CN102121924A - 一种醋酸甲基泼尼松龙及其杂质的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种醋酸甲基泼尼松龙及其杂质的分析方法，本发明色谱柱使用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由水溶液和有机溶剂组成，梯度洗脱。该法能将醋酸甲基泼尼松龙原料药中各杂质分离，方法简便可行，重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种醋酸甲基泼尼松龙及其杂质的分析方法，具体涉及用高效液相色谱法对醋酸甲基泼尼松龙原料药中各杂质进行分离和含量测定的方法。
背景技术
醋酸甲基泼尼松龙(11β，17-二羟基-6α甲基-1，4-二烯-3，20-二酮-21-醋酸酯)属于全科类皮质激素，具有广泛的临床推广价值，其也是一种重要的医药中间体，可用于合成泼尼松龙类的衍生物。
醋酸甲基泼尼松龙原料药中常见的杂质是代号为Z5、Z6a、Z6b三种杂质，与醋酸甲基泼尼松龙结构相似，因此难于分离并分析杂质的含量。
表1 醋酸甲基泼尼松龙及其三种杂质
对于醋酸甲基泼尼松龙原料药有关物质测定方法，未见到详细报道。目前此类药物的衍生物的分析多采用的是TLC方法，这种方法不能准确定量相关杂质。虽美国药典USP31版和欧洲药典EP6版中收录了醋酸甲基泼尼松龙原料药的关物质测定方法，但本申请人曾按USP和EP方法进行了实验验证，试验结果发现有如下缺点：
一是醋酸甲基泼尼龙原料药中的杂质不能得到完全的分离；二是测定分析的时间周期较长，超过2个小时；三是流动相配置复杂，给该原料药的有关物质测定带来了不便。
因此，提供一种能将醋酸甲基泼尼松龙原料药中各杂质分离，简便可行、快速的分析方法，很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质的色谱分析方法，该方法能有效的分离和定量醋酸甲基泼尼松龙原料药中的杂质，且快速、简单、可靠。
本发明提供了一种用高效液相色谱法对醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质分离和含量测定的方法，经过多次试验，筛选出了合适的高效液相色谱分析中色谱柱、流动相等条件，达到了上述发明目的。
一种测定醋酸甲基泼尼松龙中有关物质的方法，其特征在于：采用高效液相色谱法，使用的色谱柱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由水和有机溶剂组成，采用梯度洗脱的分析方法；所述有机溶剂选自乙腈和/或四氢呋喃，优选为乙腈。
所述流动相中水和有机溶剂的初始比例(V/V)为：70％～60％∶30％～40％；优选的初始比例为65％∶35％。
所述梯度洗脱分析方法见下表：
表 2梯度洗脱时间与流动相比例
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 40～50 | 80 | 20 |
| 50～60 | 20 | 80 |
| 55～65 | 20 | 80 |
| 55.1～65.1 | 100 | 0 |
A：30％～40％有机溶剂的水溶液
B：100％有机溶剂
表3 优选的梯度洗脱时间与流动相比例
| 时间(min) | 35％乙腈水溶液 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
本发明提供的上述高效液相色谱分析方法，流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min；柱温度为35～45℃，优选为45℃；，检测波长为220～260nm，优选为254nm；以乙腈和甲醇为稀释剂配制成0.5～2.0mg/ml的样品溶液进行有关物质测定，优选为1.0mg/ml。
本发明方法能有效的分离和定量醋酸甲基泼尼松龙原料药中的杂质，使杂质峰与主峰完全分离。与美国药典USP31版和欧洲药典EP6版的方法比较，本发明方法分析速度快、成本节约、操作简单。比较结果见表4：
表4 本发明方法与现有分析方法对比
注：杂质Z6、Z5、Z6a、Z6b各化学名称见表1。
附图说明：
图1：USP方法测定醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质的色谱图；
图2：EP方法测定醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质的色谱图；
图3：本发明方法测定醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质的色谱图；
图4：本发明中有机溶剂比例筛选实验色谱图(比例1)；
图5：本发明中有机溶剂比例筛选实验色谱图(比例2)；
图6：本发明中有机溶剂筛选实验色谱图(四氢呋喃)；
图7：本发明中梯度洗脱时间筛选实验色谱图(梯度洗脱时间1)；
图8：本发明中梯度洗脱时间筛选实验色谱图(梯度洗脱时间2)；
图9：本发明中流动相流速筛选实验色谱图(0.8ml/min)；
图10：本发明中流动相流速筛选实验色谱图(1.2ml/min)；
图11：本发明中柱温筛选实验色谱图(35℃)；
图12：本发明中柱温筛选实验色谱图(40℃)。
具体实施方式：
下面以示例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围，并不限于这些实施例中所使用的色谱分离的流动相、流动相的组成和使用的色谱分离柱及色谱分离柱的填料。
主要实验仪器及色谱条件：
岛津LC2010A型高效液相色谱仪，自动进样器，PDA检测器，色谱分离系统的控制和记录由岛津LC Solution色谱管理系统完成。
试剂：甲醇、乙腈、四氢呋喃，色谱纯；纯水，分析纯；
样品：见表5，生产厂家均为重庆华邦制药股份有限公司。
表5 样品
| 样品名称 | 缩写 | 含量 |
| 醋酸甲基泼尼松龙 | Z6 | |
| 杂质Z5标准品 | Z5 | 99.2％ |
| 杂质Z6a标准品 | Z6a | 99.0％ |
| 杂质Z6b标准品 | Z6b | 99.0％ |
除特别指出外，按以下测定条件：色谱柱：VP-ODS 4.6*250mm，5um；流速：1.0ml/min；柱温：45℃；检测波长：254nm；样品浓度：1.0mg/ml。
实施例1 USP31版方法测定醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质
色谱柱：Hypersil ODS 4.6*250mm，5um；柱温：25℃；流动相：四氢呋喃∶水＝51∶49；稀释溶剂：水∶四氢呋喃∶乙腈∶冰乙酸＝499∶250∶250∶1
各杂质分离效果不理想，实验结果见附图1，Z6主峰出峰时间，RT≈42.4min。
实施例2 EP6方法测定醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质
柱温：25℃；流动相：四氢呋喃∶水＝28∶72；稀释溶剂：水∶四氢呋喃＝50∶50；样品浓度：2.0mg/ml
各杂质分离效果不理想，实验结果见附图2，Z6主峰出峰时间，RT≈47.6min。
实施例3 本发明方法测定醋酸甲基泼尼松龙原料药及其杂质
稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；流动相梯度条件见下表。
表6 流动相梯度
| 时间(min) | 35％乙腈(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
实验结果见附图3，Z6主峰出峰时间，RT＝25.7min；杂质Z6a出峰时间RT＝24.8min；杂质Z5出峰时间RT＝27.7min；杂质Z6b出峰时间RT＝28.8min，各杂质分离效果理想。
实施例4 本发明方法流动相中有机溶剂比例的筛选实验(乙腈)
稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；流动相梯度条件如下：
表7 流动相筛选比例1
| 时间(min) | 30％乙腈水溶液 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
表8 流动相筛选比例2
| 时间(min) | 40％乙腈水溶液 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
实验结果：有机溶剂比例1实验结果见附图4，有机溶剂比例2实验结果见附图5，由图可见主峰和各杂质分离效果理想。
实施例5 本发明方法流动相中有机溶剂的筛选实验(四氢呋喃)
稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；流动相：四氢呋喃∶水＝20∶80；实验结果见附图6，主峰与各杂质能有效分离。
实施例6 本发明方法中梯度洗脱时间的筛选实验
稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；流动相梯度条件如下：
表9 梯度洗脱时间筛选1
| 时间(min) | 35％乙腈水溶液 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 40 | 80 | 20 |
| 50 | 20 | 80 |
| 55 | 20 | 80 |
| 55.1 | 100 | 0 |
表10 梯度洗脱时间筛选2
| 时间(min) | 35％乙腈水溶液 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 50 | 80 | 20 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 20 | 80 |
| 65.1 | 100 | 0 |
实验结果：梯度洗脱时间1的实验结果见附图7，梯度洗脱时间2的实验结果见附图8，由图可见主峰和各杂质分离效果理想。
实施例7 本发明方法中实验
流速：0.8ml/min、1.2ml/min；稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；流动相梯度条件如下：
表11 流动相流速筛选
| 时间(min) | 35％乙腈 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
实验结果：流速为0.8ml/min和1.2ml/min时的实验结果见附图9、附图10；由图可见主峰和各杂质分离效果理想。
实施例8 本发明方法中实验
柱温：30、40℃；稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；流动相梯度条件如下
表12 柱温筛选
| 时间(min) | 35％乙腈 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
实验结果：柱温为30和40℃时的实验结果见附图11、附图12；由图可见主峰和各杂质分离效果理想。
实施例9 本发明方法中检测波长筛选实验
稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；波长：227nm、254nm、260nm；流动相梯度条件如下：
表13 流动相梯度
| 时间(min) | 35％乙腈 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
实验结果：检测波长分别为227nm、254nm和260nm时的实验结果见下表，各杂质检测水平基本一致。
表14 检测波长筛选
| 检测波长 | Z6a | Z6 | Z5 | Z6b |
| 227nm | 0.47％ | 93.67％ | 1.53％ | 2.34％ |
| 254nm | 0.47％ | 94.49％ | 1.47％ | 2.10％ |
| 260nm | 0.46％ | 95.59％ | 1.01％ | 2.00％ |
实施例10 本发明方法中样品浓度的筛选实验
稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；样品浓度：0.5、1.0、2.0mg/ml；流动相梯度条件为：
表15 流动相梯度
| 时间(min) | 35％乙腈 | 100％乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
实验结果：样品浓度分别为0.5、1.0、2.0mg/ml时的实验结果见下表；各杂质检测水平基本一致。
表16 样品浓度筛选
| 样品浓度 | Z6a | Z6 | Z5 | Z6b |
| 0.5mg/ml | 3.11％ | 91.37％ | 0.58％ | 0.69％ |
| 1.0mg/ml | 3.25％ | 91.22％ | 0.59％ | 0.73％ |
| 2.0mg/ml | 3.35％ | 91.12％ | 0.60％ | 0.75％ |
实施例11 原料药醋酸甲基泼尼松龙中的潜在杂质Z5、Z6a、Z6b的定量限检测
主要实验仪器及色谱条件：仪器：岛津高效液相色谱仪(PDA检测器)；稀释溶剂：乙腈∶甲醇＝50∶50；流动相梯度条件如下：
表17 流动相梯度
| 时间(min) | 35％乙腈(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 45 | 80 | 20 |
| 55 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
| 65 | 100 | 0 |
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品，精密称定，加稀释剂至合适溶度，摇匀，过滤，即得，进样并记录色谱图。
表18 醋酸甲基泼尼松龙中的潜在杂质Z5、Z6a、Z6b的定量限结果
Claims (6)
1.一种醋酸甲基泼尼松龙及其杂质的分析方法，其特征在于：采用高效液相色谱法，使用的色谱柱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由水和有机溶剂组成，采用梯度洗脱的分析方法；所述有机溶剂选自乙腈和/或四氢呋喃。
2.权利要求1所述的测定方法，其中所述有机溶剂选自乙腈。
3.权利要求1所述的测定方法，所述流动相中水和有机溶剂的初始比例(V/V)为70％～60％∶30％～40％。
4.权利要求3所述的测定方法，所述流动相中水和有机溶剂的初始比例(V/V)为65％∶35％。
5.权利要求1所述的测定方法，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/mi；柱温度为35～45℃；检测波长为220～260nm；；样品用乙腈和甲醇为稀释剂配制成0.5～2.0mg/ml的溶液进行测定。
6.权利要求5所述的测定方法，所述流动相的流速为1.0ml/min；柱温度为45℃；检测波长为254nm；样品用乙腈和甲醇为稀释剂配制成1.0mg/ml的溶液进行测定。
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