CN109507269A - 一种排硫硫杆菌蛋白质双向电泳分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种排硫硫杆菌细胞蛋白的电泳分析方法，其具体步骤如下：A.排硫硫杆菌细胞蛋白的提取，B.SDS‑PAGE凝胶的制备，C.双向凝胶电泳，D.染色处理及图像扫描。本方法操作流程清晰简单，分析效果较好，能够较好分离辨别15‑110kDa范围内的菌体蛋白，并可通过后续质谱分析得到一些蛋白的具体信息。
Description
技术领域
本发明主要涉及微生物细胞蛋白分析，主要涉及一种排硫硫杆菌蛋白质双向电泳分析方法，通过合理的溶液配比使检测更精确。
背景技术
双向凝胶电泳由O'Farrel以及Klose和Scheele等人于1975年发明的，原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，具有相同等电点的蛋白质无论其分子大小，在电场的作用下都会用聚焦在某一特定位置即等电点处；第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
该技术可用于凝胶蛋白的检测，凝胶染色的目的是使其中的蛋白质能够被观察到。目前还没有通用的染色方法，只能在考虑多种因素如需要的灵敏度、线性范围、方便程度、费用、以及成像设备类型等基础上，结合实际进行选择。有时也可以将蛋白转膜后通过免疫印迹的方法来进行检测。
对于电泳结果的分析可以借助一些分析软件，成像设备可以摄入图像，对凝胶图像以数字形式保存，对每块凝胶图像进行平等的比较，在各研究组之间传递信息，并对大量的数据进行归类分析。目前应用较为广泛的图像分析软件有PDQuest、ImageMaster 2DElite、Melanie等，分辨率较高，功能齐全。尽管如此，仍不可避免约10％的未检出点和假点，需要手工添加、删除和分割。图像采集完成后。可以应用各种分析软件进行分析，可以收集、诠释、比较蛋白质组数据资料等。
一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的蛋白后，就可以从凝胶中或膜上切取这些目标蛋白质作鉴定。现在绝大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成的。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种排硫硫杆菌蛋白质双向电泳分析方法，有效分析排硫硫杆菌主要的细胞蛋白，为排硫硫杆菌的代谢机理分析提供基础。采用了SDS-PAGE双向凝胶电泳，通过优化溶液配比，获得更为精确清晰的谱图。
本发明的技术方案为：一种排硫硫杆菌细胞蛋白的电泳分析方法，其具体步骤如下：
A.排硫硫杆菌细胞蛋白的提取：
将冷冻保存的排硫硫杆菌培养物加入蛋白裂解液磁力搅拌得悬浮液，经超声破碎后的悬浮液，离心收集上清液，加入有机溶剂萃取，再离心得沉淀物，再加入水化液溶解，其中水化液中DTT浓度为15-25mM，测定并控制蛋白浓度为10-50μg/mL，提取的蛋白溶液样品冰箱保存备用；
B.SDS-PAGE凝胶的制备
用单体贮存液、分离胶溶液、SDS溶液、APS溶液和TEMED溶液按比例混合，制备质量体积分数为0.075-0.125g/ml SDS-PAGE凝胶；
C.双向凝胶电泳
用步骤A提取的蛋白溶液将胶条水化；将水化后的胶条安装到电泳仪中，先在100-200V条件下进行低压除盐，再调高电压至5000-7000V，进行第一向等电聚焦电泳；再将胶条平衡；将平衡后的胶条转移至步骤B配制好的SDS-PAGE凝胶的胶面上，进行第二向SDS-PAGE电泳；
D.染色处理及图像扫描：电泳完成后，凝胶使用考马斯亮蓝染色，再进行图像扫描，用计算机软件分析图像，获取详细的蛋白样品信息。
优选步骤A中所述的水化液组分为：8-10M尿素，1％-2％g/ml CHAPS，0.001-0.002％g/ml溴酚蓝，0.5-1％g/ml IPG缓冲液，15-20mM DTT；需要严格控制DTT的浓度为15-20mM。
优选上述的排硫硫杆菌，菌种的拉丁学名为Thiobacillus thioparus，保藏日期是2016年7月11日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.12756。
优选单体储存液为：丙烯酰胺混合液质量体积分数(g/ml)为20％-35％，双甲叉丙烯酰胺质量体积分数为0.5％-1.2％；分离胶溶液：1.2-2.0M Tris-Cl pH 8.5-9.0；SDS溶液：SDS质量体积分数(g/ml)为8％-15％；APS溶液：过硫酸铵质量体积分数(g/ml)10％-15％；TEMED溶液：四甲基乙二胺体积分数(g/ml)0.04％-0.08％；优选单体贮存液、分离胶溶液、SDS溶液、APS溶液和TEMED溶液按体积比例为30:25:1:0.5:0.03。
优选胶条水化操作电压为25-30V，水化时间为10-16h。
优选所述的胶条平衡采用两次平衡，第一次平衡在平衡液中加入DTT，其中平衡液中DTT的浓度为30-50mM；第二次平衡在平衡液中加入碘乙酰胺，其中平衡液中碘乙酰胺的浓度为10-20mM。
优选第二向SDS-PAGE电泳时控制电压500-800V，电流300-400mA，电泳时间10～12h。
CGMCC No.12756菌株具有以下性质：
1、培养特征：
在固体LB培养基上培养，呈白色或淡黄色、微透明小圆点状，有光泽，边缘光滑整齐。
2、菌体形态特征：
在固体LB培养基上呈白色或淡黄色球形或椭圆型，直径0.5～1.7微米，单细胞外通常有一层荚膜。以极生鞭毛运动。
3、生理生化性质：
表1 CGMCC No.12756菌株生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用。
有益效果：
本发明操作流程清晰简单，分析效果较好，能够较好分离辨别15-110kDa范围内的菌体蛋白，并可通过后续质谱分析得到一些蛋白的具体信息。
保藏信息
上述硫杆菌其分类名为排硫硫杆菌，菌种的拉丁学名为Thiobacillusthioparus，参据的微生物(株)为：NJYH5327，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，保藏日期是2016年7月11日，登记入册的编号是CGMCCNo.12756。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。以下例子所述的质量体积分数的单位均为(g/ml)
实施例1：
1.蛋白质的提取纯化
(1)将-20℃冰箱保存的排硫硫杆菌培养物室温溶解，加入2倍菌体体积蛋白裂解液，混匀后磁力搅拌，4℃、4h。
(2)搅拌后的悬浮液，冰浴超声5min，冷冻再超声，反复3次。
(3)取出细胞裂解液，冷冻离心机15000r/min，4℃，离心10min，收集上清液。
(4)上清液中加入4倍体积甲醇、1倍体积三氯甲烷、3倍体积去离子水，混匀后6000r/min，4℃，离心2min，吸出沉淀薄层上方液体，加入3倍体积甲醇，震荡混匀，离心去上清。
(5)离心沉淀用15mM DTT水化液溶解(水化液具体组分为8M尿素，1％CHAPS，0.001％溴酚蓝，0.5％IPG缓冲液，15mM DTT)，测定并控制蛋白样品浓度为10μg/mL，再放入冰箱保存备用。
2.SDS-PAGE凝胶的配制
分别配制单体贮存液：丙烯酰胺混合液质量体积分数为20％，双甲叉丙烯酰胺质量体积分数为0.5％；分离胶溶液：1.2M Tris-Cl pH 8.5；SDS溶液：SDS质量体积分数为8％；APS溶液：过硫酸铵质量体积分数10％；TEMED溶液：四甲基乙二胺体积分数0.04％；再将单体贮存液、分离胶溶液、SDS溶液、APS溶液和TEMED溶液按比例30:25:1:0.5:0.03混合均匀，制得质量体积分数为0.075g/mlSDS-PAGE凝胶溶液。
3.双向凝胶电泳
(1)胶条被动水化
吸取制备完成的蛋白样品溶液500μL；取出IPG干胶条(购买的通用胶条，pH4-7,13cm)，平衡半小时后，将样品溶液用移液枪均匀打入标准型胶条槽内，撕去胶条保护，用镊子夹住IPG干胶条将其放入胶条槽内，注意避免产生气泡，设置电压25V，水化时间10h。
(2)第一向等电聚焦电泳
将水化后的胶条胶面朝上放置在陶瓷盘中，在胶条两端放上电极纸片，覆盖上液体石蜡后，将电极安装入位，压平电极纸片，开始等点聚焦电泳，先100V电压除盐，再于5000V聚焦电泳。
(3)胶条平衡
等电聚焦结束后，用镊子夹住胶条碱性端取出胶条，在滤纸上将液体石蜡滴尽后放入装有4mL平衡液I(DTT浓度为30mM)的胶条槽内，在摇床上水平震荡10min，接着将胶条转移至装有4mL平衡液Ⅱ(碘乙酰胺浓度为10mM)的胶条槽内，在摇床上水平震荡10min，随后用电泳缓冲液清洗后即可进行第二向SDS-PAGE电泳。
(4)第二向SDS-PAGE电泳
然后将平衡后的IPG胶条转移至配制好的SDS-PAGE凝胶的胶面上，使胶条与胶面充分贴合，然后用0.5％的低熔点琼脂糖溶液封胶，即可准备电泳。整个过程应避免产生小气泡。电泳条件为：电压500V，电流300mA，电泳时间10h。恒功率电泳，至指示带到达凝胶底部，即可结束电泳。
4.经染色处理，图谱扫描发现其可观察分子量主要集中在20-100kDa之间，等电点主要集中在4.5-6之间，可分析蛋白质点为19个。
实施例2：
1.蛋白质的提取纯化
(1)将-20℃冰箱保存的排硫硫杆菌培养物室温溶解，加入2倍菌体体积蛋白裂解液，混匀后磁力搅拌，4℃、4h。
(2)搅拌后的悬浮液，冰浴超声5min，冷冻再超声，反复3次。
(3)取出细胞裂解液，冷冻离心机15000r/min，4℃，离心10min，收集上清液。
(4)上清液中加入4倍体积甲醇、1倍体积三氯甲烷、3倍体积去离子水，混匀后6000r/min，4℃，离心2min，吸出沉淀薄层上方液体，加入3倍体积甲醇，震荡混匀，离心去上清。
(5)离心沉淀用20mM DTT水化液溶解(水化液具体组分为9M尿素，1.5％CHAPS，0.0015％溴酚蓝，0.75％IPG缓冲液，20mM DTT)，测定并控制蛋白样品浓度为30μg/mL，再放入冰箱保存备用。
2.SDS-PAGE凝胶的配制
分别配制单体贮存液：丙烯酰胺混合液质量体积分数为25％，双甲叉丙烯酰胺质量体积分数为0.65％；分离胶溶液：1.6M Tris-Cl pH 8.8；SDS溶液：SDS质量体积分数为12％；APS溶液：过硫酸铵质量体积分数12.5％；TEMED溶液：四甲基乙二胺体积分数0.06％；再将单体贮存液、分离胶溶液、SDS溶液、APS溶液和TEMED溶液按比例30:25:1:0.5:0.03混合均匀，制得质量体积分数为0.1g/mlSDS-PAGE凝胶溶液。
3.双向凝胶电泳
(1)胶条被动水化
吸取制备完成的蛋白样品溶液500μL；取出IPG干胶条(购买的通用胶条，pH4-7,13cm)，平衡半小时后，将样品溶液用移液枪均匀打入标准型胶条槽内，撕去胶条保护，用镊子夹住IPG干胶条将其放入胶条槽内，注意避免产生气泡，设置电压27V，水化时间13h。
(2)第一向等电聚焦电泳
将水化后的胶条胶面朝上放置在陶瓷盘中，在胶条两端放上电极纸片，覆盖上液体石蜡后，将电极安装入位，压平电极纸片，开始等点聚焦电泳，先150V电压除盐，再于6000V聚焦电泳。
(3)胶条平衡
等电聚焦结束后，用镊子夹住胶条碱性端取出胶条，在滤纸上将液体石蜡滴尽后放入装有4mL平衡液I(DTT浓度为40mM)的胶条槽内，在摇床上水平震荡10min，接着将胶条转移至装有4mL平衡液Ⅱ(碘乙酰胺浓度为15mM)的胶条槽内，在摇床上水平震荡10min，随后用电泳缓冲液清洗后即可进行第二向SDS-PAGE电泳。
(4)第二向SDS-PAGE电泳
然后将平衡后的IPG胶条转移至配制好的SDS-PAGE凝胶的胶面上，使胶条与胶面充分贴合，然后用0.5％的低熔点琼脂糖溶液封胶，即可准备电泳。整个过程应避免产生小气泡。电泳条件为：电压650V，电流350mA，电泳时间11h。恒功率电泳过夜，至指示带到达凝胶底部，即可结束电泳。
4.经染色处理，图谱扫描发现其可观察分子量主要集中在15-110kDa之间，等电点主要集中在4.5-6之间，可分析蛋白质点为23个。
实施例3：
1.蛋白质的提取纯化
(1)将-20℃冰箱保存的排硫硫杆菌培养物室温溶解，加入2倍菌体体积蛋白裂解液，混匀后磁力搅拌，4℃、4h。
(2)搅拌后的悬浮液，冰浴超声5min，冷冻再超声，反复3次。
(3)取出细胞裂解液，冷冻离心机15000r/min，4℃，离心10min，收集上清液。
(4)上清液中加入4倍体积甲醇、1倍体积三氯甲烷、3倍体积去离子水，混匀后6000r/min，4℃，离心2min，吸出沉淀薄层上方液体，加入3倍体积甲醇，震荡混匀，离心去上清。
(5)离心沉淀用25mM DTT水化液溶解(水化液具体组分为10M尿素，2％CHAPS，0.002％溴酚蓝，1％IPG缓冲液，25mM DTT)，测定并控制蛋白样品浓度为50μg/mL，再放入冰箱保存备用。
2.SDS-PAGE凝胶的配制
先配制单体贮存液：丙烯酰胺混合液质量体积分数为35％，双甲叉丙烯酰胺质量体积分数为1.2％；分离胶溶液：2.0M Tris-Cl pH 9.0；SDS溶液：SDS质量体积分数为15％；APS溶液：过硫酸铵质量体积分数15％；TEMED溶液：四甲基乙二胺体积分数0.08％；再将单体贮存液、分离胶溶液、SDS溶液、APS溶液和TEMED溶液按比例30:25:1:0.5:0.03混合均匀，制得质量体积分数为0.125g/mlSDS-PAGE凝胶溶液。
3.双向凝胶电泳
(1)胶条被动水化
吸取制备完成的蛋白样品溶液500μL；取出IPG干胶条(购买的通用胶条，pH4-7,13cm)，平衡半小时后，将样品溶液用移液枪均匀打入标准型胶条槽内，撕去胶条保护，用镊子夹住IPG干胶条将其放入胶条槽内，注意避免产生气泡，设置电压30V，水化时间16h。
(2)第一向等电聚焦电泳
将水化后的胶条胶面朝上放置在陶瓷盘中，在胶条两端放上电极纸片，覆盖上液体石蜡后，将电极安装入位，压平电极纸片，开始等点聚焦电泳，先200V电压除盐，再于7000V聚焦电泳。
(3)胶条平衡
等电聚焦结束后，用镊子夹住胶条碱性端取出胶条，在滤纸上将液体石蜡滴尽后放入装有4mL平衡液I(DTT浓度为50mM)的胶条槽内，在摇床上水平震荡10min，接着将胶条转移至装有4mL平衡液Ⅱ(碘乙酰胺浓度20mM)的胶条槽内，在摇床上水平震荡10min，随后用电泳缓冲液清洗后即可进行第二向SDS-PAGE电泳。
(4)第二向SDS-PAGE电泳
然后将平衡后的IPG胶条转移至配制好的SDS-PAGE凝胶的胶面上，使胶条与胶面充分贴合，然后用0.5％的低熔点琼脂糖溶液封胶，即可准备电泳。整个过程应避免产生小气泡。电泳条件为：电压800V，电流400mA，电泳时间12h。恒功率电泳过夜，至指示带到达凝胶底部，即可结束电泳。
4.经染色处理，图谱扫描发现其可观察分子量主要集中在15-100kDa之间，等电点主要集中在4.5-6之间，可分析蛋白质点为20个。
Claims (5)
1.一种排硫硫杆菌细胞蛋白的电泳分析方法，其具体步骤如下：
A.排硫硫杆菌细胞蛋白的提取
将冷冻保存的排硫硫杆菌培养物加入蛋白裂解液磁力搅拌得悬浮液，经超声破碎后的悬浮液，离心收集上清液，加入有机溶剂萃取，再离心得沉淀物，再加入水化液溶解，其中水化液中DTT浓度为15-25mM，测定并控制蛋白浓度为10-50μg/mL，提取的蛋白溶液样品冰箱保存备用；
B.SDS-PAGE凝胶的制备
用单体贮存液、分离胶溶液、SDS溶液、APS溶液和TEMED溶液按比例混合，制备质量体积分数为0.075-0.125g/ml SDS-PAGE凝胶；
C.双向凝胶电泳
用步骤A提取的蛋白溶液将胶条水化；将水化后的胶条安装到电泳仪中，先在100-200V条件下进行低压除盐，再调高电压至5000-7000V，进行第一向等电聚焦电泳；再将胶条平衡；将平衡后的胶条转移至步骤B配制好的SDS-PAGE凝胶的胶面上，进行第二向SDS-PAGE电泳；
D.染色处理及图像扫描
电泳完成后，凝胶使用染色剂染色，再进行图像扫描，用计算机软件分析图像，获取详细的蛋白样品信息。
2.根据权利要求1所述的电泳分析方法，其特征在于步骤A中所述的水化液组分为：8-10M尿素，1％-2％g/ml CHAPS，0.001-0.002％g/ml溴酚蓝，0.5-1％g/ml IPG缓冲液，15-20mM DTT。
3.根据权利要求1所述的电泳分析方法，其特征在于所述的排硫硫杆菌，菌种的拉丁学名为Thiobacillus thioparus，保藏日期是2016年7月11日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.12756。
4.根据权利要求1所述的电泳分析方法，其特征在于所述的胶条平衡采用两次平衡，第一次平衡在平衡液中加入DTT，其中平衡液中DTT的浓度为30-50mM；第二次平衡在平衡液中加入碘乙酰胺，其中平衡液中碘乙酰胺的浓度10-20mM。
5.根据权利要求1所述的电泳分析方法，其特征在于第二向SDS-PAGE电泳时控制电压500-800V，电流300-400mA，电泳时间10～12h。
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