CN101696238A - 一种植物总蛋白提取液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物总蛋白提取液及其应用。该提取液是含有重蒸酚和还原剂的水溶液;其中,重蒸酚含量为80-90%,还原剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇。应用本提取液抽提蛋白之前需根据样品的特性先用三氯乙酸/丙酮或其它方法去除色素、油脂等杂质,残余三氯乙酸用丙酮或其它有机溶剂洗除,稍微晾干后加入本发明所提供的蛋白抽提液,混合均匀,室温静置至少10分钟即可抽提蛋白。本发明所提供的方法使用苯酚直接从植物样品干粉中抽提蛋白,可避开蛋白溶解能力的限制,使制得的蛋白样品能全面反映研究对象中蛋白的组成,可广泛用于各种植物组织样品特别是含杂质如色素、多糖、多酚较多的植物叶片、根、果实、块茎等的蛋白质组学研究。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质组学研究领域中的蛋白提取方法,具体涉及一种植物总蛋白提取提取液及其应用。
背景技术
现在植物蛋白的提取方法很多,最常用为TCA/丙酮沉淀法和酚提法。TCA/丙酮能有效抑制样品中各种酶的活性,但得到的蛋白经常会难以再溶解,并且会含有较多的杂质而不适于用双向电泳(2-DE)来分析。酚提法通常需要先用一种缓冲液从植物样品中溶出蛋白,再以苯酚从缓冲液中抽提蛋白,它可以通过用缓冲液反复抽提以除去酚相中杂质,得到的蛋白会比较纯净,但会受到蛋白在缓冲液中溶解能力的限制而丢失一些蛋白,从而影响到2-DE的最终结果。此外,在缓冲液中由于酶的活力无法被完全抑制,也会导致一些蛋白被修饰或降解。直接用缓冲液提取蛋白的方法更无法去除样品中水溶性杂质如色素、多糖及多酚等。这些物质会严重干扰到蛋白质的电泳,所以应用范围更加有限。植物材料中广泛存在的杂质对SDS-PAGE电泳的影响可能不大,但却会严重干扰到等电聚焦的过程,导致2-DE图像中出现严重的拖尾、横纵纹及弥散现象。进而影响到对2-DE图像的对比分析以及蛋白质的质谱鉴定,所以在制备用于2-DE的蛋白质样品时,需尽可能去除一切杂质。
发明内容
针对现有技术中存在的缺点和不足,本发明的目的首先是提供一种植物总蛋白提取液。
本发明的另一目的是提供上述植物总蛋白提取液的具体应用。
为实现上述目的,本发明提供如下的技术方案:
一种植物总蛋白提取液,其特征在于:是含有重蒸酚和还原剂的水溶液;其中,,重蒸酚的重量含量为80-90%,还原剂的重量含量为0.2-3%,还原剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。
优选地,所述巯基乙醇含量为1-3%(v/v),所述二硫苏糖醇的含量为0.2-1%(w/v)。
优选的,所述植物总蛋白提取液是含2%体积的巯基乙醇和85%重量的重蒸酚的水溶液。
本发明还提供根据所述植物总蛋白提取液的应用,广泛用于各种植物组织样品特别是含杂质如色素、多糖、多酚较多的植物叶片、根、果实、块茎(根)等的蛋白质组学研究。
作为一种具体的应用,本发明还提供一种植物总蛋白提取方法,包括以下具体步骤:
(1)将植物组织在液氮中研磨粉碎,用-20℃预冷的含10-15%重量的三氯乙酸(TCA)的三氯乙酸/丙酮溶液连续洗涤至上清澄清透明,再以丙酮洗除残留三氯乙酸,晾干备用;对于油脂丰富的干果类材料(如花生、大豆、果仁等),将材料粉碎后直接用有机溶剂(如环己烷石油醚)抽提脱脂,然后晾干有机溶剂后备用;
(2)以1-5ml/克植物鲜重的比例加入权利要求1、2或3中所述的植物总蛋白提取液,旋涡混合1分钟,室温静置;旋涡混合一般1分钟足够,室温静置优选至少10分钟;
(3)于4℃、10,000g离心至少20分钟,吸取上层酚相;下层沉淀可依步骤(2)重复抽提2-3次,合并所得酚相;
(4)将收集到的酚相与5-10倍体积-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇混合,置于0至-20℃沉淀至少10分钟;
(5)于4℃、10,000g离心至少20分钟,弃上清,沉淀用无水甲醇洗涤3-5次,晾干或冻干即得植物蛋白干粉。
优选地,所述步骤(1)中,三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸的重量含量为10%。。
优选地,所述步骤(2)中,植物总蛋白提取液的添加比例为2-4ml/克植物鲜重;抽提时间为10分钟。
优选地,所述步骤(3)中,所述重复抽提为3次。
优选地,所述步骤(4)为,将收集到的酚相加5-6倍体积的-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇,沉淀温度为-20℃;沉淀时间为10分钟。
优选地,所述步骤(5)中,沉淀洗涤次数为3次。
相比现有技术,本发明具有如下优点:
本发明的蛋白提取液主要由苯酚组成。直接利用苯酚从植物组织干粉中抽提蛋白,可减少因一些蛋白在缓冲液中难溶而无法提取的问题;使制备的样品更能全面反映研究对象中蛋白的组成,本发明可广泛用于各种植物组织样品特别是色素、多糖、多酚类含量较多的植物叶片、根、果实、块茎等组织的蛋白质组学研究,应用前景十分广阔。
附图说明
图1为依据本方法制备的花生叶片全蛋白样品双向电泳图谱。
图2为依据本方法制备的花生幼荚果的全蛋白样品双向电泳图谱。
图3为依据缓冲液/酚提法制备的花生叶片全蛋白样品双向电泳图谱。
图4为依据本方法制备的甘薯叶片全蛋白样品双向电泳图谱。
图5为依据TCA/丙酮沉淀法制备的甘薯叶片全蛋白样品双向电泳图谱。
具体实施方式
试剂:
尿素(电泳级),硫尿,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,SDS,DTT,三羟甲基氨基甲烷(Tris),甘氨酸购自Amresco,(三丁基膦)TBP,2-乙烯基吡啶(2-VP),CHAPS(3-[(3-Cholanidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)购自sigma,其它均为普通市售分析纯级试剂。
以下实施例中涉及的百分数,除标明外均为重量含量。
实施例1
(1)新鲜花生叶片2g,加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的10%TCA/丙酮(含1%(v/v)巯基乙醇)洗涤,10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明;加入10ml-20℃预冷的丙酮洗涤两次以除去残留的TCA,然后于通风橱室温晾干;
(2)加入3ml上述蛋白提取液混合均匀,于室温静置10min抽取蛋白,10,000g离心20分钟,转出上清,重复此过程2次;
(3)合并所有酚相,加入5倍体积-20℃预冷甲醇(含0.1M醋酸铵)混合均匀,于-20℃沉淀蛋白10min,离心沉淀后用甲醇洗涤3次,室温晾干;
(4)用上样缓冲液(尿素7M,硫尿2M,CHAPS 4%,0.01%溴酚兰)溶解蛋白,BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml,取200ul直接用于等电聚焦(IEF)。(11cm pH3-10IPG水化6h,IEF程序为:100-10,000V 5h线性升压,10,000V保持至总伏时数达到60,000V*H。
(5)将已聚焦好的固相预制胶条(IPG胶条)取出,沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M,甘油30%,SDS 2%,溴酚兰0.01%)平衡12min。
(6)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15%),恒压80V至蛋白完全转出IPG胶条,再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm处时,关掉电源,取出凝胶,用考马斯亮蓝G-250染色。。
由图1可以看出花生叶片蛋白在2-DE凝胶上得到了良好的分离,背景清晰且可识别点数较多,偏酸偏碱端以及小分子量区域的蛋白都分离的很好,点形圆润且边界分明。这表明由本方法提取的蛋白很纯净,杂质很少。
实施例2
(1)新鲜花生嫩荚果2g,加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的TCA/丙酮(含1%巯基乙醇)洗涤,10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明;加入10ml-20℃预冷的80%丙酮洗涤两次以上以除去残留的TCA,然后于通风橱室温晾干;
(2)加入3ml上述蛋白提取液混合均匀,于室温静置10min抽取蛋白,10,000g离心后转出上清,重复此过程2次;
(3)合并所有酚相,加入5倍体积甲醇(含0.1M醋酸铵)于-20℃沉淀蛋白10min,离心沉淀后用甲醇洗涤3次,冷冻干燥。
(4)用上样缓冲液(尿素7M,硫尿2M,CHAPS 4%,0.01%溴酚兰)溶解蛋白,BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml,取200ul直接用于等电聚焦。(11cm pH3-10IPG水化至少6h,IEF程序为:100-10,000V 5h线性升压,10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V*H)。
(5)将已聚焦好的IPG胶条取出,沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M,甘油30%,SDS 2%,溴酚兰0.01%)平衡12min。
(6)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15%),恒压80V至蛋白转出胶条,再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm时,关掉电源,取出凝胶,用考马斯亮蓝G-250染色。
由图2可以看出花生嫩荚果的蛋白在2-DE凝胶上也可以很好的分离,背景清晰,蛋白点圆润且边界分明,整张凝胶只有很少的横纵条纹和拖尾。特别是凝胶中部的几个高丰度蛋白,也都能很好的分离开,这显示由本方法制备的花生荚果蛋白杂质含量很少,基本不会影响到蛋白的电泳分离。
比较实施例1
(1)新鲜花生叶片2g,加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的TCA/丙酮(含1%巯基乙醇)洗涤,10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明;加入10ml-20℃预冷的80%丙酮洗涤两次以上以除去残留的TCA,然后于通风橱室温晾干;
(2)加入3ml蛋白提取液(尿素9M,β-ME 2%(v/v),Tris 50mM,pH7.5)混合均匀,再加入3ml TRis-HCl饱和酚(pH7.5)混合均匀后室温静置10分钟浸提蛋白,于4℃、10,000g离心10分钟后取上层酚相与5倍体积-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇混合,置于-20℃沉淀蛋白10分钟;在于4℃、10,000g离心10分钟,沉淀用甲醇洗涤3次,晾干;
(3)用上样缓冲液(尿素7M,硫尿2M,CHAPS 4%,0.01%溴酚兰)溶解蛋白,BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml,取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH3-10IPG水化至少6h,IEF程序为:100-10,000V 5h线性升压,10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V*H。
(4)聚焦完成后的胶条采用两步平衡法进行处理,先用5ml含1%DTT的SDS平衡液(尿素6M,甘油30%,SDS 2%,溴酚兰0.01%)平衡12min还原蛋白,再用含碘乙酰胺25mg/L的SDS平衡液平衡12min以烷基化蛋白。
(5)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15%),恒压80V至蛋白转出胶条,再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm时,关掉电源,取出凝胶,用考马斯亮蓝G-250染色。
对比图1和图3可以看出,在图3中蛋白较为集中在中间区域,且蛋白的丢失严重,蛋白点数明显比图1要少,蛋白可能在一开始就没有被提取出来或者是在平衡过程中丢失;底部的拖尾则显示蛋白在处理过程中有降解。
实施例3
(1)新鲜甘薯叶片2g,加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的TCA/丙酮(含1%巯基乙醇)洗涤,10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明;加入10ml-20℃预冷的80%丙酮洗涤两次以上以除去残留的TCA,然后于通风橱室温晾干;
(2)加入3ml上述蛋白提取液混合均匀,于室温静置10min抽取蛋白,10,000g离心后转出上清,重复此过程2次;
(3)合并所有酚相,加入5倍体积-20℃预冷的甲醇(含0.1M醋酸铵)于-20℃沉淀蛋白10min,离心沉淀后用甲醇洗涤3次,冷冻干燥。
(4)用上样缓冲液(尿素7M,硫尿2M,CHAPS 4%,0.01%溴酚兰)溶解蛋白,BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml,取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH3-10IPG水化至少6h,IEF程序为:100-10,000V 5h线性升压,10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V*H)。
(5)将已聚焦好的IPG胶条取出,沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M,甘油30%,SDS 2%,0.01%溴酚兰)平衡12min。
(6)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15%),恒压80V至蛋白转出胶条,再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部0.5cm时,关掉电源,取出凝胶,用考马斯亮蓝G-250染色。。
甘薯叶片含有较多的多糖多酚类物质,通常方法很难得到合格的蛋白样品,由图4可以看出由本方法制备的蛋白样品虽然在2-DE凝胶的中部有一条明显的水平条纹,但多数蛋白还是得到了很好的分离,蛋白点尖锐清晰,特别是位于凝胶底部的小分子量蛋白也都得到了很好了分离。相比由TCA/丙酮沉淀法制备的样品(图5)可明显得出,本方法能有效去除甘薯叶片中的多数多糖多酚类物质,得到可以良好分离的蛋白样品,而用TCA/丙酮沉淀法获得的蛋白基本上无法用于2-DE分析。
比较实施例2
(1)新鲜甘薯叶片2g,加液氮研磨粉碎后加入10ml冷冻的TCA/丙酮(含1%巯基乙醇)洗涤,10,000g离心5min后倾去上清。重复此过程直至上清清澈透明;加入10ml-20℃预冷的80%丙酮洗涤两次以上以除去残留的TCA,然后于通风橱室温晾干;
(2)用上样缓冲液(尿素7M,硫尿2M,CHAPS 4%,0.01%溴酚兰)溶解蛋白,BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml,取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH3-10IPG水化至少6h,IEF程序为:100-10,000V 5h线性升压,10,000V保持5h或至总伏时数至60,000V*H。
(3)聚焦完成后的胶条采用两步平衡法进行处理,先用5ml含1%DTT的平衡液平衡12min还原蛋白,再用含碘乙酰胺25mg/L的平衡液平衡12min以烷基化蛋白。
(4)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15%),恒压80V至蛋白转出胶条,再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部0.5cm时,关掉电源,取出凝胶,用胶体考马斯亮蓝(G-250)法染色。
由TCA/丙酮沉淀法制备的蛋白样品颜色发褐,溶解性很差,其2-DE图谱见图5,由于杂质含量太多,整张图像只能分辨出少量几个大点,而对多数蛋白则不能进行有效分离,背景较深,点的弥散及拖尾现象严重。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种植物总蛋白提取液,其特征在于:是含有重蒸酚和还原剂的水溶液;其中,重蒸酚的重量含量为80-90%,还原剂的重量含量为0.2-3%,还原剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇。
2.根据权利要求1所述的植物总蛋白提取液,其特征为:所述巯基乙醇的体积含量为1-3%,所述二硫苏糖醇的重量含量为0.2-1%。
3.根据权利要求1所述的植物总蛋白提取液,其特征在于:是含2%体积的巯基乙醇和85%重量的重蒸酚的水溶液。
4.根据权利要求1、2或3所述植物总蛋白提取液的应用,其特征在于:所述植物总蛋白提取液用于提取植物蛋白。
5.一种植物总蛋白提取方法,其特征在于包括以下具体步骤:
(1)将植物组织在液氮中研磨粉碎,用-20℃预冷的含10-15%重量的三氯乙酸的三氯乙酸/丙酮溶液连续洗涤至上清澄清透明,再以丙酮洗除残留三氯乙酸,晾干备用;对于干果类材料,将材料粉碎后直接用有机溶剂抽提脱脂,然后晾干有机溶剂后备用;
(2)以1-5ml/克植物鲜重的比例加入权利要求1、2或3中所述的植物总蛋白提取液,旋涡混合,室温静置;
(3)于4℃、10,000g离心至少20分钟,吸取上层酚相;下层沉淀可依步骤(2)重复抽提2-3次,合并所得酚相;
(4)将收集到的酚相与5-10倍体积-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇混合,置于0至-20℃沉淀至少10分钟;
(5)于4℃、10,000g离心至少20分钟,弃上清,沉淀用无水甲醇洗涤3-5次,晾干或冻干即得植物蛋白干粉。
6.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法,其特征在于:所述步骤(1)中,三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸的重量含量为10%。
7.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法,其特征在于:所述步骤(2)中,植物总蛋白提取液的添加比例为2-4ml/克植物鲜重。
8.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法,其特征在于:所述步骤(3)中,所述重复抽提为3次。
9.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法,其特征在于:所述步骤(4)为:将收集到的酚相加5-6倍体积的-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇,沉淀温度为-20℃;沉淀时间为10分钟。
10.根据权利要求5所述的植物总蛋白提取方法,其特征在于:所述步骤(5)中,沉淀洗涤次数为3次。
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