CN106290594B - 测定奥贝胆酸片溶出含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，测定条件包括：(1)待测样品溶液的配制：加入衍生化试剂和催化剂对奥贝胆酸片进行衍生化后配制待测样品溶液；(2)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，有机溶剂为流动相A，酸性水溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件为：0～3分钟，流动相A为60～80(V％)，流动相B为40～20(V％)；3～10分钟，流动相A线性增加至80～100(V％)，流动相B减少至20～0(V％)；10～12分钟，流动相A为80～100(V％)，流动相B为20～0(V％)；12～15分钟，流动相A为60～80(V％)，流动相B为40～20(V％)；(3)检测分析：采用高效液相色谱仪对待测样品溶液进行检测。该方法专属性强、精密度高、线性良好、准确度高，可有效测定奥贝胆酸片溶出含量。

Description

测定奥贝胆酸片溶出含量的方法
技术领域
本发明涉及化学分析领域，具体而言，本发明涉及一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法。
背景技术
奥贝胆酸(Obeticholic Acid)又名6-乙基鹅去氧胆酸，是人初级胆汁酸中鹅脱氧胆酸(CDCA)的一种新型衍生物，为法尼酯衍生物X受体(FXR)的天然配体。奥贝胆酸属法尼醇X受体激动剂，通过活化法尼醇X受体，间接抑制细胞色素7A1(CYP7A1)的基因表达。由于CYP7A1是胆酸生物合成的限速酶，因此奥贝胆酸可以抑制胆酸合成，用于治疗原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病。
奥贝胆酸由美国Intercept制药公司研发成功，是二十年来首个研发用于治疗胆汁淤积性肝病的药物。用于那些对旧标准治疗药物熊去氧胆酸没有充分应答或不能耐受的患者。
奥贝胆酸的结构式如下：
Figure BDA0000725895660000011
由于其缺乏共轭结构，无紫外吸收特征，无法用紫外可见分光光度法对其进行准确的测定。有报道采用蒸发光散射检测器(ELSD)对胆酸类含量进行测定，但这种方法只适用于样品溶液中不含有盐类成分的供试品，而对于奥贝胆酸片溶出的样品无法进行测定(因为其溶出介质是缓冲盐溶液)。
也有报道采用HPLC紫外末端吸收法分析胆酸类片剂的溶出度，但由于奥贝胆酸片规格比较小，溶出的供试品溶液浓度低，采用此法也无法准确对其进行定量测定。
目前，尚未见有关奥贝胆酸片溶出含量的检测方法。而实现奥贝胆酸片的溶出含量分析，对于制剂过程的质量控制方面具有重要的现实意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，该检测方法专属性强、精密度高、线性良好、准确度高，可有效测定奥贝胆酸片溶出含量。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，该方法的测定条件包括：(1)待测样品溶液的配制：采用加入衍生化试剂和催化剂对奥贝胆酸片进行衍生化后配制待测样品溶液；
(2)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相A，酸性水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；其中，所述梯度洗脱条件为：
时间(min) 流动相A(V％) 流动相B(V％)
0 60～80 40～20
3 60～80 40～20
10 80～100 20～0
12 80～100 20～0
15 60～80 40～20
(3)检测分析：采用高效液相色谱仪对所述待测样品溶液进行检测，以便得到所述待测样品溶液中奥贝胆酸的含量。
由此，根据本发明实施例的测定奥贝胆酸片溶出含量的方法可以对奥贝胆酸片的溶出含量进行快速高效测定，从而可以有效控制制剂的质量，并且该检测方法专属性强、精密度高、线性良好、准确度高，可有效控制药品的质量。
另外，根据本发明实施例的测定奥贝胆酸片溶出含量的方法还可以具有以下附加技术特征：
根据本发明实施例，采用磷酸将所述流动相B的pH调节为1.5～5.0，优选为3.0。由此，可进一步改善峰形，提高分离度。
根据本发明实施例，所述衍生化试剂选自吡啶-苯甲酰氯、邻苯二甲醛、4-硝基苯甲酰甲基溴、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素、对肽内酰胺苯磺酰氯和2-乙酰溴-6-甲氧基萘中的至少一种，优选为2-乙酰溴-6-甲氧基萘和4-硝基苯甲酰甲基溴。
根据本发明实施例，所述催化剂选自18-冠醚-6和三乙胺中的至少一种，优选18-冠醚-6。
根据本发明实施例，所述奥贝胆酸片的试剂量为100～500ul、温度为35～65℃、时间为30～100min，优选试剂量250ul、温度45℃、时间40min。由此可以节约时间和成本。
根据本发明实施例，所述有机溶剂为选自甲醇和乙腈中的至少一种，优选为乙腈。由此，得到的峰形最好。
根据本发明实施例，所述梯度洗脱条件为：
时间/min 流动相A(V％) 流动相B(V％)
0 60 40
3 60 40
10 80 20
12 80 20
15 60 40
其中，所述流动相A为有机溶剂，所述流动相B为酸性水溶液。由此，可以进一步提高分离度。
根据本发明实施例，所述梯度洗脱的流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min。
根据本发明实施例，检测波长为255～275nm，优选为265nm。由此，可以显著提高检测灵敏度。
根据本发明实施例，所述待测样品溶液进样体积为10～50μl，优选为20μl。
本发明所述的测定方法，可以依照以下方法实现：
(1)取待测样品(奥贝胆酸片)适量，加4-硝基苯甲酰甲基溴和18-冠醚-6各250ul，在45℃下反应40min，配制成每1ml含10ug的待测样品溶液；
(2)设置梯度洗脱的流速为1.0ml/min，检测波长265nm；
(3)取步骤(1)中的所述待测样品溶液10～50μl，优选20μl，注入高效液相色谱仪，完成奥贝胆酸含量的测定。
本发明方法的检测限度可达3ng，能有效准确的检测出样品中的奥贝胆酸含量。同时本发明通过利用柱前衍生和HPLC梯度洗脱，得到的色谱图基线平稳，峰形好，无拖尾，杂质也可以被有效分离，检测灵敏度高，另外该分析方法分析效率高，整体分析过程仅需15分钟。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显。
附图说明
图1：按照实施例1条件检测的衍生化空白的HPLC图；
图2：按照实施例1条件检测的自制原料药奥贝胆酸10ug/ml的HPLC图；
图3：按照实施例2条件检测的辅料空白衍生化的HPLC图；
图4：按照实施例2条件检测的自制原料药奥贝胆酸20ng的HPLC图；
图5：按照实施例2条件检测的自制奥贝胆酸片溶出溶液10ug/ml的HPLC图；
图6：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-1的HPLC图；
图7：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-2的HPLC图；
图8：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-3的HPLC图；
图9：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-4的HPLC图；
图10：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-5的HPLC图；
图11：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-6的HPLC图；
图12：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性图；
图13：按照实施例4条件检测的自制奥贝胆酸片回收率50％的HPLC图；
图14：按照实施例4条件检测的自制奥贝胆酸片回收率100％的HPLC图；
图15：按照实施例4条件检测的自制奥贝胆酸片回收率130％的HPLC图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例中所用的奥贝胆酸原料药和奥贝胆酸片为发明人自制。其中奥贝胆酸片是由奥贝胆酸原料药与辅料(微晶纤维素、羧甲淀粉钠、硬脂酸镁)经过制剂制备工艺获得。
实施例1
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1210紫外检测器
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(150×4.6mm,5μm)；
流动相A：甲醇
流动相B：水溶液(用磷酸调节pH至3.0)
梯度洗脱：
时间/min 流动相A(V％) 流动相B(V％)
0 70 30
3 70 30
10 90 10
12 90 10
15 70 30
流速：1.0ml/min
检测波长：265nm
进样体积：20μl
运行时间：15分钟
实验步骤：
供试品溶液：精密称取奥贝胆酸原料药19.89mg置20ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到第一溶液；再精密量取1ml所得第一溶液置100ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到第二溶液；然后精密量取1ml所得第二溶液置5ml试管，再分别加氢氧化钾溶液、2-乙酰溴-6-甲氧基萘溶液和三乙胺溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。
衍生化空白溶液：精密量取1ml甲醇置5ml试管，在分别加氢氧化钾溶液、2-乙酰溴-6-甲氧基萘溶液和三乙胺溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为衍生化空白溶液。
分别取供试品溶液和衍生化空白溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1和附图2。奥贝胆酸衍生物在9.03min出峰。
结论：图1表明衍生化试剂对奥贝胆酸的测定无干扰；图2表明10ug/ml的奥贝胆酸溶液通过衍生化后在此色谱条件下可检测。
实施例2
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1210紫外检测器
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(150×4.6mm,5μm)；
流动相A：甲醇
流动相B：水溶液(用磷酸调节pH至3.0)
梯度洗脱：
时间/min 流动相A(V％) 流动相B(V％)
0 70 30
3 70 30
10 90 10
12 90 10
15 70 30
流速：1.0ml/min
检测波长：265nm
进样体积：20μl
运行时间：15分钟
实验步骤：
供试品溶液：精密量取奥贝胆酸片溶出溶液1ml置5ml试管，在分别加氢氧化钾溶液、4-硝基苯甲酰甲基溴溶液和18-冠醚-6溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。
对照溶液：精密称取奥贝胆酸原料药适量，加甲醇溶解并稀释配制成每1ml约含800ng的奥贝胆酸溶液；再精密量取1ml奥贝胆酸片溶液置5ml试管，再分别加氢氧化钾溶液、4-硝基苯甲酰甲基溴溶液和18-冠醚-6溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为对照溶液。
辅料空白溶液：精密称取辅料(微晶纤维素、羧甲淀粉钠和硬脂酸镁按处方配比组成)适量，加溶出介质溶解，滤过，精密量取续滤液1ml置于5ml试管，再分别加氢氧化钾溶液、4-硝基苯甲酰甲基溴溶液和18-冠醚-6溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为辅料空白溶液。
分别取供试品溶液、对照溶液和辅料空白溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3、附图4和附图5。
结论：图3表明辅料衍生化后对奥贝胆酸的测定无干扰；图4表明3ng的奥贝胆酸在经过衍生化后可以被有效的检测；图5表明10ug/ml的奥贝胆酸片溶出溶液可被有效的定量检测。同时由图5可以看出在此色谱分离条件下，色谱图基线平稳，主峰可以有效的跟杂质峰分开，峰形对称，无拖尾，检测快速。此方法也有效的解决了含有缓冲盐的溶液不能进ELSD检测器进行检测的难题。
实施例3
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1210紫外检测器
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(150×4.6mm,5μm)；
流动相A：乙腈
流动相B：水溶液(用磷酸调节pH为1.5)
梯度洗脱：
时间/min 流动相A(V％) 流动相B(V％)
0 80 20
3 80 20
10 100 0
12 100 0
15 80 20
流速：1.0ml/min
检测波长：265nm
进样体积：20μl
运行时间：15分钟
实验步骤：
供试品溶液：精密称取奥贝胆酸原料药适量置20ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；再分别精密量取0.2ml、0.3ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml和1.2ml置100ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，然后分别精密量取1ml所得溶液置5ml试管，再分别同时加氢氧化钾溶液、4-硝基苯甲酰甲基溴溶液和18-冠醚-6溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为对照溶液。
取供试品溶液在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图6～附图11。
以供试液的进样浓度对峰面积作线性，结果见下表：
浓度(ug/ml) 0.41 0.61 1.02 1.63 2.04 2.65
峰面积 15323.5 23988.5 39520 65168.5 81512.5 107768.5
线性图如附图12所示。由色谱图上的主峰峰面积和样品浓度得到的线性相关系数为0.9999，说明本方法线性良好。
实施例4
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1210紫外检测器
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(150×4.6mm,5μm)；
流动相A：乙腈
流动相B：水溶液(用磷酸调节pH为3.0)
梯度洗脱：
时间/min 流动相A(V％) 流动相B(V％)
0 60 40
3 60 40
10 80 20
12 80 20
15 60 40
流速：1.0ml/min
检测波长：265nm
进样体积：20μl
运行时间：15分钟
实验步骤：
供试品溶液：按奥贝胆酸片原辅料配比，分别精密称取奥贝胆酸原料药和辅料(微晶纤维素、羧甲淀粉钠和硬脂酸镁按处方配比组成)适量，加甲醇溶解，配制成浓度分别为5ug/ml、10ug/ml和13ug/ml的溶液各三份，再精密量取各溶液1ml置5ml试管，然后向各试管中加氢氧化钾溶液、4-硝基苯甲酰甲基溴溶液和18-冠醚-6溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。
对照溶液：精密称取奥贝胆酸原料药适量，加甲醇溶解并稀释配制成每1ml约含10ug的奥贝胆酸溶液；再精密量取1ml的奥贝胆酸溶液置5ml试管，再分别加氢氧化钾溶液、4-硝基苯甲酰甲基溴溶液和18-冠醚-6溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为对照溶液。
辅料空白溶液：精密称取辅料(微晶纤维素、羧甲淀粉钠和硬脂酸镁按处方配比组成)量，加甲醇溶解，滤过，精密量取续滤液1ml置5ml试管，再分别加氢氧化钾溶液、4-硝基苯甲酰甲基溴溶液和18-冠醚-6溶液各250ul，在45℃下反应40min，放冷后，加乙腈定容，摇匀，离心，取上清液作为辅料空白溶液。
分别取供试品溶液、对照溶液和辅料空白溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，各浓度典型图谱见附图13、附图14和附图15。
按外标法计算回收率,结果如下表：
Figure BDA0000725895660000081
结论：上表结果可知平均回收率在99％～101％之间，RSD也小于6％，说明本方法准确度高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，其特征在于，测定条件包括：
(1)待测样品溶液的配制：加入衍生化试剂和催化剂对奥贝胆酸片进行衍生化后配制待测样品溶液；
(2)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相A，酸性水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，
其中，所述梯度洗脱条件为：
时间(min) 流动相A(V％) 流动相B(V％) 0 60～80 40～20 3 60～80 40～20 10 80～100 20～0 12 80～100 20～0 15 60～80 40～20
(3)检测分析：采用高效液相色谱仪对所述待测样品溶液进行检测，以便得到所述待测样品溶液中奥贝胆酸的含量，
其中，所述衍生化试剂为4-硝基苯甲酰甲基溴，所述催化剂为18-冠醚-6；或
所述衍生化试剂为2-乙酰溴-6-甲氧基萘，所述催化剂为三乙胺；
所述有机溶剂为甲醇或乙腈，采用磷酸将所述流动相B的pH调节为1.5～3.0，检测波长为255～275nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用磷酸将所述流动相B的pH调节为3.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化过程中所述衍生化试剂和所述催化剂的试剂量各为250μl、温度为45℃、时间为40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件为：
时间/min 流动相A(V％) 流动相B(V％) 0 60 40 3 60 40 10 80 20 12 80 20 15 60 40
。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为0.8～1.2ml/min。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为1.0ml/min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长为265nm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品溶液进样体积为10～50μl。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述待测样品溶液进样体积为20μl。
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