CN111812240B - 一种缩宫素及三种杂质的分离方法和应用 - Google Patents

一种缩宫素及三种杂质的分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缩宫素及三种杂质的分离方法和应用。其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液即可；供试品溶液为含有缩宫素的水溶液；高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式进行洗脱，流动相A为水相和乙腈的混合液，所述水相为10‑150mmol/L磷酸二氢钠溶液，pH值为4.9～6.2；所述水相与所述乙腈的体积比为95:5～85:15；流动相B为乙腈。本发明检测方法能够同时有效分离缩宫素及其三种杂质，具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点，可用于缩宫素原料和制剂有关物质的检测，实现缩宫素生产工艺中主要工艺杂质和潜在降解杂质的精确控制，提高缩宫素产品的质量。

Description

一种缩宫素及三种杂质的分离方法和应用
技术领域
本发明涉及药物检测领域，更具体地，涉及一种缩宫素及三种杂质的检测方法。
背景技术
缩宫素又名催产素，是由8种氨基酸组成的九肽药物，分子式：C43H66N12O12S2，分子量1007.2，结构式：Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。它能够刺激子宫收缩和乳汁排出，临床上主要用于诱导促进分娩、缩短第三产程、控制产后出血等。
缩宫素对温度和pH比较敏感，因环境温度或pH的变化在制备和贮藏中有可能生成3种有关物质：[Glu4]缩宫素，结构式Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)；[Gly9OH]缩宫素，结构式Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly(1,6二硫键)；[+Gly10]缩宫素，结构式Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Gly-NH2(1,6二硫键)。
不同种类的杂质引入药物成品中，将会导致不同的用药安全性问题，在缩宫素原料合成阶段和制剂阶段都需要对这3种有关物质的含量进行严格控制。但是，这3种有关物质的结构与缩宫素类似，国内外药典(中国药典(2020版)、欧洲药典(EP9.8)、美国药典(USP41)和日本药典(JP17版))收载的缩宫素原料药及其注射液质量标准中给出的有关物质检测方法难以对其有效分离。
因此，建立一种能够同时有效分离缩宫素、[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素的高效液相色谱法，对于缩宫素的精确质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术无法同时有效分离缩宫素、[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素，提供了一种能够同时分离缩宫素及3种杂质的检测方法。本方法具有分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点，可用于缩宫素原料药合成工艺和制剂工艺中过程质量控制和终产品的质量评价。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种缩宫素及3种杂质的分离方法，其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液即可；
其中，所述供试品溶液为含有缩宫素的水溶液；所述高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式进行洗脱，流动相A为水相和乙腈的混合液，所述水相为10-150mmol/L磷酸二氢钠溶液，pH值为4.9～6.2；所述水相与所述乙腈的体积比为(95:5)～(85:15)；流动相B为乙腈；
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如表1所述：
表1梯度洗脱条件
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 90-98 2-10
7 85-92 8-15
10 80-90 10-20
12 70-80 20-30
13 70-80 20-30
13.1 90-98 2-10
16 90-98 2-10
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A和流动相B”总体积之比；
所述3种杂质为[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素。
本发明中，所述杂质[Glu4]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质[Gly9OH]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly(1,6二硫键)。
所述杂质[+Gly10]缩宫素，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Gly-NH2(1,6二硫键)。
本发明，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度可为0.002～0.2mg/mL，优选0.01～0.1mg/mL，例如0.02mg/mL。
本发明，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度可为0.00002～0.2mg/mL，优选0.002～0.1mg/mL，例如0.001mg/mL。
本发明，所述高效液相色谱检测中，色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，例如Xbridge C18色谱柱。所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格优选为150mm×4.6mm，5μm。
本发明中，优选，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
表2梯度洗脱条件
Figure BDA0002585219490000021
Figure BDA0002585219490000031
。
更优选，所述梯度洗脱条件如表3所示：
表3梯度洗脱条件
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 95 5
7 88 12
10 85 15
12 75 25
13 75 25
13.1 95 5
16 95 5
。
本发明中，所述水相优选为80～120mmol/L磷酸二氢钠溶液，更优选为100mmol/L磷酸二氢钠溶液。
本发明中，所述水相的pH值优选为5.0～6，例如5.4～5.8。
本发明中，所述流动相A中，所述水相与所述有机相的体积分数总计为100份。所述水相与所述乙腈的体积比优选为(92:8)～(88:12)，更优选为90:10。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温可为20℃～40℃；优选为25℃～38℃，例如32℃。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，流动相A和流动相B的总流速为0.5～2.0mL/min，优选为1.5mL/min。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的进样量可为10～100μL，优选为100μL。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，检测波长可为210～230nm，优选为220nm。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，所用的检测器可为紫外检测器或光电二极管阵列检测器。
在本发明一较佳实施方式中，提供的用高效液相色谱法测定缩宫素及其3种杂质的方法，具体包括以下步骤：
a.分别取适量缩宫素、[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素称定，加水溶解并稀释制成4份浓度均约为0.02mg/mL的溶液；
b.每份溶液取100μL，按照所述高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间；所述高效液相色谱法的检测过程中，柱温为20～32℃，pH值为5～5.8；
c.配制缩宫素混合溶液，其中，缩宫素浓度为0.02mg/mL，[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素浓度分别为1μg/mL。
d.所述缩宫素混合溶液取样100μL，按照上述高效液相色谱法进行检测，根据步骤b中缩宫素及各杂质保留时间，观察缩宫素混合溶液中缩宫素与各杂质，各杂质之间的分离情况。
本发明还提供了一种所述缩宫素及3种杂质的分离方法在缩宫素和所述3种杂质的分析检测或含量测定中的应用。
本发明中，利用所述高效液相色谱的检测方法，对缩宫素和所述3种杂质进行分析检测或含量测定。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明高效液相色谱检测方法能够同时有效分离缩宫素及其3种杂质，具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点，可用于缩宫素原料和制剂有关物质的检测，解决目前国内外药典及文献中没有控制缩宫素特定杂质方法的技术问题，实现缩宫素生产工艺中主要工艺杂质和潜在降解杂质的精确控制，提高缩宫素产品的质量。
附图说明
图1为对比例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图2为对比例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图3为对比例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图4为对比例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图5为对比例3中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图6为对比例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图7为对比例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图8为对比例5中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图9为对比例6中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图10为实施例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图11为实施例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图12为实施例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图13为实施例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图14为实施例3中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图15为实施例3中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图16为实施例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图17为实施例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图18为实施例5中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图19为实施例5中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图20为实施例6中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图21为实施例6中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中，产品的来源和型号如下：
乙腈为HPLC级，购自Fisher公司；
无水磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司；
缩宫素制剂Pitocin(Oxytocin Injection,Usp)，批号332937；购于帕尔制药有限公司(Par Pharmaceutical Inc)。
缩宫素原料按照中国专利文献CN 110016072A一种缩宫素的精制方法进行精制获得。
[Glu4]缩宫素按照中国专利文献CN 110078797A一种缩宫素[4-Glu]杂质的精制方法进行精制获得。[Gly9OH]缩宫素按照中国专利文献CN 110028556A一种缩宫素[-NH2]杂质的精制方法进行精制获得。[+Gly10]缩宫素(批号：OP021919YH-018)购自浙江昂拓莱斯生物技术有限公司。
实施例中，所使用的仪器型号及来源如下：
1260Infinity高效液相色谱仪(美国，Agilent)；Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)；XS205DU分析天平(瑞士，Mettler-Toledo)；AL204分析天平(瑞士，Mettler-Toledo)；FiveEasy pH计(瑞士，Mettler-Toledo)。
实施例中，所使用的数据处理软件为Chemstation化学工作站。
对比例1
本对比例采用中国药典(2020版)/欧洲药典(EP9.8)方法检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其3种有关物质的分离情况。
实验条件如下所示。其中，本实验中柱温、Xbridge色谱柱均为自行选择(在中国药典中并未提及柱温和色谱柱类型，欧洲药典中规定色谱柱长125mm)，其它实验条件均按照中国药典或欧洲药典进行。
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)
柱温：30℃
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液，流动相B为体积比乙腈：水＝50:50混合溶液。中国药典或者欧洲药典中，均未对流动相A进行调节pH值，仅采用100mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A，其pH值为4.4。
流速：1.0mL/min。
检测波长：220nm
梯度如表4所示：
表4对比例1的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 70 30
30 40 60
30.1 70 30
45 70 30
进样量：100μL。
检测器：紫外检测器
1、样品配制及检测：分别取适量缩宫素、[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素称定，加水溶解并稀释制成4份浓度均约为0.02mg/mL的溶液。
每份溶液取100μL，照对比例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、取缩宫素原料20mg，置于50mL容量瓶中，用水溶解并定容，得到0.4mg/mL缩宫素溶液；量取0.4mg/mL的缩宫素溶液和步骤1制得的0.02mg/mL的各杂质溶液各1mL，置同一20mL容量瓶中，用水稀释并定容，摇匀，得到每1mL约含缩宫素0.02mg及各杂质分别1μg的溶液，即为缩宫素混合溶液。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到色谱图1，其放大图如图2所示。
实验结果：图1和图2分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为8.824min的色谱峰是缩宫素峰，[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素保留时间相同(8.453min)，色谱峰重合。本对比例可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素分离，但[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素之间相互重合。
对比例2
本对比例采用美国药典(USP41)方法检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其3种杂质的分离情况。
实验条件如下所示。其中，本实验柱温、Xbridge色谱柱均为自行选择，美国药典中并未提及(美国药典中提及柱温用室温，色谱柱用C18色谱柱(5μm，4.6mm×120mm)，流速约1.5ml/min，可作调整)，其它实验条件均按照美国药典进行。
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)
柱温：25℃
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液，流动相B为体积比乙腈：水＝50:50混合溶液。美国药典中，未对流动相A进行调节pH值，仅采用100mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A，其pH值为4.4。
流速：1.0mL/min。
梯度如表5所示：
表5对比例2的洗脱程序
Figure BDA0002585219490000071
Figure BDA0002585219490000081
进样量：100μL
检测器：紫外检测器
检测波长：220nm
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到色谱图3，其放大图如图4所示。
实验结果：图3和图4分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.929min的色谱峰是缩宫素峰，[Glu4]缩宫素与缩宫素保留时间相近，色谱峰重合。[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素保留时间相同(7.631min)，色谱峰重合。本对比例可将缩宫素与[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素分离。但缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素与[+Gly10]缩宫素色谱分重合，不能分离。
对比例3
本对比例中与实施例1相比，除了流动相A、流动相B采用中国、欧洲或美国药典中公开的流动相以外，其它操作和条件均与实施例1相同，采用如实施例1中的洗脱程序，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其3种杂质的分离情况。实验条件如下：
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)
柱温：32℃
检测波长：220nm
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液，其pH值为4.4；流动相B为体积比乙腈：水＝50:50混合溶液。
流速：1.5mL/min。
梯度如实施例1的洗脱程序
1、4份浓度均约为0.02mg/mL的溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到色谱图5。
实验结果：
图5为缩宫素混合溶液检测的HPLC图，缩宫素及其3种杂质均未被检出。本对比例色谱条件下，缩宫素及其3种杂质均难以从色谱柱中洗脱出来。
对比例4
本对比例中与实施例1相比，除了流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝4.6)：乙腈＝90:10的混合溶液以外，其它操作和条件均与实施例1相同，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其3种杂质的分离情况。实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝4.6)：乙腈＝90:10的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱6，其放大图如图7所示。
实验结果：图6和图7分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为6.232min的色谱峰是缩宫素峰，保留时间为5.682min的色谱峰是[Glu4]缩宫素，[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素保留时间相同(5.863min)，色谱峰重合。
本对比例色谱方法中流动相A水相pH为4.6，其他条件与实施例1相同，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素分离。但[Gly9OH]缩宫素与[+Gly10]缩宫素色谱分重合，不能分离。
对比例5
本对比例中与实施例1相比，除了流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.4)：乙腈＝80:20的混合溶液以外，其它操作和条件均与实施例1相同，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其3种杂质的分离情况。实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.4)：乙腈＝80:20的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱8。
实验结果：图8为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为1.870min的色谱峰是缩宫素峰，[+Gly10]缩宫素与缩宫素保留时间相近，色谱峰重合。[Glu4]缩宫素和[Gly9OH]缩宫素保留时间相同(1.525min)，色谱峰重合。
本对比例色谱方法中除流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.4)：乙腈＝80:20的混合溶液，其它均与实施例1相同，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素分离，但缩宫素与[+Gly10]缩宫素色谱峰重合，[Glu4]缩宫素与[Gly9OH]缩宫素色谱峰重合，不能分离。
对比例6
本对比例中与实施例1相比，除了洗脱程序以外，其它操作和条件均与实施例1相同，检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其3种杂质的分离情况。实验条件如下：
色谱条件：洗脱程序如表6，其他条件与实施例1相同。
表6对比例6的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 88 12
7 84 16
10 82 18
12 75 25
13 75 25
13.1 95 5
16 95 5
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照对比例6实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照对比例6实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱9。
实验结果：图9为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为3.029min的色谱峰是缩宫素峰，[Glu4]缩宫素和[Gly9OH]缩宫素保留时间相同(2.318min)，色谱峰重合。保留时间为2.788min的色谱峰是[+Gly10]缩宫素。
本对比例色谱方法中洗脱程序不在本发明范围内，其它均与实施例1相同，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素分离。但[Glu4]缩宫素与[Gly9OH]缩宫素色谱峰重合，不能分离。
实施例1
本实施例为缩宫素及其3种杂质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱柱：Xbridge C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)
柱温：32℃
流动相：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.4)：乙腈＝90:10的混合溶液，流动相B为乙腈。
流速：1.5mL/min。
梯度如表7所示：
表7实施例1的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 95 5
7 88 12
10 85 15
12 75 25
13 75 25
13.1 95 5
16 95 5
进样量：100μL。
检测器：紫外检测器
检测波长：220nm
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱10，其放大图如图11所示。
实验结果：图10和图11分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.130min的色谱峰是缩宫素峰，其余3个色谱峰分别为[Glu4]缩宫素(保留时间5.595min)、[Gly9OH]缩宫素(保留时间6.007min)和[+Gly10]缩宫素(保留时间6.740min)。本实施例实验分析时间为16min，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素有效分离，并且3种杂质之间也可以有效分离，最小分离度大于2.0。
实施例2
本实施例为柱温20℃条件下缩宫素及其3种杂质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：柱温为20℃，其他条件与实施例1相同。
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例2实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱12，其放大图如图13所示。
实验结果：图12和图13分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.120min的色谱峰是缩宫素峰，其余3个色谱峰分别为[Glu4]缩宫素(保留时间5.653min)、[Gly9OH]缩宫素(保留时间6.279min)和[+Gly10]缩宫素(保留时间6.770min)。
本实施例色谱方法中色谱柱柱温为20℃，其他条件与实施例1相同，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素有效分离，并且3种杂质之间也可以有效分离，最小分离度大于2.0。
实施例3
本实施例为柱温40℃条件下缩宫素及其3种杂质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：柱温为40℃，其他条件与实施例1相同。
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例3实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱14，其放大图如图15所示。
实验结果：图14和图15分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.127min的色谱峰是缩宫素峰，其余3个色谱峰分别为[Glu4]缩宫素(保留时间5.555min)、[Gly9OH]缩宫素(保留时间5.815min)和[+Gly10]缩宫素(保留时间6.712min)。
本实施例色谱方法中色谱柱柱温为40℃，其他条件与实施例1相同，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素有效分离，并且3种杂质之间也可以有效分离，最小分离度大于1.5。
实施例4
本实施例为流动相A的pH＝5.0条件下缩宫素及其3种杂质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝5.0)：乙腈＝90:10的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例4实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱16，其放大图如图17所示。
实验结果：图16和图17分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为6.502min的色谱峰是缩宫素峰，其余3个色谱峰分别为[Glu4]缩宫素(保留时间5.427min)、[Gly9OH]缩宫素(保留时间5.796min)和[+Gly10]缩宫素(保留时间6.139min)。
本实施例色谱方法中流动相A的pH＝5.0，其他条件与实施例1相同，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素有效分离，并且3种杂质之间也可以有效分离，最小分离度大于2.0。
实施例5
本实施例为流动相A为pH＝6.0条件下缩宫素及其3种杂质分离情况实施例，实验条件如下：
色谱条件：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH＝6.0)：乙腈＝90:10的混合溶液，其他条件与实施例1相同。
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液，照实施例5实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱18，其放大图如图19所示。
实验结果：图18和图19分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图，根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间为7.758min的色谱峰是缩宫素峰，其余3个色谱峰分别为[Glu4]缩宫素(保留时间5.887min)、[Gly9OH]缩宫素(保留时间6.104min)和[+Gly10]缩宫素(保留时间7.332min)。
本实施例色谱方法中流动相A的pH＝6.0，其他条件与实施例1相同，可将缩宫素与[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素有效分离，并且3种杂质之间也可以有效分离，最小分离度大于1.5。
实施例6
本实施例为缩宫素制剂有关物质检测实施例
采用与实施例1相同的实验条件，对缩宫素制剂Pitocin(Oxytocin Injection,Usp)有关物质进行测定。
1、4份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、取缩宫素制剂(批号332937)100μL，照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，得到图谱20，其放大图如图21。
图20和图21分别为缩宫素制剂检测的HPLC完整图、局部放大图。根据缩宫素及各杂质的保留时间，图中保留时间7.177min的色谱峰是缩宫素峰，保留时间5.5548min的色谱峰是[Glu4]缩宫素，保留时间5.938min的色谱峰是[Gly9OH]缩宫素，保留时间6.248min和9.068min的色谱峰为未知杂质。保留时间1～2min的色谱峰峰为醋酸溶剂峰，12～14min的色谱峰为缩宫素制剂辅料中的三氯叔丁醇，这两个色谱峰不计入积分。按面积归一化法计算，缩宫素制剂有关物质含量结果如表8所示。
表8缩宫素制剂有关物质结果
Figure BDA0002585219490000151
上述百分比为缩宫素制剂中各组分相对于缩宫素的质量百分比。
实施例7
灵敏度试验
采用与实施例1相同的实验条件进行实验。
1、分别取适量缩宫素原料、[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素精密称定，加水溶解并稀释制成4份浓度均约为0.02mg/ml的溶液；
2、取浓度为0.02mg/ml的缩宫素、[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素溶液各1ml，置于同一100ml量瓶中，用水稀释定容，得到缩宫素及各杂质浓度均为0.2μg/ml的混合溶液。将混合溶液用水逐步稀释，得到各组分浓度分别为0.04μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml的混合溶液。
4、照实施例1实验条件，以高效液相色谱法进行检测，获得的色谱图中，杂质峰高约为基线噪音高的3-5倍，则此时溶液的浓度即为组分的检测限；获得的色谱图中，杂质峰高约为基线噪音高的10-20倍，则此时溶液的浓度即为组分的定量限。缩宫素及其3种杂质的检测限及定量限如表9所示，说明本方法灵敏度高。
表9缩宫素及其3种杂质的检测限及定量限
组分 检测限ng 定量限ng
[Glu<sup>4</sup>]缩宫素 1.2 2.3
[Gly<sup>9</sup>OH]缩宫素 0.8 1.6
[+Gly<sup>10</sup>]缩宫素 1.3 2.5
缩宫素 1.2 2.5

Claims (15)

1.一种缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：利用高效液相色谱检测供试品溶液即可；
其中，所述供试品溶液为含有缩宫素的水溶液；所述高效液相色谱检测中，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，采用梯度洗脱方式进行洗脱，流动相A为水相和乙腈的混合液，所述水相为10-150 mmol/L磷酸二氢钠溶液，pH值为4.9~6.2；所述水相与所述乙腈的体积比为（92: 8）~（88: 12）；流动相B为乙腈；
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
Figure 454189DEST_PATH_IMAGE001
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A和流动相B”总体积之比；
所述三种杂质为[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素；所述[Glu4]缩宫素的结构式为Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)；所述[Gly9OH]缩宫素的结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly(1,6二硫键)；所述[+Gly10]缩宫素的结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Gly-NH2(1,6二硫键)。
2.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度为0.002~0.2 mg/mL；
和/或，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.00002~0.2 mg/mL。
3.如权利要求2所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度为0.01~0.1 mg/mL；
和/或，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.002~0.1mg/mL。
4.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，色谱柱为Xbridge C18色谱柱；所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为150mm×4.6mm，5μm。
5.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述供试品溶液中，缩宫素的浓度为0.02 mg/mL；
和/或，所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.001 mg/mL。
6.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件如下所示：
Figure 574592DEST_PATH_IMAGE002
。
7.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述水相为80~120mmol/L磷酸二氢钠溶液；
和/或，所述水相的pH值为5.0~6。
8.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述水相为100mmol/L磷酸二氢钠溶液；
和/或，所述水相的pH值为5.4~5.8；
和/或，所述水相与所述乙腈的体积比为90: 10。
9.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温为20℃~40℃；
和/或，所述高效液相色谱检测中，流动相A和流动相B的总流速为0.5~2.0 mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所述供试品溶液的进样量为10~100 µL；
和/或，所述高效液相色谱检测中，检测波长为210~230 nm；
和/或，所述高效液相色谱检测中，所用的检测器为紫外检测器。
10.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，所用的检测器为光电二极管阵列检测器。
11.如权利要求9所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温为25℃~38℃；
和/或，所述高效液相色谱检测中，流动相A和流动相B的总流速为1.5 mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，检测波长为220 nm。
12.如权利要求9所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，色谱柱柱温为32℃。
13.如权利要求1所述的缩宫素及三种杂质的分离方法，其特征在于，其包括以下步骤：
a. 分别取适量缩宫素、[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素称定，加水溶解并稀释制成4份浓度均为0.02 mg/mL的溶液；
b. 每份溶液取100 µL，按照高效液相色谱法进行检测，记录缩宫素及各杂质保留时间；所述高效液相色谱法的检测过程中，柱温为20~32℃，pH值为5~5.8；
c. 配制缩宫素混合溶液，其中，缩宫素浓度为0.02 mg/mL，[Glu4]缩宫素、[Gly9OH]缩宫素和[+Gly10]缩宫素浓度分别为1 µg/mL；
d. 所述缩宫素混合溶液取样100 µL，按照上述高效液相色谱法进行检测，根据步骤b中缩宫素及各杂质保留时间，观察缩宫素混合溶液中缩宫素与各杂质，各杂质之间的分离情况。
14.一种如权利要求1~13任一项所述缩宫素及三种杂质的分离方法在缩宫素和所述三种杂质的分析检测中的应用。
15.一种如权利要求1~13任一项所述缩宫素及三种杂质的分离方法在缩宫素和所述三种杂质的含量测定中的应用。
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