CN101696230B - 一种蛋白质双向电泳方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白质双向电泳方法。该方法首先用盐酸胍溶液溶解新鲜制备或冻存的蛋白干粉，再加入终浓度分别为2-5mM的三丁基膦和50-100mM的2-乙烯基吡啶以还原并烷基化蛋白；避光静置反应60-120分钟后加入5-10倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀蛋白；再用乙醇洗除盐分，晾干或冻干后即得烷基化蛋白。烷基化蛋白用于双向电泳分析时，等电聚焦上样缓冲液中可不加还原剂，胶条的平衡也可简化为一步，同时平衡液中也无需再添加还原剂和/或烷基化试剂。本发明可提高蛋白质的溶解性，以及在电泳过程中的稳定性，简化双向电泳的操作步骤进而减少蛋白的损失。能广泛用于蛋白质组学领域。

Description

一种蛋白质双向电泳方法
技术领域
本发明涉及蛋白质组学研究领域中的蛋白质双向电泳技术，具体涉及一种蛋白质的烷基化和双向电泳方法。
背景技术
蛋白质组学研究主要分为蛋白样本的制备分离和蛋白的鉴定两部分。对于后者则主要依赖于生物质谱技术，近年来在这方面的研究已经取得了很大的进步，质谱类仪器也已经是相当的普及。这一方面为蛋白质组学研究的发展提供了便利，一方面也对蛋白样品的制备分离提出了更高的要求。
由于蛋白质组学的研究对象来源广泛且性质复杂，在样品的制备和分离过程中经常会遇到各种各样的问题和困难。对于广泛用于分离蛋白的双向电泳(2-DE)技术目前主要存在以下问题：蛋白样品的溶解需添加还原剂如DTT、TBP等以保持蛋白上巯基残基的还原状态，因为巯基的氧化会导致蛋白长链内/间的交联，进而影响到蛋白的溶解和分离，但目前常用的还原剂都不稳定，如DTT在碱性条件下带负电荷，会在电场作用运动而失效，TBP本身不稳定会降解，这些问题对于聚焦窄范围IPG胶条的影响更为明显，因为窄范围IPG胶条通常会需要更高的聚焦电压和更长的聚焦时间，这样DTT在电场作用下的运动和TBP的降解对蛋白的影响会更加明显。聚焦完成以后的胶条需经过十二烷基硫酸钠(SDS)平衡才可转至第二向SDS-PAGE电泳，平衡通常需要两步，首先用加DTT的平衡液平衡以还原蛋白，再用加有IAA的平衡液平衡以烷基化蛋白，同时消耗掉多余的DTT以避免影响后面的处理，整个平衡过程通常需要30分钟，在这段时间内胶面会受到含SDS、尿素和甘油的平衡液的反复冲洗，一些分布在IPG胶表面的蛋白或小分子量蛋白可能会流失。
发明内容
基于上述现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种蛋白质双向电泳方法，本方法可有效提高蛋白质的溶解性及其在等电聚焦过程中的稳定性，同时还可以简化双向电泳操作，减少蛋白在操作过程中的损失。
本发明的目的通过以下的技术方案来实现：
一种蛋白质双向电泳方法，包括以下步骤：
(1)用6M盐酸胍溶解蛋白干粉，至蛋白浓度为10-30mg/ml；依次加入终浓度分别为2-5mM和50-100mM的三丁基膦和2-乙烯基吡啶，避光静置反应60-120分钟；
(2)4℃、10,000g离心，取上清加入3-10倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀蛋白，冻干得到蛋白干粉；
(3)步骤(2)所得蛋白干粉用等电聚焦上样缓冲液溶解，用于固相预制胶条的水化和聚焦；
(4)聚焦完的固相预制胶条用SDS平衡液平衡，时间为10-20分钟。
优选地，步骤(1)中，所述蛋白浓度为15-25mg/ml，所述三丁基膦和2-乙烯基吡啶的终浓度分别为3-4mM和70-80mM。
优选地，步骤(2)具体为：4℃、10,000g离心至少10分钟，取上清加入3-10倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀蛋白，置于0--20℃至少10分钟后，于4℃、10,000g离心至少10分钟，沉淀用无水乙醇洗涤至少3次以去除盐分，晾干或冻干。
更优选地，步骤(2)中，所述上清中加入的5-6倍体积的-20℃预冷的无水乙醇。
优选地，步骤(3)中，所述上样缓冲液为含尿素7M，硫尿2M，CHAPS4wt％，0.01wt％溴酚兰的水溶液。
优选地，步骤(4)中，SDS平衡液母体为pH 8.8，1.5M的Tris-HCI，其中含尿素6M，甘油30％，SDS 2wt％，溴酚兰0.01wt％；，平衡时间为12-15分钟。
上述还原剂如β-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)、三丁基膦(TBP)等和烷基化试剂如碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺(Acrylamide)等。
相比现有技术，本发明蛋白质双向电泳方法的优点是：用盐酸胍溶解蛋白并作为还原和烷基化反应的介质，盐酸胍是应用最广泛的蛋白变性剂，常用于溶解包涵体中的蛋白，用盐酸胍溶液做为反应介质可避免蛋白质在其它类常用缓冲液中受其溶解性限制而导致的蛋白丢失；以TBP做为还原剂，以2-VP做为烷基化试剂，蛋白的还原和烷基化可一步完成，并且反应迅速、针对性强，不会发生副反应。烷基化后的蛋白由于巯基被保护而无法在长链分子内/间形成二硫键，可以提高蛋白的溶解性和稳定性。使得蛋白在随后的2-DE分析中更容易被分离分析，也不用再考虑等电聚焦过程中经常会发生的还原剂的消耗(如DTT等)或降解(如TBP等)；聚焦完成以后常用的两步法平衡也可以简化为一步，而缩短的平衡时间也意味着更少的蛋白在平衡过程中流失。
附图说明
图1为花生叶片蛋白依据本方法电泳的图谱。
图2为花生幼荚果的全蛋白依据本方法电泳的图谱。
图3为未烷基化的花生叶片蛋白依据两步平衡法电泳的2D图谱。
图4为甘薯叶片全蛋白依据本方法电泳的图谱。
图5为未烷基化的甘薯叶片蛋白依据两步平衡法电泳的2D图谱。
具体实施方式
试剂：
尿素(电泳级)，硫尿，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠(SDS)，DTT，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，甘氨酸购自Amresco，CHAPS(3-[(3-Cholanidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)，TBP，2-VP购自sigma，其它均为普通市售分析纯级试剂。
下述实施例中，无特殊说明，所涉及百分数为重量含量。
实施例1
(1)花生叶片蛋白由改进的酚提法提取。称取2g花生叶片在液氮中研磨粉碎，以15％三氯醋酸(TCA)/丙酮连续洗涤至上清透明，再以丙酮洗除残留TCA，室温晾干后加入3ml蛋白提取液(尿素9M，β-ME 2％(v/v)，Tris 50mM，pH 7.5)混合均匀，再加入3ml Tris-HCI饱和酚(pH 7.5)混合均匀后室温静置10分钟浸提蛋白，于4℃、10,000g离心10分钟后取上层酚相与5倍体积-20℃预冷的含0.1M醋酸铵的甲醇混合，置于-20℃沉淀蛋白10分钟；在于4℃、10,000g离心10分钟，沉淀用甲醇洗涤3次，室温晾干；
(2)称取约10mg由上述方法制备的花生叶片蛋白以0.5ml盐酸胍(6M)溶解，依次加入TBP和2-VP使其终浓度为3mM的80mM，避光静置反应90分钟；
(3)4℃、10,000g离心10分钟后取上清加入5倍体积-20℃预冷的乙醇，于-20℃沉淀蛋白10分钟；4℃、10,000g离心10分钟，沉淀用无水乙醇洗3次，然后冻干冻存或直接用于2-DE分析。
(4)将蛋白溶解于上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，溴酚兰0.01％)中，BCA法定量，调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(pH3-10 11cm IPG水化6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持至总伏时数达到60,000V＊H。
(5)将已聚焦好的IPG胶条取出，沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS2％，溴酚兰0.01％)平衡12分钟。
(6)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白完全转出IPG胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm处时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。。
由图1可以看出花生叶片蛋白在2-DE凝胶上得到了良好的分离，背景清晰且可识别点数较多，酸性端和碱性端以及小分子量区域的蛋白都分离的很好，点形圆润且边界分明。
实施例2
(1)称取约20mg由改进的酚提法制备的花生嫩荚果蛋白以0.5ml盐酸胍(6M)溶解，依次加入TBP和2-VP使其终浓度为3mM的80mM，避光静置90分钟以还原和烷基化蛋白，
(2)4℃、10,000g离心10分钟后取上清加入5倍体积-20℃-20℃预冷的乙醇，于-20℃沉淀蛋白10分钟；4℃、10,000g离心，沉淀用无水乙醇洗3次，然后冻干冻存或直接用于电泳分析。
(3)将蛋白溶解于上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，0.01％溴酚兰)中，BCA法定量，调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(pH3-10，11cm IPG水化6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持至总伏时数达到60,000V＊H。
(4)将已聚焦好的IPG胶条取出，沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS 2％，溴酚兰0.01％)平衡12分钟。
(5)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白完全转出IPG胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm处时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。
由图2可以看出花生嫩荚果的蛋白也得到了很好的分离，蛋白点尖锐清晰，整张凝胶只有很少的横纵条纹和拖尾。特别是凝胶中部的几个大点，也都得到了很好的分离，
比较实施例1
(1)用改进的缓冲液/酚提法制备的花生叶片蛋白，蛋白干粉用加还原剂的上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，DTT 50mM，溴酚兰0.01％)溶解，BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul用于2-DE分析。(pH3-10，11cm IPG水化6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持至总伏时数至60,000V＊H。
(2)聚焦完成后的胶条采用两步平衡法进行处理，先用5ml含1％DTT的SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS 2％，DTT 50mM，溴酚兰0.01％)平衡12分钟还原蛋白，再用含碘乙酰胺55mM的SDS平衡液平衡12分钟以烷基化蛋白。
(3)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白转出胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。
对比图1和图3可以看出，在图3中蛋白较为集中在中间区域，在酸碱极性端以及小分子量端的蛋白没有得到良好的分析，特别是碱性端的蛋白横纹严重，这表明由于还原剂的电泳损失导致了蛋白的氧化，在不同蛋白分子间产生了交联而无法准确聚焦。拖尾则表明在处理过程中蛋白有降解发生，畸形蛋白点的存在则显示在电泳过程中一些蛋白受溶解度控制而析出和再溶解，并对其它蛋白也产生了影响。
实施例3
(1)称取约20mg由酚提法制备的甘薯叶片蛋白以0.5ml盐酸胍(6M)溶解，依次加入TBP和2-VP使其终浓度为3mM的80mM，避光静置90分钟以还原和烷基化蛋白，
(2)4℃、10,000g离心10分钟后取上清加入5倍体积-20℃预冷的乙醇，于-20℃沉淀蛋白10分钟；4℃、10,000g离心，沉淀用无水乙醇洗3次，然后冻干冻存或直接用于电泳分析。
(3)将蛋白溶解于上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，溴酚兰0.01％)中，BCA法定量，调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH 3-10IPG水化6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持至总伏时数达到60,000V＊H。
(4)将已聚焦好的IPG胶条取出，沥干表面矿物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M，甘油30％，SDS2％，溴酚兰0.01％)平衡12分钟。
(5)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白完全转出IPG胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部约0.5cm处时，关掉电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝G-250染色。
由图4可以看出虽然中间部位有一条很明显的水平条纹，但多数甘薯叶片蛋白还是得到了很好的分离，蛋白点尖锐清晰，特别是在凝胶底部，小分子量部分蛋白也都得到了很好了分离。相比由未烷基化蛋白所得的2-DE图像(图5)可知，本方法能有效提高蛋白的溶解性和稳定性，避免不同蛋白在电泳过程中的相互干扰，提高分辨率，同时也减少蛋白的损失，使2-DE图像上能展现更多的蛋白。
比较实施例2
(1)用改进的缓冲液/酚提法制备的甘薯叶片蛋白，蛋白干粉用加还原剂的上样缓冲液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，DTT 50mM，溴酚兰0.01％)溶解，BCA法定量并调整蛋白浓度至2mg/ml，取200ul用于2-DE分析。(11cm pH 3-10IPG水化6h，IEF程序为：100-10,000V 5h线性升压，10,000V保持至总伏时数至60,000V＊H。
(2)聚焦完成后的胶条采用两步平衡法进行处理，先用5ml含1％DTT的SDS平衡液平衡12分钟还原蛋白，再用含碘乙酰胺55mM的SDS平衡液平衡12分钟以烷基化蛋白。
(3)将平衡好的胶条转至第二向SDS-PAGE胶(15％)，恒压80V至蛋白转出胶条，再120V直到溴酚兰指示剂达到凝胶底部0.5cm时，关掉电源，取出凝胶，用胶体考马斯亮蓝(G-250)法染色。
由图5可以看出，蛋白点数明显少于烷基化蛋白样品，原因可能是蛋白难溶而未能提取，或者是在平衡过程中被丢失。蛋白的拖尾则表明受溶解度的影响蛋白在电泳过程中发生了析出和再溶解，或者是在第二向电泳过程中蛋白分子之间发生了氧化交联。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种蛋白质双向电泳方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)用6M盐酸胍溶解蛋白干粉，至蛋白浓度为10-30mg/ml；依次加入终浓度分别为2-5mM和50-100mM的三丁基膦和2-乙烯基吡啶，避光静置反应60-120分钟；
(2)4℃、10,000g离心，取上清加入3-10倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀蛋白，冻干得到蛋白干粉；
(3)步骤(2)所得蛋白干粉用等电聚焦上样缓冲液溶解，用于固相预制胶条的水化和聚焦；
(4)聚焦完的固相预制胶条用SDS平衡液平衡，时间为10-20分钟。
2.根据权利要求1所述的蛋白质双向电泳方法，其特征在于：步骤(1)中，所述蛋白浓度为15-25mg/ml，所述三丁基膦和2-乙烯基吡啶的终浓度分别为3-4mM和70-80mM。
3.根据权利要求1所述的蛋白质双向电泳方法，其特征在于：步骤(2)具体为：4℃、10,000g离心至少10分钟，取上清加入3-10倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀蛋白，置于0～-20℃至少10分钟后，于4℃、10,000g离心至少10分钟，沉淀用无水乙醇洗涤至少3次以去除盐分，冻干。
4.根据权利要求1或3所述的蛋白质双向电泳方法，其特征在于：步骤(2)中，所述上清中加入5-6倍体积的-20℃预冷的无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的蛋白质双向电泳方法，其特征在于：步骤(3)中，所述上样缓冲液为含尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4％，0.01％溴酚兰的水溶液。
6.根据权利要求1所述的蛋白质双向电泳方法，其特征在于：步骤(4)中，SDS平衡液母体为pH 8.8，1.5M的Tris-HCl，其中含尿素6M，甘油30％，SDS 2wt％，溴酚兰0.01wt％；平衡时间为12-15分钟。
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