 700ng 와 pComb3X 1.4ug을 혼합하고, T4 DNA 라이게이즈(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 16℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 라이게이션 혼합물을 에탄올 침강법으로 정제하고, 대장균 ER2738(New England Biolab, 미국)에 전기 천공법(electroporation)으로 형질전환시켜 50ug/ml 카베니실린 및 70ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 1x109 complexity를 가진 라이브러리를 제작하여 이용하였다.
D. Patulin 에 결합하는 항체 선별
먼저, 마그네틱 비드에 Pat-HG-BSA 5μg을 컨쥬게이션시켰다.
제작한 라이브러리와 마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 Pat-HG-BSA를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 patulin에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후, 이를 PBST로 세척하고, 50 μM free patulin을 이용하여 경쟁적으로 용출하였다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝(panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다. 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝(panning)을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수가 증가하여 결합력이 높은 파아지를 축적하였다.
3차와 4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 200개의 클론을 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린, 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지(1:1000)를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다.
상기에서 수득한 배양액을 원심분리를 이용해 파아지를 포함한 배지 상등액을 얻어 Pat-HG-BSA가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-M13 항체를 이차항체로 이용하여 patulin에 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다. 시험 결과, 실시예 2에서 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, clone 10, 11, 13, 14는 파툴린에 대한 매우 강한 결합력을 나타내었고 background signal도 거의 없음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
E. 선별된 항체의 시퀀싱
선별한 Pat-HG-BSA에 양성 시그날을 나타내는 클론을 가지고 있는 ER2738을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 얻는다. DNA 미니 프렙 키트(LaboPass, 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결정을 위해 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 시퀀싱 프라이머 서열번호 47(정방향) 및 48(역방향)의 프라이머를 이용하였고, 그 결과를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.
scFv 시퀀싱 프라이머
정방향(서열번호 47) AAT TCA GGA GG
역방향(서열번호 48) TGA CCG AAA ATG CCG
선별된 항체의 중쇄 CDR 아미노산 서열
HCDR1 HCDR2 HCDR3
클론 10 GFNIKDTYIH
(서열번호 1)		 RIYPTNGYTRYADSVKG
(서열번호 2)		 GRLHRRRHKFDY
(서열번호 3)
클론 11 GFSFSDRGMH
(서열번호 7)		 SISGGSRYTGYGSAVKG
(서열번호 8)		 AAYRTTWGTIDE
(서열번호 9)
클론 13 GFTFSSYAMH
(서열번호 13)		 GIGSSGSSTYYGAAVKG
(서열번호 14)		 AAGGYCGWGVNRSVYSCAAYTAGSIDA
(서열번호 15)
클론 14 GFTFSDRGMH
(서열번호 16)		 GISSSGRYTYYAPAMKG
(서열번호 17)		 DYDTGGWNAGRIDA
(서열번호 18)
선별된 항체의 경쇄 CDR 아미노산 서열
LCDR1 LCDR2 LCDR3
클론 10 RASQDVNTAVA
(서열번호 4)		 SASFLYS
(서열번호 5)		 QQHYTTPPT
(서열번호 6)
클론 11 SGGGRWYG
(서열번호 10)		 ANTKRPS
(서열번호 11)		 GSFDSSSGAGI
(서열번호 12)
클론 13 SGGGRWYG
(서열번호 10)		 ANTKRPS
(서열번호 11)		 GSFDSSSGAGI
(서열번호 12)
클론 14 SGGGRWYG
(서열번호 10)		 ANTKRPS
(서열번호 11)		 GSFDSSSGAGI
(서열번호 12)
3. 실시예 3: 파툴린에 대한 결합력 확인
파툴린에 결합하는 클론의 파툴린 자체에 대한 특이성을 확인하기 위하여, 실시예 2에서 선별한 5종의 클론 중 결합력이 우수한 clone 10, 11, 13, 14를 시판되고 있는 파툴린 폴리클로날 토끼 면역 혈청인 ABIN343806(antibodies-online, 독일)를 대조군으로 하여 direct ELISA와 ic ELISA를 진행하였다.
구체적으로, direct ELISA의 경우, Clone 10, 11, 13, 14의 파아지를 포함한 배지 상등액과 ABIN343806를 Pat-HG-BSA가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였으며, Clone 10, 11, 13, 14의 경우 HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-M13 항체를 이차항체로, ABIN343806의 경우 HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-Rabbit 항체를 이차항체로 이용하여 patulin에 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다.
ic ELISA는 clone을 patulin과 순차적 농도 (1 M, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0.1 μM) 로 반응시킨 후, Pat-HG-BSA가 coating 된 enzyme immunoassay(EIA) plate에 반응을 진행한 patulin과 clone 결합체를 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. Clone 10, 11, 13, 14의 경우 HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-M13 항체를 이차항체로, ABIN343806의 경우 HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-Rabbit 항체를 이차항체로 이용하여 Patulin과 클론이 반응할 때, 클론의 특이성이 높아 patulin과 결합하게 되면 Pat-HG-BSA에 대한 ELISA signal이 낮아지는 것을 이용하여 결합력을 확인하였다.
그 결과, 도 4의 패널 A에서 확인할 수 있는 바와 같이, ABIN343806은 PHG-BSA에서 뿐 아니라 BSA자체에 대해서도 반응성이 높음에 반해, 반면에 선별한 clone들은 BSA에 대한 반응성을 거의 나타내지 않은데 반해, PHG-BSA에서 반응성이 매우 높으므로 선별된 본 발명에 따른 항체인 clone 10, 11, 13, 14는 Pat-HG에 대한 특이성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, Clone 10, 11, 13, 14의 patulin에 대한 특이성을 확인하기 위하여 free patulin을 이용하여 ic ELISA를 진행한 결과, 선별한 clone들은 free patulin과 반응하였을 때, ABIN343806에 비해 ELISA signal이 낮아지는 폭이 큰 것을 볼 수 있었는바, 이 또한 clone 10, 11, 13, 14의 파툴린 자체에 대한 특이성이 매우 우수함을 확인할 수 있는 것이다(도 4의 패널 B 참조).
4. 실시예 4: 선별한 클론의 완전항체 전환 및 발현/정제
상기 실시예 2에 따라 선별된 항체인 클론 10, 11, 13, 14는 ScFv 형태이므로 이하에서는 이들을 완전항체 전환시키는 과정을 거쳐 full IgG 형태로 개발하여 항체의 파툴린에 대한 결합력 direct ELISA와 ic ELISA를 통하여 확인하고자 하였다. 먼저 scFv를 포함하는 pComb3x로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 7의 프라이머 조합을 이용해서 실시예 2와 같은 조건의 PCR을 통해 수득하였다.
각 항체의 가변영역과 불변영역을 하기 표 7의 HC 및 LC 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 각각 중쇄와 경쇄를 얻어냈고, pcDNA3.3TM-TOPO®A 클로닝 키트 및 pOPTIVECTM-TOPO®A 클로닝 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 각 벡터(pcDNA3.3TM-TOPO®벡터와 pOPTIVECTM-TOPO®벡터) 1ul와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM MgCl2이 포함된 완충액에 총 6ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. DH 5α 대장균 competent cell에 열충격을 가하여 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다.
상기에서 제조된 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질감염시킨 후, 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A 컬럼 (GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체(IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH3.0)로 용출하였다. SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다.
프라이머 서열 서열번호
VH 정방향1* GCT AGC CGC CAC CAT GGG CTG GTC CTG CAT CAT CCT GTT CCT GGT GGC CAC CGC CAC CGG CGC CGT GAC GTT GGA CGA G 49
정방향2# GCT AGC CGC CAC CAT GGG CTG GTC CTG CAT CAT CCT GTT CCT GGT GGC CAC CGC CAC CGG CGA GGT GCA GCT GGT GGA G 50
역방향1* AGG GGC CCT TGG TGG AGG CGG AGG AGA CGA TG 51
역방향2# AGG GGC CCT TGG TGG AGG CGG AGG ACA CGG TC 52
CH 정방향 gcc tcc acc aag ggc ccc t 53
역방향 GGA TCC CTT GCC GGC CGT CGC ACT CAC TT 54
HC 정방향 GCT AGC CGC CAC CAT GGG 55
역방향 GGA TCC CTT GCC GGC CGT CGC ACT CAC TT 56
VL 정방향1* AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGC TGG TCC TGC ATC ATC CTG TTC CTG GTG GCC ACC GCC ACC GGC CTG ACT CAG CCG TCC TCG 57
정방향2# AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGC TGG TCC TGC ATC ATC CTG TTC CTG GTG GCC ACC GCC ACC GGC GAC ATC CAG ATG ACC CAG 58
역방향1* GGG GGC GGC CAC GGT CCG TAG GAC GGT CAG GGT TG 59
역방향2# GAG GGG GCG GCC ACG GTC CGC TTG ATC TCC ACC TTG GTA CCC TG 60
Ck 정방향 CGG ACC GTG GCC GCC CCC 61
역방향 TCT AGA CTA GCA CTC GCC 62
LC 정방향 AAG CTT GCC GCC ACC ATG 63
역방향 TCT AGA CTA GCA CTC GCC 64
(*닭-인간 카이메릭 완전항체 클로닝시 사용되는 프라이머
#인간 완전항체 클로닝시 사용되는 프라이머)
5. 실시예 5: 완전항체의 결합력 확인
상기 실시예 4에서 제작한 완전항체의 파툴린에 대한 결합력을 direct ELISA와 ic ELISA 법을 이용하여 확인하였다.
Direct ELISA는 50 μL의 PBS에 1 ug/ml Pat-HG-BSA를 희석하여 96웰 면역 플레이트(Corning, 미국)에 넣고, 4℃에서 보관하여 밤새 흡착시켰다. 3% 우혈청 알부민(Sigma, 미국)이 포함된 완충용액으로 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.5% Tween 20이 포함된 완충용액으로 3회 세척하고, 순차적 농도(0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100nM)로 희석한 각각의 항체를 웰 당 50μL씩 처리하였다. 항원에 항체가 결합할 수 있도록 상온에서 2시간 반응시킨 후, 완충용액으로 3회 세척하였다.
항-인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체(Jackson, USA)를 1:3000으로 희석하여 웰 당 50 μL씩 처리한 후, 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 완충 용액으로 3회 세척한 후, ABTS 50 μL씩 넣고 20분간 발색시켰다. 분광 광도계(Biotek, 미국)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 5A에 나타내었다.
ic ELISA는 상기 실시예 3에 기술한 방법과 동일하게 진행하였다. 2차 항체로 항-인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체(Jackson, USA)를 이용하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 선별된 항체들은 완전항체로 개발된 이후에도 네 clone 모두 파툴린에 대해 우수한 결합력을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
이상과 같이, 파아지디스플레이를 통해 선별한 본 발명에 따른 파툴린 특이적인 항체는 파툴린에 대해 우수한 결합력을 나타냄을 확인할 수 있고, 파아지디스플레이를 통해 제작된 항체는 독소 검사에 있어 전처리 컬럼의 제작이나 새로운 검사 방법의 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
<110> THE HLAB CO., LTD. <120> Patulin-specific antibody and method for detecting patulin using the same <130> DPP20147374KR <160> 64 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 10 <400> 1 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 10 <400> 2 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 10 <400> 3 Gly Arg Leu His Arg Arg Arg His Lys Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of clone 10 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of clone 10 <400> 5 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of clone 10 <400> 6 Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 11 <400> 7 Gly Phe Ser Phe Ser Asp Arg Gly Met His 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 11 <400> 8 Ser Ile Ser Gly Gly Ser Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 11 <400> 9 Ala Ala Tyr Arg Thr Thr Trp Gly Thr Ile Asp Glu 1 5 10 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of clone 11 <400> 10 Ser Gly Gly Gly Arg Trp Tyr Gly 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of clone 11 <400> 11 Ala Asn Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of clone 11 <400> 12 Gly Ser Phe Asp Ser Ser Ser Gly Ala Gly Ile 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 13 <400> 13 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 13 <400> 14 Gly Ile Gly Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Ala Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 13 <400> 15 Ala Ala Gly Gly Tyr Cys Gly Trp Gly Val Asn Arg Ser Val Tyr Ser 1 5 10 15 Cys Ala Ala Tyr Thr Ala Gly Ser Ile Asp Ala 20 25 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 14 <400> 16 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg Gly Met His 1 5 10 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 14 <400> 17 Gly Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Ala Pro Ala Met Lys 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 14 <400> 18 Asp Tyr Asp Thr Gly Gly Trp Asn Ala Gly Arg Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 10 <400> 19 ggcttcaaca tcaaggacac ctacatccac 30 <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 10 <400> 20 cggatctacc ctaccaacgg ctacaccaga tacgccgact ccgtgaaggg c 51 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 10 <400> 21 ggtcgtctgc atcgtcgtcg tcataaattc gactac 36 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of clone 10 <400> 22 cgggcctccc aggacgtgaa caccgccgtg gcc 33 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of clone 10 <400> 23 tccgcctcct tcctgtactc c 21 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of clone 10 <400> 24 cagcagcact acaccacccc tcctacc 27 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 11 <400> 25 gggttctcct tcagtgaccg tggcatgcac 30 <210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 11 <400> 26 agtattagtg gtggtagtag atacacaggc tacgggtcgg cggtgaaggg c 51 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 11 <400> 27 gctgcttata ggactacttg gggtactatc gacgaa 36 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of clone 11 <400> 28 tccgggggtg gcaggtggta tggc 24 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of clone 11 <400> 29 gctaacacca agagaccctc g 21 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of clone 11 <400> 30 gggagcttcg acagcagcag tggtgctggt ata 33 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 13 <400> 31 gggttcacct tcagcagtta cgccatgcac 30 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 13 <400> 32 ggtattggca gcagtggtag tagcacatac tacggggcgg cggtgaaggg c 51 <210> 33 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 13 <400> 33 gctgctggtg gttactgtgg ttggggtgtt aatcgtagtg tttacagttg tgctgcttat 60 actgctggta gcatcgacgc a 81 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of clone 14 <400> 34 gggttcacct tcagtgaccg tggcatgcac 30 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of clone 14 <400> 35 ggtattagca gcagtggtag atacacatac tacgcgccgg cgatgaaggg c 51 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of clone 14 <400> 36 gattatgata ctggtggttg gaatgctggt aggatcgacg ca 42 <210> 37 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying VH domain of chicken antibody <400> 37 ggtcagtcct ctagatcttc cggcggtggt ggcagctccg gtggtggcgg ttccgccgtg 60 acgttggacg ag 72 <210> 38 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying VH domain of chicken antibody <400> 38 ctggccggcc tggccactag tggaggagac gatgacttcg gtcc 44 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying VL domain of chicken antibody <400> 39 gtggcccagg cggccctgac tcagccgtcc tcggtgtc 38 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying VL domain of chicken antibody <400> 40 ggaagatcta gaggactgac ctaggacggt cagg 34 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying scFv <400> 41 gaggaggagg aggaggaggt ggcccaggcg gccctgactc ag 42 <210> 42 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying scFv <400> 42 gaggaggagg aggaggagga gctggccggc ctggccacta gtggagg 47 <210> 43 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying HCDR3 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (36) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (37)..(38) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(41) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (42) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (48) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (51) <223> k is G or C <220> <221> misc_feature <222> (52)..(53) <223> n is A, T, G or C <220> <221> misc_feature <222> (54) <223> k is G or C <400> 43 gtgtactact gtagtagann knnknnknnk nnknnknnkn nknnknnknn knnktggggc 60 cagggcacac ta 72 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying HCDR3 <400> 44 caaaatcacc ggaaccagag 20 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying LFR1-HFR3 <400> 45 ggcccaggcg gccgacatcc agatgaccca g 31 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying LFR1-HFR3 <400> 46 tctactacag tagtacac 18 <210> 47 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv sequencing forward primer <400> 47 aattcaggag g 11 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv sequencing backward primer <400> 48 tgaccgaaaa tgccg 15 <210> 49 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 1 for amplifying VH domain of chicken-human chimeric full antibody <400> 49 gctagccgcc accatgggct ggtcctgcat catcctgttc ctggtggcca ccgccaccgg 60 cgccgtgacg ttggacgag 79 <210> 50 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 2 for amplifying VH domain of human full antibody <400> 50 gctagccgcc accatgggct ggtcctgcat catcctgttc ctggtggcca ccgccaccgg 60 cgaggtgcag ctggtggag 79 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer 1 for amplifying VH domain of chicken-human chimeric full antibody <400> 51 aggggccctt ggtggaggcg gaggagacga tg 32 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer 2 for amplifying VH domain of human full antibody <400> 52 aggggccctt ggtggaggcg gaggacacgg tc 32 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying CH domain of full antibody <400> 53 gcctccacca agggcccct 19 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying CH domain of full antibody <400> 54 ggatcccttg ccggccgtcg cactcactt 29 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying HC domain of full antibody <400> 55 gctagccgcc accatggg 18 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying HC domain of full antibody <400> 56 ggatcccttg ccggccgtcg cactcactt 29 <210> 57 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 1 for amplifying VL domain of chicken-human chimeric full antibody <400> 57 aagcttgccg ccaccatggg ctggtcctgc atcatcctgt tcctggtggc caccgccacc 60 ggcctgactc agccgtcctc g 81 <210> 58 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 2 for amplifying VL domain of human full antibody <400> 58 aagcttgccg ccaccatggg ctggtcctgc atcatcctgt tcctggtggc caccgccacc 60 ggcgacatcc agatgaccca g 81 <210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer 1 for amplifying VL domain of chicken-human chimeric full antibody <400> 59 gggggcggcc acggtccgta ggacggtcag ggttg 35 <210> 60 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer 2 for amplifying VL domain of human full antibody <400> 60 gagggggcgg ccacggtccg cttgatctcc accttggtac cctg 44 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying CK domain of full antibody <400> 61 cggaccgtgg ccgccccc 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying CK domain of full antibody <400> 62 tctagactag cactcgcc 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying LC domain of full antibody <400> 63 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying LC domain of full antibody <400> 64 tctagactag cactcgcc 18

Claims (11)

  1. 서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 파툴린 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 서열번호 7 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열)로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 파툴린 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 파툴린 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 서열번호 16 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 파툴린 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 파툴린 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 19, 20 및 21의 핵산 서열 및 서열번호 22, 23 및 24의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  7. 제5항에 있어서, 서열번호 25, 26 및 27의 핵산 서열 및 서열번호 28, 29 및 30의핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  8. 제5항에 있어서, 서열번호 31, 32 및 33의 핵산 서열 및 서열번호 28, 29 및 30의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  9. 제5항에 있어서, 서열번호 34, 35 및 36의 핵산 서열 및 서열번호 28, 29 및 30의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 파툴린 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 파툴린 검출용 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 파툴린 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는 파툴린의 검출 방법.
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