CN108226362A - 一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法 - Google Patents

一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法，用于聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的质量控制，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(C18，2.1×150mm，

Description

一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测 方法
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱分析方法，尤其是一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法。
背景技术
聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物属于长效型GLP-1类似物，用于治疗人2型糖尿病。该药物以已上市GLP-1类似物Byetta结构为基础，通过不同序列比对和计算机模拟，化学合成不同氨基酸序列的Byetta类似物多肽，利用体外活性比较和稳定性考察等方法筛选得到了一种最优的促胰岛素分泌肽类似物氨基酸序列多肽。该多肽具有较优的与胰岛β细胞的亲和性、稳定性和体内外生物活性。
聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的化学式为C172H265N49O58S2，氨基酸序列为：HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PGGSGGSC。
到目前为止，国内外药典和文献中均没有记载聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法，但聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着产品质量，所以建立一种稳定有效的分析检测方法对聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体进行质量控制是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的高效液相色谱分析检测方法，用于聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的质量控制。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：
一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(C18，2.1×150mm，1.7μm)，以0.05～0.1％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.05～0.1％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B；以检测波长为214nm，进行高效液相色谱法分析检测，执行梯度洗脱程序，设置如下：
进一步地，流动相优选为：以0.05％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.05％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B。
所述的梯度洗脱程序优选为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 76 24
20 73 27
35 55 45
37 76 24
45 76 24
本发明所述的分析检测方法，可通过以下步骤实现：
A、取聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体样品适量，用30％乙腈溶解，配制成每1ml含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体0.5～1.5mg的样品溶液；
B、设置流动相流速为0.28～0.32ml/min，检测波长214nm，柱温为43～47℃；
C、取A的样品溶液2μl注入液相色谱仪，完成聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测；
其中：
高效液相色谱仪：Agilent 1290液相色谱系统；
色谱柱：Waters ACQUITYPeptide CSHTMC18column，1.7μm，2.1mm×150mm；
流动相：以0.05％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.05％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B，梯度洗脱设置如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 76 24
20 73 27
35 55 45
37 76 24
45 76 24
检测波长：214nm；
柱温：45℃；
流速：0.3ml/min。
本发明涉及的分析检测方法，可以有效的将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体及其杂质分开，而且该方法线性关系良好，操作简单，重复性及耐用性好，结果稳定可靠，从而可用于聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。
附图说明
图1 实施例1的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体HPLC图谱。
图2 实施例2的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体HPLC图谱。
图3 实施例3的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体HPLC图谱。
图4 实施例7的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体线性工作曲线。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
仪器与条件：Agilent 1290液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Waters ACQUITYPeptide CSHTMC18column，1.7μm，2.1mm×150mm；检测波长：214nm；柱温为45℃；流速0.3ml/min；以0.05％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.05％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B，梯度洗脱设置如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 76 24
20 73 27
35 55 45
37 76 24
45 76 24
实验步骤：将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体用30％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液2μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1。
附图1表明，在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰和杂质峰可以完全分离，且聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰的保留时间在11.696min左右。
实施例2
仪器与条件：Agilent 1290液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Waters ACQUITYPeptide CSHTMC18column，1.7μm，2.1mm×150mm；检测波长：214nm；柱温为43℃；流速0.32ml/min；以0.1％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.1％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B，梯度洗脱设置如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 74 26
20 67 33
35 50 50
37 74 26
45 74 26
实验步骤：将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体用30％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液2μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。
附图2表明，在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰和杂质峰可以完全分离，且聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰的保留时间在10.396min左右。
实施例3
仪器与条件：Agilent 1290液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Waters ACQUITYPeptide CSHTMC18column，1.7μm，2.1mm×150mm；检测波长：214nm；柱温为47℃；流速0.28ml/min；以0.08％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.08％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B，梯度洗脱设置如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
30 75 25
35 60 40
40 20 20
50 20 20
实验步骤：将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体用30％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液2μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3。
附图3表明，在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰和杂质峰可以完全分离，且聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰的保留时间在12.238min左右。
实施例4
系统适应性实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，加30％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，分别计算聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1。
表1聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体系统适用性实验结果
由表1可知，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰面积的相对标准偏差为0.38％，保留时间的相对标准偏差为1.10％。可见，该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析结果稳定可靠。
实施例5
重复性实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，加30％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液，同法配制6份供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，按面积归一化法计算聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体含量，并计算其相对标准偏差，实验结果见表2。
表2聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体重复性实验结果
由表2可知，各供试品溶液中聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的含量没有明显差异，相对标准偏差为0.27％，可见本分析检测方法的重复性良好。
实施例6
耐用性实验
仪器与条件：Agilent 1290液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Waters ACQUITYPeptide CSHTMC18column，1.7μm，2.1mm×150mm；以0.05％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.05％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B，梯度洗脱设置如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 76 24
20 73 27
35 55 45
37 76 24
45 76 24
实验步骤：取本品适量，精密称定，加30％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液。分别通过改变柱温、流速和色谱柱批号，记录聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体含量的变化情况，实验结果见表3。
表3聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体耐用性实验结果
由表3可知，改变柱温、流速和色谱柱批号后，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体含量的测定结果没有明显差异，且主成分和相邻杂质分离度均符合规定，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。
实施例7
线性与范围实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体样品102.8mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加30％乙腈溶解并稀释至刻度，作为线性储备液。精密量取线性储备液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml分别置于10ml容量瓶中，用30％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，将供试品溶液注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析。以供试品溶液的浓度(mg/ml)为横坐标，以聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体峰峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程A＝4081.96C-59.76，结果见附图4。
由附图4可知，图中趋势线的相关系数r＝0.9995，可见在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体在0.4112mg/ml～1.5420mg/ml的浓度范围内线性关系良好。

Claims (4)

1.一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测方法，采用高效液相色谱法进行分析检测，其特征在于包括以下步骤：
A、取聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体样品适量，用30％乙腈溶解，配制成每1ml含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体0.5～1.5mg的样品溶液；
B、设置流动相流速为0.28～0.32ml/min，检测波长214nm，柱温为43～47℃；
C、取A的样品溶液2μl注入液相色谱仪，完成聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物中间体的分析检测；
其中，色谱柱：C18，2.1×150mm，1.7μm；
流动相：以0.05～0.1％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.05～0.1％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B；
梯度洗脱设置如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 74～80 20～26 20 67～75 25～33 35 50～60 40～50 37 74～80 20～26 45 74～80 20～26
2.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述的样品溶液浓度为1mg/ml。
3.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述的流动相流速为0.3ml/min，检测波长为214nm，柱温为45℃。
4.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：以0.05％三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，以0.05％三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B，梯度洗脱设置如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 76 24 20 73 27 35 55 45 37 76 24 45 76 24
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