CN115327010B - Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法 - Google Patents

Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种Fmoc‑L‑Pro‑OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，采用液相色谱仪测定，色谱条件为：色谱柱：以十八烷基键合硅胶C18为填充剂；流动相：以0.15±0.05％磷酸水溶液为流动相A，以甲醇‑乙腈溶液为流动相B；柱温：35±2℃；进样量：2.5±0.5微升；洗脱方式：梯度洗脱；流速：1.0±0.1ml/min；检测波长：210nm。采用本发明的高效液相色谱分析方法，可以同时准确测定Fmoc‑L‑Pro‑OH.H2O氨基酸及其相关杂质的含量，分析过程中供试品及其相关杂质的分离度高，重复性好，为生产过程中对原料的质量把控提供了简单可靠的方法，也为其他带保护基团氨基酸物料的分析方法开发提供参考指导。

Description

Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法
技术领域
本发明属于氨基酸检测技术领域，具体涉及一种带保护基团Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法。
背景技术
Fmoc-L-Pro-OH.H2O，化学名称为:芴甲氧羰基-L-脯氨酸，在多肽合成过程中应用广泛，国内有多家供应商，比如成都郑源、成都泰和。其结构式为：
在固相合成的反应阶段，Fmoc-L-Pro-OH.H2O起始物料中所带有的杂质都可以参与固相合成的反应过程，有些杂质例如残留溶剂在紫外下响应小或者不响应，被漏掉的杂质可能严重影响固相合成，产生不需要的成品杂质，增加下游分离纯化工艺的难度，同时影响合成的收率。
但是，市面上对于带保护基团氨基酸的质量控制方法多以纯度进行控制，并使用峰面积归一化法进行计算。而峰面积归一化法要求所有的物质在选定紫外波长下都能够有所响应，并且响应效果较好，如果用峰面积归一化法进行含量测定是需要计算出相关杂质的相对校正因子，有且只有当校正因子范围在0.9～1.1之间时可不进行校正，直接计算，而查阅现有的方法并未考虑到杂质与主成分之间的相对校正因子。
专利CN111505160A使用的流动相为三氟乙酸/水体系，但是在南方尤其是沿海地区，三氟乙酸的挥发会影响流动相的组成比例，重现性较差，且对分析方法没有进行充分的验证；同时在方法实施过程中相关杂质之间的分离度仅仅控制在1.0范围，而药典规定液相色谱分离度要求≥1.5，因此并不能很好的用于生产中对物料的质量控制。另外，该专利将带保护氨基酸的检测波长控制在220nm～260nm之间，但是根据实际对20种不同带保护氨基酸的全波长扫描，大部分氨基酸在210nm左右具有良好的响应。
发明内容
本发明的发明目的是：提供一种Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，基线平稳，杂质分离效果满足药典要求，专属性好，灵敏度高，克服现有技术的不足，并且为其他类型带保护氨基酸的分析方法开发提供参考。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，采用液相色谱仪测定，色谱条件为：
色谱柱：以十八烷基键合硅胶C18为填充剂；
流动相：以0.15±0.05％磷酸水溶液为流动相A，以甲醇-乙腈溶液为流动相B；
柱温：35±2℃；进样量：2.5±0.5微升；
洗脱方式：梯度洗脱；
流速：1.0±0.1ml/min；
检测波长：210nm；
供试品品配置浓度：1.0±0.1mg/ml；
梯度程序如下：
进样程序：空白溶液1-2针、系统适用性溶液1针、供试品溶液双样单针、自身对照溶液双样单针；
其中，供试品中的主成分Fmoc-L-Pro-OH.H2O的含量按照式1)和式2)计算；采用自身对照溶液Fmoc-L-Pro-OH.H2O峰面积计算供试品中各相关杂质量，各相关杂质相对主成分的百分含量按照式3)计算，所述相关杂质为Fmoc-OH、Fmoc-OSU、Fmoc-β-Ala-0H、Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH：
C＝(y+3.1172)÷16447 1)
供试品主成分含量＝C*V 2)
式中：y为供试品中主成分检测峰面积，C为供试品主成分浓度(mg/ml)；V为配置供试品的体积(ml)，AR为自身对照溶液Fmoc-L-Pro-OH.H2O峰面积，AX为供试品中相关杂质峰面积，f为校正因子。
优选地，所述流动相A采用0.15％磷酸水溶液，所述流动相B体积比为10∶90的甲醇-乙腈溶液。
优选地，所述空白溶液的配置方法为：混匀体积比为30∶70的流动相A和流动相B。
优选地，所述系统适用性溶液的配置方法为：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O 100±1mg，置于100ml量瓶，加入相关杂质对照溶液贮备液各1ml，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得；相关杂质对照溶液贮备液的配置是将各相关杂质与空白溶液稀释成浓度为100±5μg/ml。
优选地，所述供试品溶液的配置方法为：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O10±0.05mg置于10ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀即得，浓度为1±0.05mg/ml。
优选地，所述自身对照溶液的配置方法为：量取供试品溶液1ml，置于10ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，重复上述操作，逐级稀释至浓度为1±0.05μg/ml。
优选地，所述进样量为2.5微升，流速为1.0ml/min，柱温35℃；所述色谱柱规格为4.6mm×250mm×5μm，供试品品进样浓度为1mg/ml。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的高效液相色谱分析方法，通过改变流动相的体系，使带Fmoc保护基的主成分和相关杂质与流动相极性相接近，调整洗脱梯度，可以同时准确测定Fmoc-L-Pro-OH.H2O氨基酸及其相关杂质的含量，分析过程中供试品及其相关杂质的分离度高，重复性好，为生产过程中对原料的质量把控提供了简单可靠的方法，也为其他带保护基团氨基酸物料的分析方法开发提供参考指导。
本发明测定相关杂质与主成分之间的相对校正因子，采用主成分自身对照法使Fmoc-L-Pro-OH.H2O物料中杂质的含量测定精确，并且不受环境的影响，基线平稳，杂质分离效果满足药典要求，专属性好，灵敏度高。
附图说明
图1为本发明实施例1的供试品溶液HPLC图谱。
图2为本发明实施例1的0.1％主成分自身对照溶液HPLC图谱。
图3为本发明色谱条件专属性验证的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，采用液相色谱仪测定，具体包括以下步骤：
一、溶液的配制：
0.15％磷酸水溶液：量取屈臣氏水1L，加磷酸1.5mL，混匀后超声30min，即得；
甲醇-乙腈：量取甲醇100mL，量取乙腈900mL，混匀后超声30min，即得；
空白溶液：量取0.15％磷酸水溶液300mL，量取甲醇-乙腈700mL，混匀后超声30min，即得；
Fmoc-OH对照溶液贮备液：称定Fmoc-OH对照品10.50mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为105.0μg/ml；
Fmoc-OSU对照溶液贮备液-：称定Fmoc-OSU对照品10.14mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为101.4μg/ml；
Fmoc-β-Ala-OH对照溶液贮备液：称定Fmoc-β-Ala-OH对照品10.37mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为103.7μg/ml；
Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照溶液贮备液：称定Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照品10.35mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为103.5μg/ml；
Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液贮备液：称定Fmoc-Pro-Pro-OH对照品10.38mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为103.8μg/ml；
系统适用性溶液:称定Fmoc-Pro-OH.H2O对照品100.54mg，置100ml量瓶，加入上述Fmoc-OH、Fmoc-OSU、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液贮备液各1ml，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O供试品10.17mg，置10ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为1.017mg/ml；
自身对照溶液：量取供试品溶液1ml,置10ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，重复上述操作，逐级稀释至每ml含供试品1ug的溶液；
二、进样程序：
空白溶液1针、系统适用性溶液1针、供试品溶液双样单针、自身对照溶液双样单针。
三、色谱条件如表1：
四、结果计算
液相色谱图参见图1-2，计算公式如下：
C＝(y+3.1172)÷16447 1)
供试品主成分含量＝C*V 2)
按照式1)和式2)计算得出供试品中主成分Fmoc-L-Pro-0H.H2O含量为9.86mg。
按照式2)计算得出相关杂质的百分含量如下：Fmoc-OH(0.031％)、Fmoc-OSU(0.016％)、Fmoc-β-Ala-OH(未检出)、Fmoc-β-Ala-Pro-OH(0.0041％)、Fmoc-Pro-Pro-OH(未检出)。
接下来依据现有的法规以及ICH指导原则对分析方法进行验证，验证项目包括专属性、检测限和定量限、线性和范围、准确度、重复性、进样精密度、中间精密度、溶液稳定性、耐用性(流速、柱温、不同批次填料的同类型色谱柱)，各项目色谱条件参见表1，验证结果如下：
1、专属性
Fmoc-OH对照品储备液：称定Fmoc-OH对照品10.50mg，置于100ml的容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为105.0μg/ml。
Fmoc-Osu对照品储备液：称定Fmoc-OSU对照品10.14mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为101.4μg/ml；
Fmoc-β-Ala-OH对照溶液贮备液：称定Fmoc-β-Ala-OH对照品10.37mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为103.7μg/ml
Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照溶液贮备液：称定Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照品10.35mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为103.5μg/ml
Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液贮备液：称定Fmoc-Pro-Pro-OH对照品10.38mg，置100ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得,浓度为103.8μg/ml；
专属性性溶液:称定Fmoc-Pro-OH.H2O对照品100.54mg，置100ml量瓶，加入上述Fmoc-OH、Fmoc-OSU、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液贮备液各1ml，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得
Fmoc-OH对照溶液：量取上述Fmoc-OH对照溶液储备液0.5ml,置于50ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.050μg/ml。
Fmoc-OSU对照溶液：量取上述Fmoc-OSU对照溶液储备液0.5ml,置于50ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.014μg/ml。
Fmoc-β-Ala-OH对照溶液：量取上述Fmoc-β-Ala-OH对照溶液储备液0.5ml,置于50ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.035μg/ml。
Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液：量取上述Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液储备液0.5ml,置于50ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.038μg/ml。
供试品溶液：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O 10.17mg,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.017mg/ml。
溶液进样顺序：空白溶液进样1针、对照品定位溶液各进样1针、供试品溶液进样1针、专属性溶液进样1针结果如表2。
表2：本发明专属性验证结果表
2、定量限
定量限溶液的配置：
Fmoc-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-OH对照品10.14mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为101.4μg/ml。
Fmoc-OSU对照溶液储备液：称定Fmoc-OSU对照品10.19mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为101.9μg/ml。
Fmoc-β-Ala-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-β-Ala-OH对照品10.09mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为100.9μg/ml。
Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照品10.13mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为101.3μg/ml。
Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-Pro-Pro-OH对照品10.02mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为100.2μg/ml。
供试品溶液储备液：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O供试品10.07mg,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.007mg/ml。
Fmoc-OH对照溶液：量取上述Fmoc-OH对照溶液储备液0.1ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.014μg/ml。
Fmoc-OSU对照溶液：量取上述Fmoc-OH对照溶液储备液0.1ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.019μg/ml。
Fmoc-β-Ala-OH对照溶液：量取上述Fmoc-OH对照溶液储备液0.1ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.009μg/ml。
Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照溶液：量取上述Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照溶液储备液0.1ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.013μg/ml。
Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液：量取上述Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照溶液储备液0.1ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.002μg/ml。
供试品溶液：量取上述供试品溶液储备液0.1ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为10.07μg/ml。
定量限溶液：量取上述Fmoc-OH对照溶液150ul,Fmoc-OSU对照溶液1.5ml,Fmoc-β-Ala-OH对照溶液250ul,Fmoc-β-Ala-OH对照溶液490ul,Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液555ul,供试品溶液200ul置于10ml容量瓶中，加空白稀释至刻度，摇匀，即得。
进样顺序：空白溶液进样1针、系统适用性溶液进样1针、定量限溶液进样6针。结果如表3。
表3为本发明定量限验证结果表
3、线性和范围
线性溶液的配置
Fmoc-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-OH对照品10.14mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为101.4μg/ml。
Fmoc-OSU对照溶液储备液：称定Fmoc-OSU对照品10.19mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为101.9μg/ml。
Fmoc-β-Ala-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-β-Ala-OH对照品10.09mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为100.9μg/ml。
Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-β-Ala-Pro-OH对照品10.13mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为101.3μg/ml。
Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液储备液：称定Fmoc-Pro-Pro-OH对照品10.02mg,置于100ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为100.2μg/ml。
主成分对照品溶液储备液：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O对照品10.24mg,置于10ml的容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.024mg/ml。
线性溶液储备液(200％)：精密量取上述杂质对照品储备液各2ml,主成分对照品溶液0.2ml,置于100ml的容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液(150％)：精密量取上述线性溶液储备液7.5ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液(100％)：精密量取上述线性溶液储备液5.0ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液(50％)：精密量取上述线性溶液储备液2.5ml,置于10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液：同上。
主成分的线性溶液：
主成分对照品储备液：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O对照品50.00mg,置于25ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为2.000mg/ml。
线性溶液(80％)：精密量取上述对照品储备液2ml,置于5ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为0.80mg/ml。
线性溶液(90％)：精密量取上述对照品储备液2.25ml,置于5ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为0.90mg/ml。
线性溶液(100％)：精密量取上述对照品储备液2.5ml,置于5ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.00mg/ml。
线性溶液(110％)：精密量取上述对照品储备液2.75ml,置于5ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.10mg/ml。
线性溶液(120％)：精密量取上述对照品储备液3ml,置于5ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为1.20mg/ml。
杂质线性进样顺序：空白溶液1针、系统适用性溶液1针、定量限溶液、线性溶液(50％)、线性溶液(100％)、线性溶液(150％)、线性溶液(200％)、系统适用性溶液1针。
主成分线性进样顺序：空白溶液1针、系统适用性溶液1针、、线性溶液(80％)、线性溶液(90％)、线性溶液(100％)、线性溶液(110％)、线性溶液(120％)系统适用性溶液1针。
用线性方程的斜率(k)来计算各杂质的校正因子，公式为：校正因子＝主成分斜率/各杂质斜率。根据线性的结果计算各组分的校正因子，异构体校正因子应介于0.9～1.1之间，超出该范围需代入该杂质量计算。结果如表4-6。
表4为本发明相关杂质的线性方程
表5为本发明主成分的线性方程
表6为本发明相关杂质的校正因子
4、准确度
4.1主成分的准确度：
溶液配制：
空白溶液：量取0.15％磷酸水溶液300mL，量取甲醇-乙腈700mL，混匀后超声30min，即得；
系统适用性溶液：同上；
准确度A溶液：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O供试品10mg，置10ml量瓶，加空白溶液稀释，制成每1ml含供试品1.0mg的溶液，平行制备2份，记为A1、A2。
准确度B溶液：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O对照品适量，加空白溶液稀释为0.8mg/ml、1.0mg/ml和1.2mg/ml的对照品溶液，分别记为B1、B2、B3，每种浓度分别制备3份。
准确度C溶液：A、B等体积混匀作为回收样品溶液，记为C。
进样顺序：空白溶液，进样1针；系统适用性溶液，进样1针；准确度溶液,各进样1针；系统适用性溶液，进样1针；结果如表7。
表7为本发明主成分准确度验证结果表
4.2相关杂质的准确度
空白溶液：量取0.15％磷酸水溶液300mL，量取甲醇-乙腈700mL，混匀后超声30min，即得；
系统适用性溶液：同上；
准确度A溶液：称定供试品10mg，置10ml量瓶，加空白溶液稀释，制成每1ml含供试品1.0mg的溶液，平行制备2份，记为A1、A2。
准确度B溶液：按定量限、100％限度(1ug/ml)、200％限度(2ug/ml)配制3组溶液，量取Fmoc-OH、Fmoc-OSU、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液贮备液适量，置10ml容量瓶，加空白溶液定量稀释成含目标组分浓度的溶液，摇匀，即得；分别记为B1、B2、B3；每种浓度分别制备3份，分别记为B1-1、B1-2、B1-3、B2-1、B2-2、B2-3、B3-1、B3-2、B3-3；
准确度C溶液：称定供试品1mg，置10ml容量瓶，按定量限、100％限度(1ug/ml)、200％限度(2ug/ml)配制3组溶液，量取Fmoc-OH、Fmoc-OSU、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH对照溶液贮备液适量，摇匀，即得；分别记为C1、C2、C3；每种浓度分别制备3份，分别记为C1-1、C1-2、C1-3、C2-1、C2-2、C2-3、C3-1、C3-2、C3-3；
进样顺序：空白溶液进样1针、系统适用性溶液进样1针、系统适用性溶液进样1针、准确度溶液各进样1针。结果如表8。
表8为本发明相关杂质的准确度验证结果表
/>
5、重复性
平行配置6份供试品溶液，连续6次进样，Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-OH与Fmoc-L-Pro-OH.H2O、Fmoc-OSU峰面积和保留时间的RSD％均＜3.0％。
6、中间精密度
由不同实验人员平行配置6份供试品溶液，Fmoc-L-Pro-OH.H2O峰面积和保留时间RSD值均≤3.0％。
7、溶液稳定性
将配置好的供试品溶液(稳定性溶液)于温度5℃±3℃考察期间(0h、24h、48h、72h、96h、120h)Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-OH、Fmoc-OSU及Fmoc-L-Pro-OH.H2O保留时间、峰面积RSD值均≤3.0％；符合标准。
8、耐用性
流速在(±0.1ml/min)、柱温在(±2.0℃)变动下，系统适用性溶液中各组分的分离度符合要求；在不同批次填料色谱柱下，系统适用性溶液中各组分的分离度符合要求。
以上显示和描述了本发明创造的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明创造精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，其特征在于，采用液相色谱仪测定，色谱条件为：
色谱柱：规格为4.6mm×250mm×5μm，以十八烷基键合硅胶C18为填充剂；
流动相：以0.15±0.05％磷酸水溶液为流动相A，以体积比为10∶90的甲醇-乙腈溶液为流动相B；
柱温：35±2℃；进样量：2.5±0.5微升；
洗脱方式：梯度洗脱；
流速：1.0±0.1ml/min；
检测波长：210nm；
供试品品配置浓度：1.0±0.1mg/ml；
梯度程序如下：
时间/分钟 流动相A/％ 流动相B/％ 0.00 48.0 52.0 11.00 48.0 52.0 16.00 25.0 75.0 20.00 25.0 75.0 20.10 48.0 52.0 35.00 48.0 52.0
进样程序：空白溶液1～2针、系统适用性溶液1针、供试品溶液双样单针、自身对照溶液双样单针；
其中，供试品中的主成分Fmoc-L-Pro-OH.H2O的含量按照式1)和式2)计算；采用自身对照溶液Fmoc-L-Pro-OH.H2O峰面积计算供试品中各相关杂质量，各相关杂质相对主成分的百分含量按照式3)计算，所述相关杂质为Fmoc-OH、Fmoc-OSU、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Pro-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH：
C＝(y+3.1172)÷16447 1)
供试品主成分含量＝C*V 2)
式中：y为供试品中主成分检测峰面积，C为供试品主成分的实际浓度，单位为mg/ml，V为供试品的体积，单位为ml，AR为自身对照溶液Fmoc-L-Pro-OH.H2O峰面积，AX为供试品中相关杂质峰面积，f为校正因子。
2.根据权利要求1所述的Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，其特征在于：所述流动相A采用0.15％磷酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，其特征在于：所述空白溶液的配置方法为：混匀体积比为30∶70的流动相A和流动相B。
4.根据权利要求1所述的Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，其特征在于：所述系统适用性溶液的配置方法为：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O 100±1mg，置于100ml量瓶，加入相关杂质对照溶液贮备液各1ml，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得；相关杂质对照溶液贮备液的配置是将各相关杂质与空白溶液稀释成浓度为100±5μg/ml。
5.根据权利要求1所述的Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，其特征在于：所述供试品溶液的配置方法为：称定Fmoc-L-Pro-OH.H2O置于10ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀即得，浓度为1±0.05mg/ml。
6.根据权利要求1所述的Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，其特征在于：所述自身对照溶液的配置方法为：量取供试品溶液1ml，置于10ml量瓶，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，重复上述操作，逐级稀释至浓度为1±0.05μg/ml。
7.根据权利要求1所述的Fmoc-L-Pro-OH.H2O及相关杂质的含量测定方法，其特征在于：所述进样量为2.5微升，流速为1.0ml/min，柱温35℃；供试品品进样浓度为1mg/ml。
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基于镍催化还原偶联构建C-C键并应用于二聚二酮哌嗪生物碱的合成研究;罗隆;中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑(第8期);全文 *

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