CN112526036A - 一种用于人胰岛素及其类似物n末端序列分析的在线烷基化及hplc拆链方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化以及基于HPLC的拆链方法，可以实现人胰岛素及其类似物A、B链N末端氨基酸序列的正确测定，该法经济、环保、节省时间。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化以及基于HPLC的双链拆分方法
背景技术
蛋白质和多肽的氨基酸排列顺序即氨基酸序列是其结构和功能的基础，因此在开发蛋白质和多肽类药物时，必须要保证氨基酸序列是正确的，这就需要进行蛋白质和多肽的测序。基于Edman降解原理和氨基酸序列分析仪的N末端氨基酸序列分析是最经典的蛋白质和多肽的测序方法。
用于治疗糖尿病的人胰岛素是一种广泛使用的生物技术药物，人们基于不同的应用目的对人胰岛素进行了改构，研发出了系列人胰岛素类似物，包括门冬胰岛素、羟脯胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、赖精胰岛素等。人胰岛素及其类似物结构基本相似，都由A、B两个肽链组成，含有2个链间二硫键和1个链内二硫键。
不同于一般的蛋白质类生物技术药物，人胰岛素及其类似物的N末端氨基酸序列分析有两个问题需要解决，一是不能确定每一循环测出的氨基酸到底是属于A链还是B链，因此必须将A、B链拆开，分别测定。二是半胱氨酸必须经烷基化修饰，转变成PE-PTH-Cys才能被检测到。
针对这两个问题，我们开发了基于HPLC的人胰岛素及其类似物拆链技术，同时将二硫键的还原和半胱氨酸的烷基化修饰融于HPLC的进样程序中，在线完成。
所涉及的方法和步骤具体如下：
发明内容
本发明针对人胰岛素及其类似物N末端的序列分析，采用基于HPLC的双链拆分技术和在线的二硫键的还原和半胱氨酸的烷基化修饰。达到分别正确测定人胰岛素及其类似物A、B 链N末端氨基酸序列的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：
1、二硫键还原和烷基化修饰
1)称取适量样品，以缓冲液(0.1M Tris-cl pH8.4，含6M盐酸胍)直接溶解成浓度为 5mg/ml的溶液，
2)新鲜配制反应液：30μLDTT溶液(30mg/mL)，再加入1.5μL 4-乙烯基吡啶，混匀。
3)HPLC进样程序：
吸取50μL样品溶液，吸取5μL反应液，混匀，静止10分钟后，注入HPLC。
2、A、B肽链的拆分
1)色谱柱为C18液相色谱柱(4.6×150mm，5μm)。流动相为水-乙腈(各含0.1％TFA)。
2)梯度洗脱：
| 时间 | 流动相B |
| 0min | 10％ |
| 2min | 10％ |
| 35min | 60％ |
流速设置为1mL/min。检测波长为214nm。分别收集保留时间为16分钟(A链)和20分钟(B链)的色谱峰，待分析。
3、N末端氨基酸序列分析
分别取20μL收集的样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上；氩气吹干，上样，蛋白质序列分析仪自动进行样品的N末端氨基酸序列分析。
本发明的优点及有益效果为：
1)本发明采用的二硫键还原和烷基化修饰方法在线完成，减少了人工操作，避免人体和有机毒害试剂过多接触，既节省了时间，又保护身体健康。
2)本发明将胰岛素双链拆分开，分别上样分析，实现了准确测定。
3)本发明采用HPLC拆链和样品制备，在这个过程中完成了脱盐处理。
4)目前，人胰岛素和类似物的研发、质控、生产和需求量很大，本发明可推广应用，实现较大经济利益。
附图说明
图1中a图为未经还原烷基化处理的样品HPLC分析图谱，门冬胰岛素的保留时间为24.177分钟。b图为经过在线还原烷基化处理后的HPLC分析制备图谱，门冬胰岛素A链的保留时间为15.655分钟，A链的保留时间为19.564分钟，分别收集各峰峰尖部分，进行N- 末端氨基酸序列测定。
图2中a图为未经还原烷基化处理和HPLC拆链的样品N端第1个氨基酸残基，该图提供一个对照，说明在未经过任何处理的情况下，经过第一个Edman降解循环后，N端第一个氨基酸序列分析结果为G(Gly，甘氨酸)或F(Phe，苯并氨酸)，该图不能准确的证明G和 F属于A链还是B链。b图为经在线还原烷基化处理和HPLC拆链的A链N端第1个氨基酸残基，该图提供了明确的证据证明A链N端第1个氨基酸残基甘氨酸(G)。同样c图证明了B链N端第1个氨基酸残基为苯并氨酸(F)，d图证明了B链N端第7个氨基酸残基为半胱氨酸(C，Cys)，如果未经烷基化修饰，该图不会显示Cys的色谱峰。
具体实施方式
实施例1
门冬胰岛素N-末端氨基酸序列测定：
门冬胰岛素是胰岛素类似物的一种，通过将人胰岛素B链28位的脯氨酸更换为门冬氨酸制成，从而改变分子间的相互作用，实现速效的目的。
采用本发明提供的方法，将门冬胰岛素成功的实现了A、B链的拆分(图1)和半胱氨酸的烷基化修饰。经蛋白序列分析仪测定，N-端部分氨基酸序列分析结果见图2.
上述实施例只为说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能依此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于包括以下步骤：
1、二硫键还原和烷基化修饰
1)称取适量样品，以缓冲液(0.1M Tris-cl pH8.4，含6M盐酸胍)直接溶解成浓度为5mg/ml的溶液，
2)新鲜配制反应液：30μL DTT溶液(30mg/mL)，再加入1.5μL 4-乙烯基吡啶，混匀。
3)HPLC进样程序：
吸取50μL样品溶液，吸取5μL反应液，混匀，静止10分钟后，注入HPLC。
2、A、B肽链的拆分
1)色谱柱为C18液相色谱柱(4.6×150mm，5μm)。流动相为水-乙腈(各含0.1％TFA)。
2)梯度洗脱，
流速设置为1mL/min。检测波长为214nm。分别收集保留时间为16分钟(A链)和20分钟(B链)的色谱峰，待分析。
3、N末端氨基酸序列分析
分别取20μL收集的样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上；氩气吹干，上样，蛋白质序列分析仪自动进行样品的N末端氨基酸序列分析。
2.根据权利要求1所述的用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于：
二硫键还原和烷基化修饰方法在线完成，减少了人工操作，避免人体和有机毒害试剂过多接触，既节省了时间，又保护身体健康。
3.根据权利要求1所述的用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于：
将胰岛素双链拆分开，分别上样分析，实现了准确测定。
4.根据权利要求1所述的用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于：
经过HPLC的分离制备的样品，无需脱盐处理。
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| CN202011367794.7A CN112526036A (zh) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | 一种用于人胰岛素及其类似物n末端序列分析的在线烷基化及hplc拆链方法 |
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