CN111830154B - 一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用 - Google Patents
一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111830154B CN111830154B CN202010679732.3A CN202010679732A CN111830154B CN 111830154 B CN111830154 B CN 111830154B CN 202010679732 A CN202010679732 A CN 202010679732A CN 111830154 B CN111830154 B CN 111830154B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oxytocin
- impurity
- epimers
- cys
- liquid chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用。其包括下述步骤:利用高效液相色谱检测供试品溶液即可;供试品溶液为含有缩宫素的水溶液;高效液相色谱检测中,色谱柱柱温为32~42℃;采用梯度洗脱方式进行洗脱,流动相A为水相和乙腈的混合液,水相为10~150mmol/L磷酸二氢钠溶液,pH值为5.2~5.4;水相与乙腈的体积比为95:5~85:15;流动相B为乙腈。本发明检测方法能够同时分离缩宫素及其8种差向异构体,具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点,可用于缩宫素原料和制剂有关物质的检测,解决目前国内外药典及文献中没有控制缩宫素及其8种差向异构体方法的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测领域,更具体地,涉及一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用。
背景技术
缩宫素又名催产素,是由8种氨基酸组成的九肽药物,分子式:C43H66N12O12S2,分子量1007.2,结构式:Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。它能够刺激子宫收缩和乳汁排出,临床上主要用于诱导促进分娩、缩短第三产程、控制产后出血等。
缩宫素肽链中有8个含手性碳原子的氨基酸残基,构型均为L型,其中只有一个非预期构型(D型)的氨基酸残基所形成的肽链叫做差向异构体,缩宫素可能形成8种差向异构体,其结构式如表1所示。缩宫素的合成过程中有可能引入这8种差向异构体,例如差向异构体可能形成于原料氨基酸中的光学异构体,也可能形成于肽链中氨基酸残基脱酰胺过程中外消旋化(J.AM.CHEM.SOC.2003,125,11486-11487)。
表1缩宫素中潜在的8种差向异构体
杂质编号 | 杂质名称 | 结构式 |
杂质1 | [D-Cys<sup>1</sup>]缩宫素 | D-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
杂质2 | [D-Tyr<sup>2</sup>]缩宫素 | Cys-D-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
杂质3 | [D-Ile<sup>3</sup>]缩宫素 | Cys-Tyr-D-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
杂质4 | [D-Gln<sup>4</sup>]缩宫素 | Cys-Tyr-Ile-D-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
杂质5 | [D-Asn<sup>5</sup>]缩宫素 | Cys-Tyr-Ile-Gln-D-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
杂质6 | [D-Cys<sup>6</sup>]缩宫素 | Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-D-Cys-Pro-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
杂质7 | [D-Pro<sup>7</sup>]缩宫素 | Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-D-Pro-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
杂质8 | [D-Leu<sup>8</sup>]缩宫素 | Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Leu-Gly-NH<sub>2</sub>(1,6二硫键) |
缩宫素的生物活性与其立体结构密切相关,因此,应对缩宫素合成过程中的差向异构体进行研究和控制。但是,差向异构体的性质与缩宫素非常接近,未发现文献报道缩宫素与其差向异构间的分离方法。国内外药典(中国药典(2020版)、美国药典(USP41)、欧洲药典(EP9.8)和日本药典(JP17版))收载的缩宫素原料药及其注射液质量标准中都未涉及到表1中提及的8种差向异构体的检测方法以及检测限度的要求。因此,建立一种能够有效分离缩宫素与其多种差向异构体的高效液相色谱法,对于缩宫素的精确质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中没有能够有效分离缩宫素及其多种差向异构体方法的缺陷,提供了一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用。本方法具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点,可用于缩宫素原料药合成工艺和制剂工艺中过程质量控制和终产品的质量评价。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法,其包括下述步骤:利用高效液相色谱检测供试品溶液即可;
其中,所述供试品溶液为含有缩宫素的水溶液;所述高效液相色谱检测中,色谱柱柱温为32~42℃;所述高效液相色谱检测中,采用梯度洗脱方式进行洗脱,流动相A为水相和乙腈的混合液,所述水相为10~150mmol/L磷酸二氢钠溶液,pH值为5.2~5.4;所述水相与所述乙腈的体积比为(95:5)~(85:15);流动相B为乙腈;
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述:
时间/min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 90-98 | 2-10 |
7 | 85-92 | 8-15 |
10 | 80-90 | 10-20 |
12 | 70-80 | 20-30 |
13 | 70-80 | 20-30 |
13.1 | 90-98 | 2-10 |
16 | 90-98 | 2-10 |
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A或流动相B”总体积之比;
所述8种差向异构体包括杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8;
其中,所述杂质1为[D-Cys1]缩宫素,所述杂质2为[D-Tyr2]缩宫素,所述杂质3为[D-Ile3]缩宫素,所述杂质4为[D-Gln4]缩宫素,所述杂质5为[D-Asn5]缩宫素,所述杂质6为[D-Cys6]缩宫素,所述杂质7为[D-Pro7]缩宫素,所述杂质8为[D-Leu8]缩宫素。
本发明中,所述杂质1为[D-Cys1]缩宫素,结构式为D-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质2为[D-Tyr2]缩宫素,结构式为Cys-D-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质3为[D-Ile3]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-D-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质4为[D-Gln4]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-D-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质5为[D-Asn5]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-D-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质6为[D-Cys6]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-D-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质7为[D-Pro7]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-D-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
所述杂质8为[D-Leu8]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键)。
本发明,所述供试品溶液中,缩宫素的浓度可为0.002~0.2mg/mL,优选0.01~0.1mg/mL,例如0.02mg/mL。
本发明,所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度可为0.00002~0.2mg/mL,优选0.002~0.1mg/mL,例如0.001mg/mL。
本发明,所述高效液相色谱检测中,色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,例如Waters Xbridge C18色谱柱。所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格优选为150mm×4.6mm,5μm。
本发明中,优选,所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述:
时间/min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 94-96 | 4-6 |
7 | 86-90 | 10-14 |
10 | 84-86 | 14-16 |
12 | 73-77 | 23-27 |
13 | 73-77 | 23-27 |
13.1 | 94-96 | 4-6 |
16 | 94-96 | 4-6 |
。
更优选,所述梯度洗脱条件如下所示:
时间/min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 95 | 5 |
7 | 88 | 12 |
10 | 85 | 15 |
12 | 75 | 25 |
13 | 75 | 25 |
13.1 | 95 | 5 |
16 | 95 | 5 |
。
本发明中,所述水相优选为80~120mmol/L磷酸二氢钠溶液,更优选为100mmol/L磷酸二氢钠溶液。
本发明中,所述水相的pH值可为5.2、5.3或者5.4。
本发明中,所述流动相A中,所述水相与所述有机相的体积分数总计为100份。所述水相与所述乙腈的体积比优选为(92:8)~(88:12),更优选为90:10。
本发明中,所述高效液相色谱检测中,色谱柱柱温可为32~42℃;优选为33~41℃,更优选为35~40℃。
本发明中,所述高效液相色谱检测中,所述流动相A和所述流动相B的总流速优选为0.5-2.0mL/min,更优选为1.5mL/min。
本发明中,所述高效液相色谱检测中,待测样品的进样量可为10~100μL,优选为100μL。
本发明中,所述高效液相色谱检测中,检测波长可为210-230nm,优选为220nm。
本发明中,所述高效液相色谱检测中,所用的检测器可为紫外检测器或光电二极管阵列检测器。
本发明一较佳实施方式中,所述高效液相色谱法测定缩宫素及其8种差向异构体的方法,具体包括以下步骤:
a.分别取适量缩宫素、所述杂质1、所述杂质2、所述杂质3、所述杂质4、所述杂质5、所述杂质6、所述杂质7和所述杂质8称定,加水溶解并稀释制成9份浓度均约为0.02mg/ml的溶液;
b.每份溶液取100μL,按照上述高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
c.配置缩宫素混合溶液,其中,缩宫素浓度为0.02mg/mL,杂质1~8的浓度分别为1μg/mL,
d.所述缩宫素混合溶液取样100μL,按照上述高效液相色谱法进行检测,根据步骤b中缩宫素及各杂质保留时间,观察缩宫素混合溶液中缩宫素与各杂质,各杂质之间的分离情况。
本发明还提供了一种所述缩宫素及其8种差向异构体的分离方法在缩宫素和所述8种差向异构体的分析检测或含量测定中的应用。
本发明中,利用所述高效液相色谱的检测方法,对缩宫素和所述8种差向异构体进行分析检测或含量测定。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
本发明高效液相色谱检测方法能够同时分离缩宫素及其8种差向异构体,具有专属性强、分离度好、分析速度快、灵敏度高等特点,可用于缩宫素原料和制剂有关物质的检测,解决目前国内外药典及文献中没有控制缩宫素及其8种差向异构体方法的技术问题,提高缩宫素产品的质量。
附图说明
图1为对比例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图2为对比例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图3为对比例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图4为对比例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图5为对比例3中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图6为对比例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图7为对比例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图8为对比例5中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图9为对比例5中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图10为对比例6中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图11为对比例7中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图12为对比例7中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图13为对比例8中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图14为对比例8中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图15为实施例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图16为实施例1中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图17为实施例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图18为实施例2中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图19为实施例3中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图20为实施例3中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
图21为实施例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图。
图22为实施例4中缩宫素混合溶液检测的HPLC局部放大图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例中,产品的来源和型号如下:
乙腈为HPLC级,购自Fisher公司;
无水磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸均为AR级,购自国药集团化学试剂有限公司;
缩宫素制剂Pitocin(Oxytocin Injection,Usp),批号323838;购于帕尔制药有限公司(Par Pharmaceutical Inc)。
缩宫素原料按照中国专利文献CN 110016072A一种缩宫素的精制方法进行精制获得。
杂质1(批号:OP021919YH-001)、杂质2(批号:OP021919YH-002)、杂质3(批号:OP021919YH-003)、杂质4(批号:OP021919YH-004)、杂质5(批号:OP021919YH-005)、杂质6(批号:OP021919YH-006)、杂质7(批号:OP021919YH-007)和杂质8(批号:OP021919YH-008)购自浙江昂拓莱斯生物技术有限公司。
实施例中,所使用的仪器型号及来源如下:
1260Infinity高效液相色谱仪(美国,Agilent);Xbridge C18色谱柱(5μm,4.6×150mm);XS205DU分析天平(瑞士,Mettler-Toledo);AL204分析天平(瑞士,Mettler-Toledo);FiveEasy pH计(瑞士,Mettler-Toledo)。
实施例中,所使用的数据处理软件为Chemstation化学工作站。
对比例1
本对比例采用中国药典(2020版)/欧洲药典(EP9.8)方法检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种差向异构体的分离情况。
实验条件如下所示。其中,本实验中柱温、Xbridge色谱柱均为自行选择(在中国药典中并未提及柱温和色谱柱类型,欧洲药典中规定色谱柱长125mm),其它实验条件均按照中国药典或欧洲药典进行。
色谱柱:Xbridge C18色谱柱(5μm,4.6mm×150mm)
柱温:30℃
流动相:流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液,流动相B为体积比乙腈:水=50:50混合溶液。中国药典或者欧洲药典中,均未对流动相A进行调节pH值,仅采用100mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A,其pH值为4.4。
流速:1.0ml/min。
检测波长:220nm
梯度如表2所示:
表2对比例1的洗脱程序
时间/min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 70 | 30 |
30 | 40 | 60 |
30.1 | 70 | 30 |
45 | 70 | 30 |
进样量:100μL。
检测器:紫外检测器
1、9份浓度均约为0.02mg/mL的溶液配制及检测:分别取适量缩宫素原料、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8称定,加水溶解并稀释制成9份浓度均约为0.02mg/mL溶液;
每份溶液取100μL,根据对比例1实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、取缩宫素原料20mg,置于50mL容量瓶中,用水溶解并定容,得到0.4mg/mL缩宫素溶液;量取缩宫素溶液和各杂质溶液各1mL,置同一20mL容量瓶中,用水稀释并定容,摇匀,得到每1mL约含缩宫素0.02mg及各杂质分别1μg的溶液,即为缩宫素混合溶液。
取100μL缩宫素混合溶液,照对比例1实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到色谱图1,其放大图如图2所示。
实验结果:图1和图2分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为8.747min的色谱峰是缩宫素峰,其余6个为杂质峰,其归属如表3所示。缩宫素与其8种差向异构体可分开,8种差向异构体之间有多个色谱峰重合。其中,杂质5、杂质6和杂质7色谱峰重合,重合峰与杂质2色谱峰部分重叠,分离度为0.8。本对比例色谱方法分析时间长,为45min,可检出6种缩宫素差向异构体。
表3缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 | 保留时间/min | 杂质归属 |
1 | 6.951 | 杂质3 |
2 | 8.747 | 缩宫素 |
3 | 9.317 | 杂质4 |
4 | 9.975 | 杂质5、6、7 |
5 | 10.410 | 杂质2 |
6 | 11.051 | 杂质8 |
7 | 11.768 | 杂质1 |
对比例2
本对比例采用美国药典(USP41)方法检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种差向异构体的分离情况。
实验条件如下所示。其中,本实验柱温、Xbridge色谱柱均为自行选择,美国药典中并未提及(美国药典中提及柱温用室温,色谱柱用C18色谱柱(5μm,4.6mm×120mm),流速约1.5ml/min,可作调整),其它实验条件均按照美国药典进行。
色谱柱:Xbridge C18色谱柱(5μm,4.6mm×150mm)
柱温:25℃
流动相:流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液,流动相B为体积比乙腈:水=50:50混合溶液。美国药典中,未对流动相A进行调节pH值,仅采用100mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A,其pH值为4.4。
流速:1.0mL/min。
梯度如表4所示:
表4对比例2的洗脱程序
时间/min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 70 | 30 |
20 | 50 | 50 |
25 | 0 | 100 |
30 | 0 | 100 |
30.1 | 70 | 30 |
40 | 70 | 30 |
进样量:100μL。
检测器:紫外检测器
检测波长:220nm
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,根据对比例2实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,根据对比例2实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到色谱图3,其放大图如图4所示。
实验结果:图3和图4分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为7.918min的色谱峰是缩宫素峰,其余5个为杂质峰,其归属如表5所示。缩宫素与其8种差向异构体可分开,8种差向异构体之间有多个色谱峰重合。其中,杂质2、5、6和7色谱峰重合。本对比例色谱方法分析时间为40min,可检出5种缩宫素差向异构体。
表5缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 | 保留时间/min | 杂质归属 |
1 | 6.154 | 杂质2 |
2 | 7.918 | 缩宫素 |
3 | 8.489 | 杂质4 |
4 | 9.360 | 杂质2、5、6、7 |
5 | 10.184 | 杂质8 |
6 | 10.813 | 杂质1 |
对比例3
本对比例中与实施例1相比,除了流动相A、流动相B采用中国、欧洲或美国药典中公开的流动相以外,其它操作和条件均与实施例1相同,采用如实施例1的洗脱程序,检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种差向异构体的分离情况。实验条件如下:
色谱柱:Xbridge C18色谱柱(5μm,4.6mm×150mm)
柱温:35℃
流动相:流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液,其pH值为4.4;流动相B为体积比乙腈:水=50:50混合溶液。
流速:1.5ml/min。梯度如实施例1的洗脱程序。
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照对比例3实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照对比例3实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到色谱图5。
实验结果:图5为缩宫素混合溶液检测的HPLC图,缩宫素及其8种差向异构体均未被检出。本对比例色谱条件下,缩宫素及其8种差向异构体均难以从色谱柱中洗脱出来。
对比例4
本对比例中与实施例1相比,除了流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH=5.0):乙腈=90:10的混合溶液以外,其它操作和条件均与实施例1相同,检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种差向异构体的分离情况。实验条件如下:
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照对比例4实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照对比例4实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱6,其放大图如图7所示。
实验结果:图6和图7分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为6.424min的色谱峰是缩宫素峰,其余6个为杂质峰,其归属如表6所示。缩宫素峰与其8种差向异构体均可以分开,8种差向异构体之间不能完全分开。其中杂质5和杂质6重合;杂质8和杂质2重合;缩宫素与其他杂质,其他杂质之间均可实现有效分离。
本对比例色谱方法中流动相A水相pH为5.0,其他条件与实施例1相同,可检出缩宫素中潜在的6种差向异构体。
表6缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 | 保留时间/min | 杂质归属 |
1 | 4.979 | 杂质3 |
2 | 6.424 | 缩宫素 |
3 | 6.731 | 杂质4 |
4 | 7.071 | 杂质5、6 |
5 | 7.377 | 杂质7 |
6 | 7.820 | 杂质8、2 |
7 | 8.542 | 杂质1 |
对比例5
本对比例中与实施例1相比,除了流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH=6.0):乙腈=90:10的混合溶液以外,其它操作和条件均与实施例1相同,检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种差向异构体的分离情况。实验条件如下:
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照对比例5实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照对比例5实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱8,其放大图如图9所示。
实验结果:图8和图9分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为7.748min的色谱峰是缩宫素峰,其余3个为杂质峰。8种缩宫素差向异构体只检出3个色谱峰。本对比例色谱方法中流动相A水相pH为6.0,其他条件与实施例1相同,可检出缩宫素中潜在的3种差向异构体。
本对比例中,由于流流动相A水相pH为6.0,不在本发明限定范围内,只可检出缩宫素中潜在的3种差向异构体。
对比例6
本对比例中与实施例1相比,除了流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH=5.2):乙腈=80:20的混合溶液以外,其它操作和条件均与实施例1相同,检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种差向异构体的分离情况。实验条件如下:
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照对比例6实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照对比例6实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱10。
实验结果:图10为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为1.890min的色谱峰是缩宫素峰,其余2个为杂质峰。
本对比例中,由于流动相A中磷酸二氢钠与乙腈的体积比不在本发明限定范围内,缩宫素及8种差向异构体过早的从色谱柱中洗脱出来,保留时间相近,相互间不能有效分离。
对比例7
本对比例中与实施例1相比,除了柱温30℃以外,其它操作和条件均与实施例1相同,检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种差向异构体的分离情况。实验条件如下:
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的取缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照对比例7实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照对比例7实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱11,其放大图如图12所示。
实验结果:图11和图12分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图。根据缩宫素及各杂质的保留时间,保留时间为6.826min的色谱峰是缩宫素峰,其余7个为杂质峰,其归属如表7所示。7种缩宫素差向异构体被检出,其中杂质6和杂质7重合;缩宫素与其他杂质,其他杂质之间均可实现有效分离。本对比例色谱方法柱温为30℃,其他条件与实施例1相同,可检出缩宫素中潜在的7种差向异构体。
表7缩宫素混合溶液色谱峰归属
对比例7中,由于柱温为30℃,虽然其它条件在本发明范围内,但是也无法有效分离杂质6、7。
对比例8
本对比例中与实施例1相比,除了洗脱程序不在本发明范围内,其它操作和条件均与实施例1相同,检测缩宫素混合溶液中缩宫素及其8种有关物质的分离情况。实验条件如下:
色谱条件:洗脱程序如表8,其他条件与实施例1相同。
表8对比例8的洗脱程序
时间/min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 88 | 12 |
7 | 84 | 16 |
10 | 82 | 18 |
12 | 75 | 25 |
13 | 75 | 25 |
13.1 | 95 | 5 |
16 | 95 | 5 |
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的取缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照对比例8实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照对比例8实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱13,其放大图如图14所示。
实验结果:图13和图14分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为3.028min的色谱峰是缩宫素峰,其他标注保留时间的5个色谱峰为杂质峰,本对比例色谱方法中洗脱程序不在本发明权1范围内,其它均与实施例1相同,可检出缩宫素中潜在的5种差向异构体。
实施例1
本实施例为缩宫素及其8种差向异构体分离情况实施例,实验条件如下:
色谱柱:Xbridge C18色谱柱(5μm,4.6×150mm)
柱温:35℃
流动相:流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH=5.2):乙腈=90:10的混合溶液,流动相B为乙腈。
流速:1.5ml/min。
梯度如表9所示:
表9实施例1的洗脱程序
时间/min | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 95 | 5 |
7 | 88 | 12 |
10 | 85 | 15 |
12 | 75 | 25 |
13 | 75 | 25 |
13.1 | 95 | 5 |
16 | 95 | 5 |
进样量:100μL。
检测器:紫外检测器
检测波长:220nm
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的取缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照实施例1实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照实施例1实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱15,其放大图如图16所示。
实验结果:图15和图16分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为6.843min的色谱峰是缩宫素峰,其余8个为杂质峰,其归属如表10所示。8种缩宫素差向异构体均被检出,其中,缩宫素和杂质4之间的分离度为1.4,杂质6和杂质7分离度最小,为0.8。缩宫素与杂质,其他杂质和杂质均可以有效分开。本实施例色谱方法分析时间短,为16min,可检出缩宫素中潜在的8种差向异构体。
表10缩宫素混合溶液色谱峰归属
色谱峰 | 保留时间/min | 杂质归属 |
1 | 5.142 | 杂质3 |
2 | 6.843 | 缩宫素 |
3 | 7.080 | 杂质4 |
4 | 7.349 | 杂质5 |
5 | 7.648 | 杂质6 |
6 | 7.830 | 杂质7 |
7 | 8.105 | 杂质8 |
8 | 8.357 | 杂质2 |
9 | 8.964 | 杂质1 |
实施例2
本实施例为柱温40℃条件缩宫素及其8种差向异构体分离情况实施例,实验条件如下:
色谱条件:柱温为40℃,其他条件与实施例1相同。
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的取缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照实施例2实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照实施例2实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱17,其放大图如图18所示。
实验结果:图17和图18分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为6.832min的色谱峰是缩宫素峰,其余8个为杂质峰,其归属如表11所示。8种缩宫素差向异构体均被检出,其中,缩宫素与杂质4分离度为0.9;杂质6和杂质7分离度为0.9。缩宫素与其他杂质,其他杂质之间均可实现有效分离。本实施例色谱方法柱温为40℃,其他条件与实施例1相同,可检出缩宫素中潜在的8种差向异构体。
表11缩宫素混合溶液色谱峰归属
实施例3
本实施例为流动相pH=5.4条件下缩宫素及其8种差向异构体分离情况实施例。实验条件如下:
色谱条件:流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH=5.4):乙腈=90:10的混合溶液,其他条件与实施例1相同。
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的取缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照实施例3实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、缩宫素混合溶液配制方法同对比例1步骤2。
取100μL缩宫素混合溶液,照实施例3实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱19,其放大图如图20所示。
实验结果:图19和图20分别为缩宫素混合溶液检测的HPLC完整图、局部放大图,根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间为7.062min的色谱峰是缩宫素峰,其余8个为杂质峰,其归属如表12所示。8种缩宫素差向异构体均被检出,其中杂质6和杂质7分离度最小,为0.6;缩宫素与其他杂质,其他杂质之间均可实现有效分离。本实施例色谱方法中流动相A水相pH为5.4,其他条件与实施例1相同,可检出缩宫素中潜在的8种差向异构体。
表12缩宫素混合溶液色谱峰归属
实施例4本实施例为缩宫素制剂有关物质检测实施例
采用与实施例3相同的实验条件,对缩宫素制剂Pitocin(Oxytocin Injection,Usp)有关物质进行测定。
1、9份浓度均约为0.02mg/ml的缩宫素及各杂质溶液配制方法同对比例1步骤1。
每份溶液取100μL,照实施例4实验条件,以高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间。
2、取缩宫素制剂(批号323838)100μL,照实施例4实验条件,以高效液相色谱法进行检测,得到图谱21,其放大图如图22。
图21和图22分别为缩宫素制剂检测的HPLC完整图、局部放大图。根据缩宫素及各杂质的保留时间,图中保留时间7.179min的色谱峰是缩宫素峰。保留时间9.078min的色谱峰与杂质1的色谱峰重合,但经质谱数据核对,此处色谱峰为乙酰化缩宫素色谱峰。因此,本批次缩宫素制剂中未发现缩宫素对映异构体杂质。
实施例5灵敏度试验
1、采用与实施例1相同的实验条件进行实验。分别精密称取适量缩宫素、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8对照品,加水溶解并稀释制成9份浓度均约为0.02mg/ml的溶液。
2、取浓度为0.02mg/ml的缩宫素、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8溶液各1ml,置于同一100ml量瓶中,用水稀释定容,得到缩宫素及各杂质浓度均为0.2μg/ml的混合溶液。
3、将混合溶液用水逐步稀释,得到各组分浓度分别为0.04μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml的混合溶液。
4、照实施例1实验条件,以高效液相色谱法进行检测,获得的色谱图中,杂质峰高约为基线噪音高的3-5倍,则此时溶液的浓度即为组分的检测限;获得的色谱图中,杂质峰高约为基线噪音高的10-20倍,则此时溶液的浓度即为组分的定量限。缩宫素及其8种差向异构体的检测限及定量限如表13所示,说明本方法灵敏度高。
表13缩宫素及其8种差向异构体的检测限及定量限
组分 | 检测限ng | 定量限ng |
杂质3 | 1.1 | 2.3 |
缩宫素 | 1.2 | 2.5 |
杂质4 | 0.9 | 1.7 |
杂质5 | 1.0 | 2.0 |
杂质6 | 1.9 | 3.7 |
杂质7 | 1.3 | 2.6 |
杂质8 | 1.0 | 2.0 |
杂质2 | 0.9 | 1.8 |
杂质1 | 1.2 | 2.3 |
Claims (13)
1.一种缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,其包括下述步骤:利用高效液相色谱检测供试品溶液即可;
其中,所述供试品溶液为含有缩宫素的水溶液;所述高效液相色谱检测中,色谱柱柱温为32~42℃;所述高效液相色谱检测中,采用梯度洗脱方式进行洗脱,流动相A为水相和乙腈的混合液,所述水相为10~150 mmol/L磷酸二氢钠溶液,pH值为5.2~5.4;所述水相与所述乙腈的体积比为90: 10;流动相B为乙腈;
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述:
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A和流动相B”总体积之比;
所述八种差向异构体包括杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和杂质8;
其中,所述杂质1为[D-Cys1]缩宫素,结构式为D-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键),所述杂质2为[D-Tyr2]缩宫素,结构式为Cys-D-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键),所述杂质3为[D-Ile3]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-D-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键),所述杂质4为[D-Gln4]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-D-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键),所述杂质5为[D-Asn5]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-D-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键),所述杂质6为[D-Cys6]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-D-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键),所述杂质7为[D-Pro7]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-D-Pro-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键),所述杂质8为[D-Leu8]缩宫素,结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Leu-Gly-NH2(1,6二硫键);
所述高效液相色谱检测中,色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
2.如权利要求1所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述供试品溶液中,缩宫素的浓度为0.002~0.2 mg/mL;
和/或,所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.00002~0.2 mg/mL;
和/或,所述高效液相色谱检测中,色谱柱为Waters Xbridge C18色谱柱。
3.如权利要求2所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述供试品溶液中,缩宫素的浓度为0.01~0.1 mg/mL;
和/或,所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.002~0.1 mg/mL。
4.如权利要求1所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述供试品溶液中,缩宫素的浓度为0.02 mg/mL;
和/或,所述供试品溶液中含有的单个杂质的浓度为0.001 mg/mL。
5.如权利要求1所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为150mm×4.6mm,5μm。
6.如权利要求1所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述水相为80~120 mmol/L磷酸二氢钠溶液;
和/或,所述水相的pH值为5.2、5.3或者5.4。
7.如权利要求6所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述水相为100 mmol/L磷酸二氢钠溶液。
8.如权利要求1所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述高效液相色谱检测中,色谱柱柱温为33~41℃;
和/或,所述高效液相色谱检测中,所述流动相A和所述流动相B的总流速为0.5-2.0mL/min;
和/或,所述高效液相色谱检测中,待测样品的进样量为10~100 µL;
和/或,所述高效液相色谱检测中,检测波长为210-230 nm;
和/或,所述高效液相色谱检测中,所用的检测器为紫外检测器。
9.如权利要求8所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所用的检测器为光电二极管阵列检测器。
10.如权利要求8或9所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述高效液相色谱检测中,色谱柱柱温为35~40℃;
和/或,所述高效液相色谱检测中,所述流动相A和所述流动相B的总流速为1.5 mL/min;
和/或,所述高效液相色谱检测中,待测样品的进样量为100 µL;
和/或,所述高效液相色谱检测中,检测波长为220 nm。
11.如权利要求1所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法,其特征在于,所述高效液相色谱法测定缩宫素及其八种差向异构体的方法,包括以下步骤:
a.分别取适量缩宫素、所述杂质1、所述杂质2、所述杂质3、所述杂质4、所述杂质5、所述杂质6、所述杂质7和所述杂质8称定,加水溶解并稀释制成9份浓度均为0.02 mg/mL的溶液;
b.每份溶液取100 µL,按照所述高效液相色谱法进行检测,记录缩宫素及各杂质保留时间;
c.配制 缩宫素混合溶液,其中,缩宫素浓度为0.02 mg/mL,杂质1~8的浓度分别为1 µg/mL;
d.按照所述高效液相色谱法进行检测所述缩宫素混合溶液,根据步骤b中缩宫素及各杂质保留时间,观察缩宫素混合溶液中缩宫素与各杂质,各杂质之间的分离情况。
12.一种如权利要求1~11任一项所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法在缩宫素和所述八种差向异构体的分析检测中的应用。
13.一种如权利要求1~11任一项所述的缩宫素及其八种差向异构体的分离方法在缩宫素和所述八种差向异构体的含量测定中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010679732.3A CN111830154B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010679732.3A CN111830154B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111830154A CN111830154A (zh) | 2020-10-27 |
CN111830154B true CN111830154B (zh) | 2022-05-24 |
Family
ID=72923919
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010679732.3A Active CN111830154B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111830154B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113252807B (zh) * | 2021-04-15 | 2022-05-06 | 远大生命科学(武汉)有限公司 | 一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160377635A1 (en) * | 2013-06-26 | 2016-12-29 | Martin-Protean Llc | Measurement of Oxytocin and Vasopressin |
CN106749539B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-10-15 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法 |
CN111060635A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-24 | 吉尔生化(上海)有限公司 | 一种卡贝缩宫素的分析检测方法 |
CN111077243A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-28 | 成都市海通药业有限公司 | 一种用于缩宫素注射液的检测方法 |
-
2020
- 2020-07-15 CN CN202010679732.3A patent/CN111830154B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111830154A (zh) | 2020-10-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111896651B (zh) | 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用 | |
WO2022110569A1 (zh) | 一种大鼠血浆中芦荟苦素的lc-ms/ms测定方法 | |
CN104749269A (zh) | 一种利用hplc测定阿格列汀原料药及制剂中对映异构体杂质的方法 | |
CN111830154B (zh) | 一种缩宫素及其8种差向异构体的分离方法及应用 | |
CN113866337B (zh) | 一种分离与测定磷酸奥司他韦同分异构体的质量分析方法 | |
Rajan et al. | A simple RP-HPLC method for quantitation of itopride HCl in tablet dosage form | |
CN111912917B (zh) | 一种缩宫素及至少十种杂质的分离方法和应用 | |
CN111812240B (zh) | 一种缩宫素及三种杂质的分离方法和应用 | |
CN113049687B (zh) | 一种盐酸氨溴索原料和注射液有关物质的检测方法 | |
CN111103383A (zh) | 一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法 | |
CN107328874B (zh) | 一种盐酸帕洛诺司琼光学异构体的拆分试剂及分离检测方法 | |
CN116482268A (zh) | 一种阿加曲班原料或制剂中杂质的检测方法 | |
CN114689737B (zh) | 一种s-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法 | |
CN114755346A (zh) | 一种环孢素软胶囊有关物质的测定方法 | |
CN111896642B (zh) | 一种缩宫素及三种脱酰胺杂质的分离方法和应用 | |
CN110412164B (zh) | 一种盐酸美西律的有关物质的检测方法 | |
CN110208419B (zh) | 一种用于检测比伐卢定中杂质的方法 | |
CN116482242B (zh) | Lc-ms/ms测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法 | |
CN110208397A (zh) | 一种同时测定土霉素氟尼辛注射液中两种主药含量的高效液相色谱法 | |
CN114487237B (zh) | 一种3,5-二甲氧基苯甲酸甲酯的检测方法 | |
CN113252807B (zh) | 一种缩宫素原料药有关物质的高效液相色谱分离方法 | |
CN115078576B (zh) | 一种氨酚双氢可待因片有关物质的分析方法 | |
CN102565203B (zh) | 一种用液相色谱法分离测定溴甲纳曲酮及其杂质的方法 | |
CN112505196B (zh) | 一种人血浆中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法 | |
CN109655540B (zh) | 一种鲑鱼降钙素喷鼻剂有关物质的分析方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |