CN103267791A - 草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：1）蛋白质的提取；2）第一向IPG等电聚焦电泳；3）胶条的平衡；4）胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；5）凝胶扫描和图像分析。发明人在发明过程中考虑到草莓叶片富含多糖多酚类物质的特性，利用丙酮对草莓叶片蛋白进行多次沉淀抽提，改进了裂解液配方，提高了离心速率和粗蛋白沉淀的清洗次数和裂解液中尿素的浓度，从而建立了一套适合草莓叶片的差异双向电泳蛋白质组学方法，从而获得了高质量的草莓蛋白质差异图谱。运用本发明的方法能获得蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的草莓叶片蛋白质的双向电泳凝胶图谱。

Description

草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法

技术领域

本发明涉及一种草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

背景技术

草莓是一种重要的经济作物，利用基于双向电泳的蛋白质组学技术，可以快速挖掘草莓在应答病菌侵染过程中所产生的差异基因表达产物，从而阐述抗病机制，为将来草莓抗病育种工作提供重要技术支撑。

现有研究草莓抗病机理的方法往往借助于基因组学技术，可以在一定程度上挖掘植物应答胁迫的重要基因。但是因为蛋白质是基因表达的最终产物，所以找出与抗病相关的直接差异蛋白将更有助于抗病机理的研究。利用基于双向电泳的差异蛋白质组学技术，获得高质量的差异蛋白蛋白图谱，是研究抗病机理的强有力工具。

目前利用双向电泳获得蛋白图谱的方法在生物医学领域和部分植物研究（如苹果叶片）等植物种类有一定程度的应用，但是在草莓研究方面几乎空白。张彩霞等借助酚抽提法在苹果叶片中得到了高质量的蛋白质点图谱，但该方法并不适用于草莓。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能得到高质量双向电泳差异蛋白质图谱的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：

1）、蛋白质的提取；

2）、第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳；

3）、胶条的平衡；

4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

5）、凝胶扫描和图像分析。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的改进：

步骤1）为包括以下步骤：

①、取1 g草莓叶片加入液氮，研磨后悬浮于14~16ml（较佳为15ml）的三氯乙酸-丙酮溶液中，于-18~-22℃（较佳-20℃ ）沉淀10~14小时（较佳为12小时）；

所述三氯乙酸-丙酮溶液中三氯乙酸的体积浓度为10％；

②、将步骤①的所得物离心，弃上清；

③、步骤②所得沉淀悬浮于14~16ml（较佳为15ml）的B-巯基乙醇冷丙酮溶液；离心，将所得的沉淀重复上述悬浮和离心2~5次；

所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为：将冷丙酮与B-巯基乙醇按照1：0．07％的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为3~5℃（较佳为4℃）的丙酮；

④、将步骤③所得的沉淀干燥处理（例如为真空抽干45分钟），得到粗蛋白干粉；

加入0.9~1.1ml（较佳为lml）裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心，所得上清为蛋白提取液，可于-20℃ 保存；

所述裂解液A为在每ml水中加入420mg尿素、 150mg硫脲、40mg 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.2mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质（载体两性电解质Ampholine pH3-10，40%）、5μL苯甲基磺酰氟混合后而得。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：

步骤2）的第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳为：

将50μL步骤1）所得的蛋白提取液、250μL  IPG buffer混匀配成水化溶液，装入17cm等电聚焦槽中；取17cm的pH3-10的等电聚焦胶条（美国伯乐公司生产）一根（揭掉封膜后用）放入等电聚焦槽中，从而使等电聚焦胶条在水化溶液中均匀浸湿；再滴矿物油至等电聚焦槽的槽深1/2处，从而盖住整个等电聚焦胶条，盖上等电聚焦槽的槽盖后进行等电聚焦；等电聚焦操作严格按照仪器使用说明书进行；IEF设定参数如下：

上述IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入480mg尿素、20mg3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.5mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质（载体两性电解质Ampholine pH3-10，40%）混合后而得。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：

步骤3）的胶条的平衡包括以下步骤：

①、配制平衡缓冲液：

在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.35mol/L ，pH 8.8）中加入6mol的尿素，200ml的甘油，20g的十二烷基硫酸钠(SDS)；得平衡缓冲液；

②、先在10ml平衡缓冲液中加入100mg 的二硫苏糖醇，然后放入步骤2）等电聚焦完成后的等电聚焦胶条，振荡（轻微振荡，频率为50rpm）平衡15min；

③、先在10ml平衡缓冲液中加入250mg的碘乙酰胺，然后放入步骤②所得的胶条，振荡（轻微振荡，频率为50rpm）平衡15min；

④、将步骤③所得的胶条用去离子水冲洗（时间约为1s），然后用滤纸吸去胶条上附着的去离子水（例如为，将上述胶条边缘置于滤纸上1分钟，从而吸去多余水分）。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：

步骤4）的胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳包括以下步骤：

①、将步骤3）所得的平衡后的胶条转移至SDS-PAGE胶（1.5 mm厚），转移时使胶条紧贴凝胶，确保无气泡产生；

所述SDS-PAGE胶的制备方法为：

首先配制凝胶溶液（12%，约40ml）：

在13.4ml的超纯水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液（每ml混合水溶液中含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉双丙烯酰胺，其余为水）、10ml的Tris-Hcl缓冲液（1.5mol/L，pH 8.8）、0.4ml的SDS水溶液（每ml的SDS水溶液中含有100mg的SDS，其余为水）、200μL的过硫酸铵水溶液（每ml过硫酸铵水溶液中含有100mg的过硫酸铵，其余为水）、20μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺后混合而得；

将上述凝胶溶液（12%）注入玻璃板夹层中，玻璃板夹层的上部留1cm的空间，用超纯水封面，保持胶面平衡，聚合后（约30分钟），得SDS-PAGE胶；

②、将转移后胶条用琼脂糖封顶液进行封闭；所述琼脂糖封顶液的制备方法为：

在浓度为0.01g/mL的琼脂糖溶液5ml中加入0.1mg的溴酚蓝；

然后在第二向电泳槽的上下槽中分别加入电泳缓冲液，于恒流25mA进行第二向电泳（时间约为5～6h）；直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止；

所述电泳缓冲液的制备方法为：在每L水中加入3g Tris base、14.4g甘氨酸和1g 的十二烷基硫酸钠(SDS)混合后而得；

③、第二向电泳结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝R-250染色液中，振荡染色10~14小时（即，过夜）；倒掉染色液，加入脱色液，继续振荡脱色，每隔30min换一次脱色液，直至凝胶背景透明；

所述考马斯亮蓝R-250染色液的制备方法为：1.0g考马斯亮蓝R-250粉末溶于450ml甲醇、100ml乙酸和450ml超纯水中；

脱色液由以下体积百分含量的成分组成：45％乙醇、10%乙酸和45％超纯水。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：

步骤5）的凝胶扫描和图像分析为：

考马斯亮蓝显色后的胶片通过BIO-RAD公司的GS-800 calibrated Densitometer电泳扫描分析系统获取图像，用PDQuest7.3.1图像分析软件处理图像，对图像进行格式调整、背景消减、斑点检测、胶图匹配。

本发明的发明人在发明过程中考虑到草莓叶片富含多糖多酚类物质的特性，利用丙酮对草莓叶片蛋白进行多次沉淀抽提，改进了裂解液配方，提高了离心速率和粗蛋白沉淀的清洗次数和裂解液中尿素的浓度，从而建立了一套适合草莓叶片的差异双向电泳蛋白质组学方法，从而获得了高质量的草莓蛋白质差异图谱。运用本发明的方法能获得蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的草莓叶片蛋白质的双向电泳凝胶图谱，且实验结果稳定，此发明为进一步开展草莓蛋白组学和分子生物学的研究奠定了重要的工作基础。

综上所述，本发明主要目的是挖掘开发出一种高质量制备草莓叶片全蛋白的方法，从而能得到高质量的双向电泳差异蛋白质图谱。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1：草莓品种“红颊”叶片蛋白质组双向电泳图谱。

图2：草莓品种“甜查理”叶片蛋白质组双向电泳图谱。

图3：草莓品种“红颊”叶片酚抽提法蛋白质组双向电泳图谱。

图4：草莓品种“红颊”叶片采用裂解液B得到的蛋白质组双向电泳图谱。

具体实施方式

实施例1、一种草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，使用的草莓品种为“红颊”，取其叶片；依次进行以下步骤：

1）、蛋白质的提取：

包括以下步骤：

①、取1 g草莓叶片加入4 ml液氮，研磨后将其悬浮于15ml含10％（v/v）三氯乙酸(丙酮配制)溶液中，-20℃ 沉淀12小时；

②、将步骤①的所得物离心(4℃ ，15000r／min，30min)，弃上清；

③、将步骤②所得的沉淀悬浮于15ml的B-巯基乙醇冷丙酮溶液；离心(4℃，15000r／min，30min)，将所得的沉淀重复上述悬浮和离心5次；

所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为：将冷丙酮与B-巯基乙醇按照1：0．07％的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为4℃的丙酮；

④、将步骤③所得的沉淀干燥处理（真空抽干45分钟），得到粗蛋白干粉；加入lml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心(4℃ ，15000r／min，30min)，所得的上清即为蛋白提取液，于-20℃ 保存；

裂解液A为在每ml水中加入420mg尿素、 150mg硫脲、40mg 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.2mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质（Ampholine pH3-10，40%），5μL苯甲基磺酰氟混合后而得。

2）、第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳；

取步骤1）所得的蛋白提取液50μL、250μL 的IPG buffer混匀后配成水化溶液，装入17cm等电聚焦槽中；取17cm长度的美国伯乐公司生产的pH3-10的等电聚焦胶条一根，揭掉封膜，放入聚焦槽中，保证该电聚焦胶条（以下简称胶条）在水化溶液中被均匀浸湿；再滴矿物油至槽深1/2处，盖住整个胶条，盖上槽盖，进行等电聚焦。等电聚焦操作严格按照仪器使用说明书进行；IEF设定参数如下：

上述IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入480mg尿素、20mg的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.5mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质（Ampholine pH3-10，40%）。

3）、胶条的平衡；

①、配制平衡缓冲液：

在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.35mol/L ，pH 8.8）中加入6mol的尿素，200ml的甘油，20g的十二烷基硫酸钠(SDS)；得平衡缓冲液；

②、先在10ml平衡缓冲液中加入100mg 二硫苏糖醇均匀混合后，将步骤2）的等电聚焦完成后的胶条置于上述含二硫苏糖醇的平衡缓冲液中轻微振荡（振荡频率为50rpm）平衡15min；

③、在10ml平衡缓冲液中加入250mg碘乙酰胺均匀混合后，将步骤②所得的胶条放入上述含碘乙酰胺的平衡缓冲液中，再振荡（振荡频率为50rpm）平衡15min；

④、将步骤③所得的胶条用去离子水冲洗1s，然后用将胶条边缘置于滤纸上1分钟，吸去多余水分。

4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

①、将步骤3）所得的平衡后的胶条转移至SDS-PAGE胶(1.5 mm厚)，转移时使胶条紧贴凝胶，确保无气泡产生；得转移后胶条；

所述SDS-PAGE胶的制备方法为：

首先配制凝胶溶液（12%）：

在13.4ml的超纯水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液（每ml混合水溶液中含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉双丙烯酰胺，其余为水）、10ml的Tris-Hcl缓冲液（1.5mol/L，pH 8.8）、0.4ml的SDS水溶液（每ml的SDS水溶液中含有100mg的SDS）、200μL的过硫酸铵水溶液（每ml过硫酸铵水溶液中含有100mg的过硫酸铵）、20μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺后混合而得；

将上述40ml的凝胶溶液（12%）注入玻璃板夹层中，玻璃板夹层的上部留1cm的空间，用超纯水封面，保持胶面平衡，聚合后（约30分钟），得SDS-PAGE胶；

②、将转移后胶条用琼脂糖封顶液进行封闭；琼脂糖封顶液的制备方法为：在浓度为0.01g/mL的琼脂糖溶液5ml中加入0.1mg的溴酚蓝混合后而得；

然后在第二向电泳槽的上下槽中分别加入电泳缓冲液，进行第二向电泳(恒流25mA，5～6h)；直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止；

电泳缓冲液的制备方法为：在每L水中加入3g Tris base、14.4g甘氨酸和1g SDS。

③、第二向电泳结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝R-250染色液中，振荡染色过夜（12小时）；倒掉染色液，加入脱色液[45％(v/v)乙醇、10%(v/v)乙酸和45％(v/v)超纯水]，继续在摇床上振荡脱色，每隔30min换一次脱色液，直至凝胶背景透明。

考马斯亮蓝R-250染色液的制备方法为：1.0g考马斯亮蓝R-250粉末溶于450ml甲醇、100ml乙酸和450ml超纯水中。

5）、凝胶扫描和图像分析

考马斯亮蓝显色后的胶片通过BIO-RAD公司的GS-800 calibrated Densitometer电泳扫描分析系统获取图像，用PDQuest7.3.1图像分析软件处理图像，对图像进行格式调整、背景消减、斑点检测、胶图匹配。如图1所示。图1为草莓品种“红颊”叶片蛋白质组双向电泳图谱。根据图1，我们能得出以下结论：正常草莓叶片蛋白质组双向电泳图谱为电泳点数目多，无横纵条纹，点分布均匀，图谱清楚，背景清晰，图谱质量高。

实施例2、以草莓品种“甜查理”的叶片，替代实施例1中的“红颊”草莓叶片，其余同实施例1。

最终所得的图谱如图2所示。根据图2，我们能得出以下结论：针对草莓不同品种的叶片，利用本发明方法也能稳定得到高质量的蛋白表达图谱。蛋白图谱清楚，蛋白点数目多，背景非常清晰。

对比例1-1、将实施例1中的草莓“红颊”的叶片采用现有的蛋白酚抽提法，然后进行双向电泳，最终所得的图谱如图3所示。根据图3，我们得知：已有的蛋白酚抽提法得到的草莓叶片双向电泳蛋白质图谱蛋白点数少，背景不清晰。

对比例1-2、

仅将实施例1的步骤1）的步骤④中的裂解液A改成了裂解液B。

所述裂解液B为：在每ml水中加入280mg尿素、 250mg硫脲、20mg 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5.5mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质（Ampholine pH3-10，40%），10μL苯甲基磺酰氟制备而得。

其余同实施例1。

最终所得的图谱如图4所示。根据图4，我们得知：借助于裂解液B的双向电泳技术所得到的蛋白图谱蛋白点数目较少，且图谱有较为明显的纵条纹，图谱质量不高。

综上所述，本发明技术中所采用的裂解液A则更适合于草莓叶片高质量双向电泳蛋白图谱的获取，本发明技术更适合应用于草莓叶片高质量蛋白质组图谱的获得。

Claims (6)

1.草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是包括以下步骤：

1）、蛋白质的提取；

2）、第一向IPG等电聚焦电泳；

3）、胶条的平衡；

4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

5）、凝胶扫描和图像分析。

2.根据权利要求1所述的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤1）为包括以下步骤：

①、取1 g草莓叶片加入液氮，研磨后悬浮于14~16ml的三氯乙酸-丙酮溶液中，于-18~-22℃沉淀10~14小时；

所述三氯乙酸-丙酮溶液中三氯乙酸的体积浓度为10％；

②、将步骤①的所得物离心，弃上清；

③、步骤②所得沉淀悬浮于14~16ml的B-巯基乙醇冷丙酮溶液；离心，将所得的沉淀重复上述悬浮和离心2~5次；

所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为：将冷丙酮与B-巯基乙醇按照1：0．07％的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为3~5℃的丙酮；

④、将步骤③所得的沉淀干燥处理，得到粗蛋白干粉；

加入0.9~1.1ml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心，所得上清为蛋白提取液；

所述裂解液A为在每ml水中加入420mg尿素、 150mg硫脲、40mg 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.2mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质、5μL苯甲基磺酰氟混合后而得。

3.根据权利要求2所述的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤2）的第一向IPG等电聚焦电泳为：

将50μL步骤1）所得的蛋白提取液、250μL  IPG buffer混匀配成水化溶液，装入17cm等电聚焦槽中；取17cm的pH3-10的等电聚焦胶条一根放入等电聚焦槽中，从而使等电聚焦胶条在水化溶液中均匀浸湿；再滴矿物油至等电聚焦槽的槽深1/2处，从而盖住整个等电聚焦胶条，盖上等电聚焦槽的槽盖后进行等电聚焦；等电聚焦操作按照仪器使用说明书进行；IEF设定参数如下：

上述IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入480mg尿素、20mg3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.5mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质混合后而得。

4.根据权利要求3所述的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤3）的胶条的平衡包括以下步骤：

①、配制平衡缓冲液：

在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.35mol/L ，pH 8.8）中加入6mol的尿素，200ml的甘油，20g的十二烷基硫酸钠；得平衡缓冲液；

②、先在10ml平衡缓冲液中加入100mg 的二硫苏糖醇，然后放入步骤2）等电聚焦完成后的等电聚焦胶条，振荡平衡15min；

③、先在10ml平衡缓冲液中加入250mg的碘乙酰胺，然后放入步骤②所得的胶条，振荡平衡15min；

④、将步骤③所得的胶条用去离子水冲洗，然后用滤纸吸去胶条上附着的去离子水。

5.根据权利要求4所述的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤4）的胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳包括以下步骤：

①、将步骤3）所得的平衡后的胶条转移至SDS-PAGE胶，转移时使胶条紧贴凝胶，确保无气泡产生；

所述SDS-PAGE胶所用的凝胶溶液为：

在13.4ml的超纯水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液（每ml混合水溶液中含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉双丙烯酰胺，其余为水）、10ml的Tris-Hcl缓冲液（1.5mol/L，pH 8.8）、0.4ml的SDS水溶液（每ml的SDS水溶液中含有100mg的SDS）、200μL的过硫酸铵水溶液（每ml过硫酸铵水溶液中含有100mg的过硫酸铵）、20μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺后混合而得；

②、将转移后胶条用琼脂糖封顶液进行封闭；所述琼脂糖封顶液的制备方法为：

在浓度为0.01g/mL的琼脂糖溶液5ml中加入0.1mg的溴酚蓝；

然后在第二向电泳槽的上下槽中分别加入电泳缓冲液，于恒流25mA进行第二向电泳；直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止；

所述电泳缓冲液的制备方法为：在每L水中加入3g Tris base、14.4g甘氨酸和1g 的SDS混合后而得；

③、第二向电泳结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝R-250染色液中，振荡染色10~14小时；倒掉染色液，加入脱色液，继续振荡脱色，每隔30min换一次脱色液，直至凝胶背景透明；

所述考马斯亮蓝R-250染色液的制备方法为：1.0g考马斯亮蓝R-250粉末溶于450ml甲醇、100ml乙酸和450ml超纯水中；

脱色液由以下体积百分含量的成分组成：45％乙醇、10%乙酸和45％超纯水。

6.根据权利要求5所述的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤5）的凝胶扫描和图像分析为：

考马斯亮蓝显色后的胶片通过BIO-RAD公司的GS-800 calibrated Densitometer电泳扫描分析系统获取图像，用PDQuest7.3.1图像分析软件处理图像，对图像进行格式调整、背景消减、斑点检测、胶图匹配。

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