CN114487164B - 保护氨基酸与其n端脱掉保护基的杂质的分离检测方法 - Google Patents

保护氨基酸与其n端脱掉保护基的杂质的分离检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，属于氨基酸或多肽合成的质量控制技术领域。本发明提供了保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，采用阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法测定，所述阳离子交换柱为锂离子交换色谱柱，流动相依次采用缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4进行洗脱。采用本发明提供的分离检测方法可以对化学合成多肽起始物料中氨基酸类似物杂质进行有效控制，填补了化学合成多肽起始物料对该类杂质控制的空白。

Description

保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法
技术领域
本发明涉及保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，属于氨基酸或多肽合成的质量控制技术领域。
背景技术
保护氨基酸是化学合成多肽的通用起始物料，通常氨基酸的N端被保护基团所保护，一些氨基酸的侧链也有保护基团，如酪氨酸的侧链羟基，色氨酸的侧链吲哚基，组氨酸的侧链咪唑基，丝氨酸的侧链羟基，精氨酸的侧链胍基等，通常都需要保护起来。在化学合成多肽生产制造过程中，氨基酸的N端和部分侧链之所以需要保护起来，就是因为这些基团在未保护的情况下发生大量的副反应，消耗大量的起始物料、偶联试剂等，也产生大量的杂质，显著降低有效偶联反应，同时也增加后续纯化对杂质的去除难度和工艺时长，极度降低产品收率，甚至得不到合格的原料药产品。副反应的产生的杂质，随着多肽偶联反应的进行，每一步都会衍生出新的副产物，所以杂质的数量会随着反应步骤呈指数形式增加。这众多的杂质，一旦出现在产品中，就可能对产品的有效性、安全性等方面产生影响，这也是各药审机构不仅格外关注产品中杂质还要求企业对起始物料进行严格控制的原因。就生产成本而言，副反应造成物料消耗增加，纯化工艺难度增加，车间占用时长的增加、产品收率严重下降，将大大提高生产成本。因此多肽原料药生产企业除了有满足法规强制要求外，从自身成本出发也必要对起始物料中的杂质严格控制。
保护氨基酸中的一类非常重要的杂质就是N端保护基团脱掉的杂质，该类杂质主要是游离氨基酸，但是部分保护氨基酸除了N端有保护，侧链也有保护基团，那么这类保护氨基酸就需要多控制一类N端保护基脱掉而侧链有保护基的杂质(本发明中有时称为N端游离侧链保护的氨基酸，或简称为氨基酸类似物)。对于游离氨基酸的检测，检测方法种类众多，可以概括为经过衍生后通过液相色谱或者气相色谱分离，再采用紫外检测器、荧光检测或者质谱进行分析的柱前衍生方法，或者先经过离子交换色分离后再进行衍生检测的柱后衍生方法，还有非衍生的方法是经过特殊的柱分离后采用质谱检测。这些方法在蛋白质、多肽、营养液的氨基酸组分研究中多有应用，现行美国药典、欧洲药典等药典中均有相应通则，现行中国药典也有相应的通则公示稿。然而，针对N端游离侧链有保护基团的氨基酸类似物杂质的检测，目前还鲜有报道。对于保护氨基酸的质量控制，亟需更加全面地检测其中存在的杂质，进而提高杂质控制检测结果的准确性。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法。
本发明提供了保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，采用阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法测定，所述阳离子交换柱为锂离子交换色谱柱，流动相依次采用缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4进行洗脱，其中，缓冲液1的锂离子浓度为0.27～0.35mol/L，pH值为2.8～3.1；缓冲液2的锂离子浓度为0.45～0.53mol/L，pH值为3.1～3.3；缓冲液3的锂离子浓度为0.85～1.0mol/L，pH值为3.45～3.5；缓冲液4的锂离子浓度为1.5～1.7mol/L，pH值为3.5～3.65。
进一步地，
每1L缓冲液1的配制方法为：取0.27～0.35mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至2.8～3.1；
每1L缓冲液2的配制方法为：取0.45～0.53mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.1～3.3；
每1L缓冲液3的配制方法为：取0.85～1.0mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.5；
每1L缓冲液4的配制方法为：取1.5～1.7mol的LiCl，0.08～0.11mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.65。
优选地，缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4中所述的醇溶剂各自独立选自异丙醇和/或甲醇。
进一步优选地，
每1L缓冲液1的配制方法为：取0.29～0.30mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.00～3.05；
每1L缓冲液2的配制方法为：取0.50～0.51mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.20～3.21；
每1L缓冲液3的配制方法为：取1.0mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.50；
每1L缓冲液4的配制方法为：取1.6～1.7mol的LiCl，0.10～0.11mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.6。
进一步地，流动相采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0003443111890000021
Figure BDA0003443111890000031
优选地，梯度洗脱程序如下：
序号 时间(min) 流动相 柱温℃
1 0-5 缓冲液1 34
2 5-13 缓冲液2 34
3 13-24 缓冲液3 34
4 24-40 缓冲液4 45
5 40-70 缓冲液4 95
进一步地，所述阳离子交换柱以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂。
优选地，所述阳离子交换柱为Ultropac 8阳离子交换柱或LCA K07阳离子交换柱。
优选地，所述阳离子交换柱的规格为150mm×4.6mm，粒径5～10μm。
进一步优选地，所述阳离子交换柱的粒径为7～8μm。
进一步优选地，所述阳离子交换柱的粒径为7μm。
进一步地，所述分离检测方法包括用上样溶剂上样的步骤，所述上样溶剂的锂离子浓度为0.15～0.23mol/L，pH值为2.0～2.3。
优选地，每1L上样溶剂的配制方法为：取0.15～0.23mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，加水至1L，然后调节pH至2.0～2.3。
进一步优选地，每1L上样溶剂的配制方法为：取0.20～0.22mol的LiCl，0.04～0.05mol的柠檬酸，加水至1L，然后调节pH至2.1～2.2。
进一步地，所述缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4、上样溶剂各自独立地选用LiOH和/或HCl调节pH值。
进一步地，进样体积10～60μl。
优选地，进样体积20μl。
流动相流速0.3～0.6ml/min。
优选地，流动相流速0.35ml/min。
柱后茚三酮衍生的衍生反应管温度为125～135℃。
优选地，柱后茚三酮衍生的衍生反应管温度为130℃。
进一步地，每1L茚三酮衍生液的成分为：茚三酮20g，甲醇600ml，苯酚2g和醋酸钾钠缓冲液400ml，其中，每1L醋酸钾钠缓冲液的配制方法为：取醋酸钠272.0g，醋酸钾196.0g，加入水500ml，冰醋酸200ml，使溶解，混匀，用醋酸溶液调节pH至5.55±0.05，加水至1L。
优选地，每1L茚三酮衍生液中还含有0.2g抗坏血酸。
进一步地，茚三酮衍生液流速0.2～0.3ml/min。
优选地，茚三酮衍生液流速0.25ml/min。
进一步地，检测波长为570nm。
优选地，检测波长为570nm和440nm。
进一步地，所述氨基酸包括Tyr、Trp、His中至少一种。
进一步地，所述保护氨基酸的保护基选自芴甲氧羰基、叔丁基、叔丁氧羰基、三苯甲基、硝基中至少一种。
进一步地，所述保护氨基酸包括Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH中至少一种。
进一步地，所述N端脱掉保护基的杂质包括H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His(Trt)-OH中至少一种。
优选地，所述N端脱掉保护基的杂质还包括H-Tyr-OH、H-Trp-OH、H-His-OH中至少一种。
进一步地，所述氨基酸还包括Ser、Arg中至少一种。
进一步地，所述保护氨基酸还包括Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH中至少一种。
进一步地，所述N端脱掉保护基的杂质还包括H-Arg(NO2)-OH、H-Ser(tBu)-OH中至少一种。
优选地，所述N端脱掉保护基的杂质还包括H-Arg-OH、H-Ser-OH中至少一种。
优选地，检测样品中还含有Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、H-Pro-OH、H-Leu-OH中至少一种成分。
本发明还提供了适用于锂系统的缓冲液组合包，其含有独立包装的缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4，其中，缓冲液1的锂离子浓度为0.27～0.35mol/L，pH值为2.8～3.1；缓冲液2的锂离子浓度为0.45～0.53mol/L，pH值为3.1～3.3；缓冲液3的锂离子浓度为0.85～1.0mol/L，pH值为3.45～3.5；缓冲液4的锂离子浓度为1.5～1.7mol/L，pH值为3.5～3.65。
进一步地，
每1L缓冲液1的配制方法为：取0.27～0.35mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至2.8～3.1；
每1L缓冲液2的配制方法为：取0.45～0.53mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.1～3.3；
每1L缓冲液3的配制方法为：取0.85～1.0mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.5；
每1L缓冲液4的配制方法为：取1.5～1.7mol的LiCl，0.08～0.11mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.65。
优选地，缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4中所述的醇溶剂各自独立选自异丙醇和/或甲醇。
进一步优选地，
每1L缓冲液1的配制方法为：取0.29～0.30mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.00～3.05；
每1L缓冲液2的配制方法为：取0.50～0.51mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.20～3.21；
每1L缓冲液3的配制方法为：取1.0mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.50；
每1L缓冲液4的配制方法为：取1.6～1.7mol的LiCl，0.10～0.11mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.6。
进一步地，所述缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4各自独立地选用LiOH和/或HCl调节pH值。
本发明还提供了将所述的缓冲液组合包用于分离检测保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的用途。
进一步地，所述氨基酸包括Tyr、Trp、His中至少一种。
进一步地，所述保护氨基酸的保护基选自芴甲氧羰基、叔丁基、叔丁氧羰基、三苯甲基、硝基中至少一种。
进一步地，所述保护氨基酸包括Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH中至少一种。
进一步地，所述N端脱掉保护基的杂质包括H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His(Trt)-OH中至少一种。
优选地，所述N端脱掉保护基的杂质还包括H-Tyr-OH、H-Trp-OH、H-His-OH中至少一种。
进一步地，所述氨基酸还包括Ser、Arg中至少一种。
进一步地，所述保护氨基酸还包括Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH中至少一种。
进一步地，所述N端脱掉保护基的杂质还包括H-Arg(NO2)-OH、H-Ser(tBu)-OH中至少一种。
优选地，所述N端脱掉保护基的杂质还包括H-Arg-OH、H-Ser-OH中至少一种。
优选地，检测样品中还含有Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、H-Pro-OH、H-Leu-OH中至少一种成分。
本发明中，各缓冲液优选在通氮气保护情况下使用，优选去除其中的氧避免其氧化衍生液，甚至可以添加抗氧化剂来除氧，如苯酚等。为避免缓冲液长菌等原因导致缓冲液被污染或者pH发生改变，优选在缓冲液中添加有机试剂实现抑菌。以下实施例和对比例中使用的缓冲液均经过通氮除氧。
本发明的一些实施例中，也可以直接使用氨基酸分析仪厂家，如Biochrom(百康)公司提供的茚三酮衍生液。
本发明中，茚三酮衍生液优选通氮气除氧20min。
本发明中，为清洗色谱柱、保证色谱柱的正常使用，以及平衡柱子、方便下一次进样，梯度洗脱程序结束后还有进一步的再生程序。其中，再生液优选采用0.3～0.4M的LiOH，进一步优选地采用0.3M的LiOH。再生程序如下：
时间(min) 流动相种类 柱温℃
70-85 再生液 95
85-95 缓冲液1 34
本发明中，供试品溶液的制备方法包括如下步骤：样品中加入所述上样溶剂萃取，取上层清液进样。由此，能够通过缓冲盐体系将起始物料中游离氨基酸及氨基酸类似物充分提取出来。优选地，对于不易溶解的样品，还包括加入二氯甲烷溶解的步骤。
本发明方法能够用于多种化学合成多肽起始物料与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测，尤其有效地解决了N端游离侧链具有保护基团的氨基酸类似物杂质难以被识别、分离和定量的问题。采用本发明方法可以对化学合成多肽起始物料中氨基酸类似物杂质进行有效控制，填补了化学合成多肽起始物料对该类杂质控制的空白。
附图说明
图1为实施例1的分离检测结果色谱图；
图2为实施例2的分离检测结果色谱图；
图3为实施例3的分离检测结果色谱图；
图4为实施例4中混标对照品的色谱图；
图5为对比例1中生理体液对照品分离色谱图；
图6为对比例1中H-Tyr(tBu)-OH的检测结果色谱图；
图7为对比例1中H-Trp(Boc)-OH的检测结果色谱图；
图8为对比例1中H-His(Trt)-OH的检测结果色谱图；
图9为对比例2的检测结果色谱图。
具体实施方式
本发明提供了保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，采用阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法测定，所述阳离子交换柱为锂离子交换色谱柱，流动相依次采用缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4进行洗脱，其中，缓冲液1的锂离子浓度为0.27～0.35mol/L，pH值为2.8～3.1；缓冲液2的锂离子浓度为0.45～0.53mol/L，pH值为3.1～3.3；缓冲液3的锂离子浓度为0.85～1.0mol/L，pH值为3.45～3.5；缓冲液4的锂离子浓度为1.5～1.7mol/L，pH值为3.5～3.65。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：为对多肽合成起始物料中N端脱掉保护基的杂质进行质量控制，发明人首先尝试采用现有技术中针对蛋白质、多肽水解液或者营养液中游离氨基酸的检测方法，该方法是通过强阳离子交换树脂进行分离，然后茚三酮衍生，再于570nm和440nm进行检测。然而，目前常规的色谱条件对N端游离侧链保护的氨基酸类似物的检测缺乏针对性，多种氨基酸类似物在现有条件下无法被有效检测，比如，Tyr、Trp、His的氨基酸类似物杂质根本不能正常出峰。可能的原因是，从物质结构出发，N端游离侧链具有保护基团的氨基酸类似物和常规的氨基酸结构发生了重大改变，进而导致其溶解性、等电点、疏水性、亲水性、氢键形成等众多理化性质发生根本的变化，在原有的分离模式下，既有的分析方法的参数已经不能适用于N端游离侧链具有保护基团的氨基酸类似物的检测。采用现有检测方法存在的另一大问题是，即使针对游离氨基酸的检测，有时分析时间长达3小时，再生时间长达1小时，分析效率低，对衍生液、流动相的消耗大，分析成本高。而且，流动相通常需要使用由氨基酸分析仪厂家提供的专用缓冲液，其配方保密，处于垄断地位，进一步导致分析成本变高。
本发明的关键之一是提供了一种适合于阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法分离检测保护氨基酸与其N端脱掉保护基杂质的缓冲液组合，包括缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4，其各自具有特定的离子强度和pH值，依次进行洗脱后能够让各种氨基酸类似物在锂离子交换系统上分离开来，分离后的成分再通过衍生系统将各种氨基酸类似物与茚三酮衍生，衍生后的产物最后通过570nm检测(有时需进一步于440nm检测)，测定吸收值。由此不仅能够对多种化学合成多肽起始物料中残留的正常的游离氨基酸杂质准确识别、分离和定量，还能够准确识别、分离和定量其中的各种N端游离侧链具有保护基团的杂质。同时，分析时间、再生时间均大幅缩短，再加上本发明采用的缓冲液组合配制简单，成本低廉，可持续获得，有利于降低分析成本。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
前面提到的多肽合成的起始物料，包括多种N端和侧链都具有保护基团的保护氨基酸，以下实施例和对比例中选择了其中5种采用现有方法不易与其类似物杂质进行分离检测的起始物料(Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，后三种物料产生的氨基酸类似物杂质在常规色谱条件下甚至不能够正常出峰)，同时与另2种多肽合成中常用的保护氨基酸(Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH)组成混合物料，以此来展示本发明方法在分离检测效果上的优越性。混合物料中总共7种主要成分的化学结构如下所示：
①Fmoc-Arg(NO2)-OH
Figure BDA0003443111890000081
②Fmoc-Ser(tBu)-OH
Figure BDA0003443111890000082
③Fmoc-Tyr(tBu)-OH
Figure BDA0003443111890000083
④Fmoc-Trp(Boc)-OH
Figure BDA0003443111890000091
⑤Fmoc-His(Trt)-OH
Figure BDA0003443111890000092
⑥Fmoc-Pro-OH
Figure BDA0003443111890000093
⑦Fmoc-Leu-OH
Figure BDA0003443111890000094
上述物料需要控制的杂质包括H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH、H-Pro-OH、H-Leu-OH。
实施例1采用本发明方法检测含有氨基酸类似物的物料
1)样品溶液配制：取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品适量，用上样溶剂溶解并稀释制成各对照品10μg/ml的分别配制单标和混标溶液。
2)方法溶液：
上样溶剂配制：取0.2mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸至1L纯水中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.2。
缓冲液1:取0.3mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.0。
缓冲液2：取0.5mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.2。
缓冲液3：取1.0mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
缓冲液4：取1.6mol的LiCl，0.1mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
再生液：0.3M的LiOH。
衍生液：取茚三酮20g，加甲醇600ml，苯酚2g，搅拌使溶解，加入醋酸钾钠缓冲液(取醋酸钠272.0g，醋酸钾196.0g，加入水约500ml，冰醋酸200ml，使溶解，混匀，用醋酸溶液调pH值至5.55±0.05，用水稀释定容至1000ml)400ml，混匀，加入0.2g抗坏血酸(用少量甲醇溶解后加入)，摇匀，通氮气除氧20min即得。
3)检测参数：采用以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂的色谱柱Ultropac 8，柱子规格150mm×4.6mm，粒径7μm，购买自Biochrom(百康)公司。流动相流速0.35ml/min，衍生液流速0.25ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序和再生程序如下：
表1
Figure BDA0003443111890000101
Figure BDA0003443111890000111
从图1可以看出，采用本发明分离检测方法，不仅5种氨基酸类似物都能出峰，还可以同时检测到全部的游离氨基酸杂质，能够更准确地对保护氨基酸进行质量控制。各成分出峰时间分别如下：570nm波长下，12.81min为H-Ser-OH，21.62min为H-Ser(tBu)-OH，26.93min为H-Arg(NO2)-OH，31.84min为H-Leu-OH，36.15min为H-Tyr-OH，44.76min为H-Trp(Boc)-OH，47.77min为H-Tyr(tBu)-OH，52.48min为H-His-OH和H-His(Trt)-OH，57.69min为H-Trp-OH，61.91min为H-Arg-OH；440nm波长下，21.41min为H-Pro-OH。而且，分析时间缩短至70分钟，再生时间25分钟，分析效率高；对衍生液、流动相的消耗较小，分析成本较低。
实施例2采用本发明方法检测含有氨基酸类似物的物料
在实施例1的基础上对洗脱梯度进行调整，调整如下：
表2
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-1.5 缓冲液1 28
2 1.5-30 缓冲液2 38
3 30-45 缓冲液2 56
4 45-50 缓冲液3 82
5 50-90 缓冲液4 82
6 90-100 再生液 95
7 100-110 缓冲液1 56
从图2可以看出，采用本发明分离检测方法，不仅5种氨基酸类似物都能出峰，还可以同时检测到全部的游离氨基酸杂质，能够更准确地对保护氨基酸进行质量控制。各成分出峰时间分别如下：570nm波长下，25.1min为H-Ser-OH，35.2min为H-Ser(tBu)-OH，35.8min为H-Arg(NO2)-OH，42.5min为H-Leu-OH，47.7min为H-Tyr-OH，61.1min为H-Trp(Boc)-OH，64.2min为H-Tyr(tBu)-OH，75.5min为H-His-OH和H-His(Trt)-OH，78.5min为H-Trp-OH，89.9min为H-Arg-OH，36.4min为基线峰；440nm波长下，35.8min为H-Pro-OH。而且，分析时间缩短至90分钟，再生时间20分钟，分析效率高；对衍生液、流动相的消耗较小，分析成本较低。不过，与实施例1的最佳条件相比，本实验部分成分分离度有待进一步提高，另外有成分出峰在基线坡度上，分析时间也有待进一步缩短。
实施例3采用本发明方法检测含有氨基酸类似物的物料
在实施例1的基础上对洗脱梯度进行调整，调整如下：
表3
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-15 缓冲液1 28
2 15-25 缓冲液2 34
3 25-45 缓冲液2 38
4 45-60 缓冲液3 56
5 60-85 缓冲液4 95
6 90-100 再生液 95
7 100-110 缓冲液1 56
从图3可以看出，采用本发明分离检测方法，不仅5种氨基酸类似物都能出峰，还可以同时检测到全部的游离氨基酸杂质，能够更准确地对保护氨基酸进行质量控制。各成分出峰时间分别如下：570nm波长下，20.5min为H-Ser-OH，20.92min为H-Ser(tBu)-OH，23.03min为H-Arg(NO2)-OH，27.15min为H-Leu-OH，32.46min为H-Tyr-OH，41.98min为H-Trp(Boc)-OH，47.89min为H-Tyr(tBu)-OH，51.01min为H-His-OH和H-His(Trt)-OH，61.8min为H-Trp-OH，64.712min为H-Arg-OH；440nm波长下，23.20min为H-Pro-OH。而且，分析时间缩短至85分钟，再生时间20分钟，分析效率高；对衍生液、流动相的消耗较小，分析成本较低。不过，与实施例1的最佳条件相比，本实验前段2个成分的分离度有待进一步提高，另外基线波动明显，分析时间也有待进一步缩短。
实施例4方法专属性
1)取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品适量，用上样溶剂溶解并稀释制成各对照品10μg/ml的分别配制单标和混标溶液。
2)方法溶液配制：
上样溶剂配制：取0.18mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸至1L纯水中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.2。
缓冲液1：取0.31mol的LiCl，0.048mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.95。
缓冲液2：取0.49mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.17。
缓冲液3：取0.95mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
缓冲液4：取1.6mol的LiCl，0.08mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
再生液：0.3M的LiOH。
衍生液：取茚三酮20g，加甲醇600ml，苯酚2g，搅拌使溶解，加入醋酸钾钠缓冲液(取醋酸钠272.0g，醋酸钾196.0g，加入水约500ml，冰醋酸200ml，使溶解，混匀，用醋酸溶液调pH值至5.55±0.05，用水稀释定容至1000ml)400ml，混匀，加入0.2g抗坏血酸(用少量甲醇溶解后加入)，摇匀，通氮气除氧20min即得。
3)检测参数：采用以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂的色谱柱Ultropac 8，柱子规格150mm×4.6mm，粒径7μm，购买自Biochrom(百康)公司。流动相流速0.35ml/min，衍生液流速0.25ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序和再生程序如下：
表4
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-5 缓冲液1 34
2 5-13 缓冲液2 34
3 13-24 缓冲液3 34
4 24-40 缓冲液4 45
5 40-70 缓冲液4 95
6 70-85 再生液 95
7 85-95 缓冲液1 34
4)实验结果
色谱图见图4，各杂质出峰时间列在下表中：
表5
Figure BDA0003443111890000131
Figure BDA0003443111890000141
实施例5方法重复性
1)样品溶液配制：取Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH各50mg，加5ml二氯甲烷使溶解后，加5ml上样溶剂萃取，静置待分层，取上层清液作为供试品溶液进样(10mg/ml)。取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-L-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-D-Ser-OH、H-D-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-L-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品各适量，用上样溶剂溶解并稀释制成10μg/ml的混合对照品溶液，平行进样3针。(注：H-His-OH、H-His(Trt)-OH出峰有部分重叠，单独配置)取Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH各50mg，加5ml二氯甲烷使溶解后，加入5ml混合对照品溶液萃取，静置待分层，取上层清液作为供试品加标溶液进样，供试品加标溶液平行配制6份，各进样一针。
2)方法溶液配制：
上样溶剂配制：取0.18mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸至1L纯水中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.2。
缓冲液1：取0.31mol的LiCl，0.048mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.95。
缓冲液2：取0.49mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.17。
缓冲液3：取0.95mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
缓冲液4：取1.6mol的LiCl，0.08mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
再生液：0.3M的LiOH。
衍生液：氨基酸分析仪厂家Biochrom(百康)公司提供的茚三酮衍生液。
3)检测参数：采用以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂的色谱柱Ultropac 8，柱子规格150mm×4.6mm，粒径7μm，购买自Biochrom(百康)公司。流动相流速0.35ml/min，衍生液流速0.25ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序和再生程序如下：
表6
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-5 缓冲液1 34
2 5-13 缓冲液2 34
3 13-24 缓冲液3 34
4 24-40 缓冲液4 45
5 40-70 缓冲液4 95
6 70-85 再生液 95
7 85-95 缓冲液1 34
4)实验结果：
表7对照品结果
Figure BDA0003443111890000151
Figure BDA0003443111890000161
表8供试品本底溶液各杂质含量结果
Figure BDA0003443111890000162
Figure BDA0003443111890000171
表9供试品加标溶液重复性结果
Figure BDA0003443111890000172
Figure BDA0003443111890000181
Figure BDA0003443111890000191
Figure BDA0003443111890000201
Figure BDA0003443111890000211
Figure BDA0003443111890000221
Figure BDA0003443111890000231
上述实验结果显示，本发明方法重复性良好。
更换实验人员在不同时间重复操作，中间精密度结果如下：
表10对照品结果
Figure BDA0003443111890000232
Figure BDA0003443111890000241
表11供试品本底溶液各杂质含量结果
Figure BDA0003443111890000242
Figure BDA0003443111890000251
表12加标溶液中间精密度结果
Figure BDA0003443111890000252
Figure BDA0003443111890000261
Figure BDA0003443111890000271
Figure BDA0003443111890000281
Figure BDA0003443111890000291
Figure BDA0003443111890000301
Figure BDA0003443111890000311
从上述实验结果可以看出，本发明方法精密度良好。
实施例6方法线性
1)取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品适量，用上样溶剂溶解并稀释制成含H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH对照品分别为3μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml和20μg/ml，含H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH浓度分别为15μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml，含H-His-OH、H-His(Trt)-OH浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的混标溶液，作为不同浓度的线性溶液。
2)方法溶液配制：
上样溶剂配制：取0.18mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸至1L纯水中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.2。
缓冲液1:取0.31mol的LiCl，0.048mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.95。
缓冲液2：取0.49mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.17。
缓冲液3：取0.95mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
缓冲液4：取1.6mol的LiCl，0.08mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
再生液：0.3M的LiOH。
衍生液：氨基酸分析仪厂家Biochrom(百康)公司提供的茚三酮衍生液。
3)检测参数：采用以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂的色谱柱Ultropac 8，柱子规格150mm×4.6mm，粒径7μm，购买自Biochrom(百康)公司。流动相流速0.35ml/min，衍生液流速0.25ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序和再生程序如下：
表13
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-5 缓冲液1 34
2 5-13 缓冲液2 34
3 13-24 缓冲液3 34
4 24-40 缓冲液4 45
5 40-70 缓冲液4 95
6 70-85 再生液 95
7 85-95 缓冲液1 34
4)实验结果：
表14
Figure BDA0003443111890000321
Figure BDA0003443111890000331
Figure BDA0003443111890000341
Figure BDA0003443111890000351
以上实验结果显示，各游离氨基酸和氨基酸类似物在5微克每毫升至100微克每毫升的范围内线性良好。
实施例7方法检测限和定量限度
1)取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品适量，用上样溶剂溶解并稀释制混标溶液，稀释研究方法定量限。
2)方法溶液配制：
上样溶剂配制：取0.18mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸至1L纯水中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.2。
缓冲液1:取0.31mol的LiCl，0.048mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.95。
缓冲液2：取0.49mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.17。
缓冲液3：取0.95mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
缓冲液4：取1.6mol的LiCl，0.08mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
再生液：0.3M的LiOH。
衍生液：氨基酸分析仪厂家Biochrom(百康)公司提供的茚三酮衍生液。
3)检测参数：采用以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂的色谱柱Ultropac 8，柱子规格150mm×4.6mm，粒径7μm，购买自Biochrom(百康)公司。流动相流速0.35ml/min，衍生液流速0.25ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序和再生程序如下：
表15
Figure BDA0003443111890000352
Figure BDA0003443111890000361
4)实验结果：
表16定量限结果
Figure BDA0003443111890000362
Figure BDA0003443111890000371
Figure BDA0003443111890000381
表17检测限结果
Figure BDA0003443111890000382
Figure BDA0003443111890000391
Figure BDA0003443111890000401
以上实验结果表明，本发明方法灵敏度良好。
实施例8方法准确度
1)样品溶液配制：取Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH各50mg，加5ml二氯甲烷使溶解后，加5ml上样溶剂萃取，静置待分层，取上层清液作为供试品溶液进样(10mg/ml)。取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品各适量，用上样溶剂溶解并稀释制成1-100μg/ml的不同浓度的混合对照品溶液。(注：H-His-OH、H-His(Trt)-OH出峰有部分重叠，单独配置)取Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH各50mg，加5ml二氯甲烷使溶解后，加入5ml不同浓度的混合对照品溶液萃取，静置待分层，取上层清液作为供试品加标溶液进样，各浓度各进样一针。
2)方法溶液配制：
上样溶剂配制：取0.18mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸至1L纯水中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.2。
缓冲液1：取0.31mol的LiCl，0.048mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.95。
缓冲液2：取0.49mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.17。
缓冲液3：取0.95mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
缓冲液4：取1.6mol的LiCl，0.08mol的柠檬酸，异丙醇15ml，添加纯水至1L中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.5。
再生液：0.3M的LiOH。
衍生液：氨基酸分析仪厂家Biochrom(百康)公司提供的茚三酮衍生液。
3)检测参数：采用以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂的色谱柱Ultropac 8，柱子规格150mm×4.6mm，粒径7μm，购买自Biochrom(百康)公司。流动相流速0.35ml/min，衍生液流速0.25ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序和再生程序如下：
表18
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-5 缓冲液1 34
2 5-13 缓冲液2 34
3 13-24 缓冲液3 34
4 24-40 缓冲液4 45
5 40-70 缓冲液4 95
6 70-85 再生液 95
7 85-95 缓冲液1 34
4)实验结果：
表19对照品溶液结果
Figure BDA0003443111890000421
Figure BDA0003443111890000431
表20供试品本底溶液中各杂质的含量结果
Figure BDA0003443111890000432
表21方法回收率结果
Figure BDA0003443111890000433
Figure BDA0003443111890000441
Figure BDA0003443111890000451
Figure BDA0003443111890000461
Figure BDA0003443111890000471
Figure BDA0003443111890000481
Figure BDA0003443111890000491
Figure BDA0003443111890000501
Figure BDA0003443111890000511
上述实验结果显示，本发明方法准确度良好。
实施例9方法耐用性
对方法溶液配制的浓度进行调整考察方法耐用性，调整后对照品分离对比结果如下：
1)样品溶液配制：取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品适量，用上样溶剂溶解并稀释制成各对照品10μg/ml的混标溶液。
2)方法溶液配制：
上样溶剂配制：取0.22mol的LiCl，0.04mol的柠檬酸至1L纯水中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至2.1。
缓冲液1:取0.29mol的LiCl，0.06mol的柠檬酸，甲醇50ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.05。
缓冲液2：取0.51mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸，甲醇50ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.21。
缓冲液3：取1.0mol的LiCl，0.05mol的柠檬酸，甲醇50ml，添加纯水至1L，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.45。
缓冲液4：取1.7mol的LiCl，0.11mol的柠檬酸，甲醇50ml，添加纯水至1L中，然后用LiOH或者浓盐酸调节pH至3.6。
再生液：0.4M的LiOH。
衍生液：氨基酸分析仪厂家Biochrom(百康)公司提供的茚三酮衍生液。
3)检测参数：采用以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂的色谱柱Ultropac 8，柱子规格150mm×4.6mm，粒径7μm，购买自Biochrom(百康)公司。流动相流速0.35ml/min，衍生液流速0.25ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序和再生程序如下：
表22
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-5 缓冲液1 34
2 5-13 缓冲液2 34
3 13-24 缓冲液3 34
4 24-40 缓冲液4 45
5 40-70 缓冲液4 95
6 70-85 再生液 95
7 85-95 缓冲液1 34
4)实验结果：
方法溶液浓度调整前后对照品溶液中各组分的分离对比情况如下：
表23
Figure BDA0003443111890000521
Figure BDA0003443111890000531
可以看出，条件调整后组分分离良好，表明本发明方法耐用性较好。
对比例1在现有的氨基酸分析条件下多种氨基酸类似物不出峰
本实验表明多种氨基酸类似物采用现有的氨基酸分析方法根本不能正常出峰，更无法同时分析多种N端游离而侧链具有保护基团的氨基酸类似物。
根据氨基酸分析仪Biochrom30+厂家提供的生理体液的分析方法对上述杂质进行分析。生理体液的氨基酸分析系统是适用于复杂样品的分析方法，相较于钠系统分析方法而言，分离能力更强。仪器厂家提供的氨基酸分析方法能够分离40种游离氨基酸(N端游离且侧链没有保护基)。厂家提供的生理体液分析方法参数以及生理体液对照品分离结果如下，图谱可见图5。
1)样品溶液：
A：厂家提供的生理体液对照品，含39种氨基酸的标准品溶液。
B：取H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-L-Arg(NO2)-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His-OH、H-His(Trt)-OH对照品适量，用上样溶剂溶解并稀释制成各对照品10μg/ml的分别配制单标。
2)方法溶液配制：厂家提供的锂系统缓冲液1、锂系统缓冲液2、锂系统缓冲液3、锂系统缓冲液4、锂系统缓冲液5、锂系统缓冲液6。上样溶剂为0.2M的LiCl，盐酸调节pH值到2.0。衍生液由厂家提供。
3)检测方法参数：以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂，柱子规格是150mm×4.6mm，粒径7μm；流动相流速0.4ml/min，衍生液流速0.2ml/min；衍生反应管温度130℃；检测波长570nm和440nm；进样体积20μl；梯度洗脱程序、再生程序如下：
表24洗脱梯度程序
Figure BDA0003443111890000532
Figure BDA0003443111890000541
表25再生程序
序号 时间(min) 流动相种类 柱温℃
1 0-15 缓冲液5 81
2 15-21 缓冲液6 81
3 21-27 缓冲液1 81
4 27-57 缓冲液1 50
5 57-63 缓冲液1 30
4)实验结果
生理体液对照品分析实验结果如下：
Figure BDA0003443111890000542
Figure BDA0003443111890000551
待测试样品的分析结果如下：
待测样品中正常的游离氨基酸H-Pro-OH、H-Arg-OH、H-Leu-OH、H-Ser-OH、、H-Tyr-OH、H-Trp-OH和H-His-OH有正常出峰，N端游离侧链具有保护氨基酸的对照品溶液(H-Ser(tBu)-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His(Trt)-OH)仅有H-Ser(tBu)-OH、H-Arg(NO2)-OH出峰，而H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His(Trt)-OH在该色谱条件下没有出峰，见图6、图7、图8。
5)实验结论：该色谱条件下，多种N端游离侧链具有保护基团的氨基酸类似物不能够正常出峰，更无法同时检测多种N端游离侧链具有保护基团的氨基酸类似物。此外，该方法分析时间长达3小时，再生时间长达1小时，分析效率低。对衍生液、流动相的消耗较大，分析成本高。
对比例2利用现有氨基酸分析方法的最强洗脱能力也无法洗脱多种氨基酸类似物
H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His(Trt)-OH在对比例1的色谱条件下均没有出峰，因此本实验对其分析方法参数进行调整，采用洗脱能力最强的锂系统缓冲液6进行洗脱，同时将柱温调整至对比例1中最高温度82摄氏度，在此最强洗脱条件下洗脱40分钟。
实验结果显示，仍然未见H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-His(Trt)-OH洗脱出峰，见图9。说明多种N端游离侧链具有保护基团的氨基酸类似物在此类分析方法下根本就不可能被洗脱出峰，更不可能实现同时检测，因此进一步证明分离能力强的生理体液分析方法不能适用于化学合成起始物料中各种N端游离侧链有保护基团的氨基酸类似物的检测。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (16)

1.保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，其特征是：采用阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法测定，所述阳离子交换柱为锂离子交换色谱柱，流动相依次采用缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4进行洗脱，其中，缓冲液1的锂离子浓度为0.27～0.35mol/L，pH值为2.8～3.1；缓冲液2的锂离子浓度为0.45～0.53mol/L，pH值为3.1～3.3；缓冲液3的锂离子浓度为0.85～1.0mol/L，pH值为3.45～3.5；缓冲液4的锂离子浓度为1.5～1.7mol/L，pH值为3.5～3.65；
所述保护氨基酸包括Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Hi s(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH中至少一种；
所述N端脱掉保护剂的杂质包括H-Arg-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Ser-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Tyr-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-Hi s-OH、H-Hi s(Trt)-OH、H-Pro-OH、H-Leu-OH中至少一种；
所述分离检测方法包括用上样溶剂上样的步骤，所述上样溶剂的锂离子浓度为0.15～0.23mol/L，pH值为2.0～2.3；
所述阳离子交换柱以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂；
流动相采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0004062941840000021
2.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：
每1L缓冲液1的配制方法为：取0.27～0.35mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至2.8～3.1；
每1L缓冲液2的配制方法为：取0.45～0.53mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.1～3.3；
每1L缓冲液3的配制方法为：取0.85～1.0mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.5；
每1L缓冲液4的配制方法为：取1.5～1.7mol的LiCl，0.08～0.11mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.65。
3.如权利要2所述的分离检测方法，其特征是：所述缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4中所述的醇溶剂各自独立选自异丙醇和/或甲醇。
4.如权利要1所述的分离检测方法，其特征是：
每1L缓冲液1的配制方法为：取0.29～0.30mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.00～3.05；
每1L缓冲液2的配制方法为：取0.50～0.51mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.20～3.21；
每1L缓冲液3的配制方法为：取1.0mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.50；
每1L缓冲液4的配制方法为：取1.6～1.7mol的LiCl，0.10～0.11mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.6。
5.如权利要求1～4任意一项所述的分离检测方法，其特征是：梯度洗脱程序如下：
序号 时间(min) 流动相 柱温℃ 1 0～5 缓冲液1 34 2 5～13 缓冲液2 34 3 13～24 缓冲液3 34 4 24～40 缓冲液4 45 5 40～70 缓冲液4 95。
6.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：所述阳离子交换柱为Ultropac 8阳离子交换柱或LCA K07阳离子交换柱。
7.如权利要求1或6所述的分离检测方法，其特征是：所述阳离子交换柱的规格为150mm×4.6mm，粒径5～10μm。
8.如权利要求7所述的分离检测方法，其特征是：所述阳离子交换柱的粒径为7～8μm。
9.如权利要求7所述的分离检测方法，其特征是：所述阳离子交换柱的粒径为7μm。
10.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：每1L上样溶剂的配制方法为：取0.15～0.23mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，加水至1L，然后调节pH至2.0～2.3。
11.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：每1L上样溶剂的配制方法为：取0.20～0.22mol的LiCl，0.04～0.05mol的柠檬酸，加水至1L，然后调节pH至2.1～2.2。
12.如权利要求1～4、10、11任意一项所述的分离检测方法，其特征是：所述缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4、上样溶剂各自独立地选用LiOH和/或HCl调节pH值。
13.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：满足以下至少一项：
进样体积10～60μl；
流动相流速0.3～0.6ml/min；
柱后茚三酮衍生的衍生反应管温度为125～135℃；
每1L茚三酮衍生液的成分为：茚三酮20g，甲醇600ml，苯酚2g和醋酸钾钠缓冲液400ml，其中，每1L醋酸钾钠缓冲液的配制方法为：取醋酸钠272.0g，醋酸钾196.0g，加入水500ml，冰醋酸200ml，使溶解，混匀，用醋酸溶液调节pH至5.55±0.05，加水至1L；
茚三酮衍生液流速0.2～0.3ml/min；
检测波长为570nm。
14.如权利要求13所述的分离检测方法，其特征是：满足以下至少一项：
进样体积20μl；
流动相流速0.35ml/min；
柱后茚三酮衍生的衍生反应管温度为130℃；
每1L茚三酮衍生液中还含有0.2g抗坏血酸；
茚三酮衍生液流速0.25ml/min；
检测波长为570nm和440nm。
15.适用于锂系统的缓冲液组合包，其特征是：含有独立包装的缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4，其中，缓冲液1的锂离子浓度为0.27～0.35mol/L，pH值为2.8～3.1；缓冲液2的锂离子浓度为0.45～0.53mol/L，pH值为3.1～3.3；缓冲液3的锂离子浓度为0.85～1.0mol/L，pH值为3.45～3.5；缓冲液4的锂离子浓度为1.5～1.7mol/L，pH值为3.5～3.65。
16.权利要求15所述的缓冲液组合包用于分离检测保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的用途。
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