CN115184498B - N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了N‑Boc‑哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,属于药物分析技术领域。本发明采用高效液相色谱法,色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,检测波长为205nm,以磷酸盐缓冲液为流动相A,乙腈为流动相B;采用紫外检测器;磷酸盐缓冲液的pH值为6.4~6.6。本方法通过对流动相pH值、色谱柱和洗脱梯度等参数进行选择和设计,实现了在高效液相色谱法中使用常规紫外检测器和反相色谱柱对哌嗪含量的测定。本方法具有操作简便、适用性强、灵敏度高、准确度高、重现性良好等特点,为哌嗪的液相色谱检测提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域,特别是涉及N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法。
背景技术
伏硫西汀为抗抑郁药,作用机制尚不完全明确,但被认为与抑制5-羟色胺(5-HT)再摄取导致的血清素活性增强有关。伏硫西汀还具有其他一些活性,包括5-HT3受体拮抗作用和5-HT1A受体激动作用,这些活性在伏硫西汀发挥抗抑郁效应中的作用尚未确定。伏硫西汀结构式如下所示:
作为合成伏硫西汀的起始物料N-Boc-哌嗪,结构式如下所示:
作为合成N-Boc-哌嗪的起始物料哌嗪,结构如式所示:
N-Boc-哌嗪为合成伏硫西汀的起始物料,有必要对其有关物质及其杂质传递进行研究。哌嗪为合成N-Boc-哌嗪的起始物料,反应不完全可能会残留到N-Boc-哌嗪中,因此需进行研究。
通过相关文献及专利调研发现:哌嗪几乎无紫外吸收,且极性较大,无法用常规的反相高效液相色谱法检测,多数报道采用离子色谱法、气相色谱法、拉曼光谱法或衍生化等方法检测哌嗪或其结构类似物的含量。通过分析方法考察试验发现:文献及相关专利报道的离子色谱法、气相色谱法及衍生化等方法并不适用于测定N-Boc-哌嗪中哌嗪的含量,相关方法存在专属性差、重现性差、准确度低、可操作性及系统适用性差的问题。
黄川徽等在《南京工业大学学报》2005年3月发表论文《紫外分光光度法快速测定哌嗪》中指出,哌嗪紫外吸收弱,最强峰对应波长处吸光度线性范围窄,对不同浓度下浓度-吸光度数据进行最小二乘线性拟合,计算线性相关系数,结果在最强峰对应波长(228.5nm)处,虽然灵敏度大,但线性很差(线性相关系数仅为0.7328),而在244~275nm波长范围内,线性有改善,但灵敏度低;公开专利申请“一种哌嗪水溶液定量检测的方法”(申请号:CN201911365151.6)提供了采用对苯醌作为显色剂,与哌嗪分子发生氧化还原反应从而检测哌嗪含量的方法。然而,该方法准确性较低。且以上两者均采用紫外分光光度法,为非专属性方法。
而哌嗪作为N-Boc-哌嗪中的杂质,在药物分析工作中,需要采用专属性、灵敏度、精密度、准确度较高的检测方法,现有文献中均未有较为满意的方法公开。
发明内容
为了解决现有技术的以上问题,本发明提供了N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,具备专属性、灵敏度、线性、精密度、准确度及耐用性良好等优势。本发明的技术方案如下所述:
N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,采用高效液相色谱法,其色谱条件包括:色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,检测波长为205nm,以磷酸盐缓冲液为流动相A,乙腈为流动相B;采用紫外检测器;磷酸盐缓冲液的pH值为6.4~6.6。
本发明在研究试验中偶然发现,哌嗪在不同pH的磷酸盐缓冲液中,紫外吸收存在明显差异:酸性稀释剂(pH 3.5~6.0)中,在紫外区几乎无明显吸收,哌嗪供试液采用紫外分光光度法测得的紫外全波长扫描图(190~400nm)基本一致;当稀释剂pH调整至6.5附近时,λmax发生红移,哌嗪在205nm处的紫外吸收增强;当稀释剂pH调整至11.0时,λmax红移至214nm处。
哌嗪的pka为9.83,当流动相pH调整至11.0时,哌嗪在紫外区检测的灵敏度较高,但试验中发现,该pH的流动相条件下液相色谱图中的峰型较差,且在反相色谱柱中无保留,无法满足定量要求。通过将流动相pH调整为6.5,并在流动相A中增加离子对试剂辛烷磺酸钠,哌嗪在反相色谱中保留且检测灵敏度增强。
优选的,N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,流动相采用如下梯度程序洗脱:
在0~8分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持80~90:10~20不变;在8.0~8.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由80~90:10~20线性渐变至30:70;在8.1~23分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变;在23~23.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由30:70线性渐变至80~90:10~20;在23.1~40分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持80~90:10~20不变,即为色谱柱平衡时间。
优选的,流动相A中所述磷酸盐缓冲液配制方法为:取1-辛烷磺酸钠2.16g,磷酸二氢钾2.72g,加水1000ml使溶解,调pH至6.4~6.6。
进一步的,所述磷酸盐缓冲液用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至6.5。
优选的,所述色谱柱选自:Waters XBridge C18,4.6×100mm,5μm;或AgilentZORBAX Extend C18,4.6×100mm,5μm。
优选的,柱温选自30~40℃,优选为35℃。
优选的,流动相流速选自0.8~1.2m/min,优选1.0ml/min。
优选的,溶剂采用乙腈-水溶液。
优选的,流动相洗脱梯度为:
在0~8分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变;在8.0~8.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由85:15线性渐变至30:70;在8.1~23分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变;在23~23.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由30:70线性渐变至85:15;在23.1~40分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变,即为色谱柱平衡时间。
优选的,采用乙腈-水(50∶50)作为溶剂配制对照品溶液及供试品溶液,哌嗪对照品溶液浓度为0.1mg/ml,N-Boc-哌嗪供试品溶液浓度为10mg/ml。
进一步的,所述检测方法为:
(1)色谱条件为:
仪器:高效液相色谱仪-紫外检测器;
色谱柱:Waters XBridge C18,4.6mm×150mm,5μm;
检测波长:205nm;
进样体积:20μl;
柱温:35℃;
流速:1.0ml/min;
流动相A:磷酸盐缓冲液(取1-辛烷磺酸钠2.16g,磷酸二氢钾2.72g,加水1000ml使溶解,用1mol/L氢氧化钾溶液调pH至6.4~6.6)
流动相B:乙腈
洗脱程序为:
在0~8分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变;在8.0~8.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由85:15线性渐变至30:70;在8.1~23分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变;在23~23.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由30:70线性渐变至85:15;在23.1~40分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变,即为色谱柱平衡时间;
(2)溶液配制:
溶剂:乙腈-水(50︰50);
供试品溶液:取N-boc-哌嗪适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约10mg N-boc-哌嗪的溶液,作为供试品溶液;
对照品溶液:取哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约0.1mg哌嗪的溶液,作为对照品溶液;
灵敏度溶液:精密量取对照品溶液1.0ml,置20ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,即得。
(3)测定法:
精密量取溶剂、灵敏度溶液、对照品溶液及供试品溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,按照外标法计算N-boc-哌嗪中杂质哌嗪的含量。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明未参考文献报道中相对复杂的检测方法,而是选用分析实验室更为常用的高效液相色谱法(紫外检测器)和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,并摸索出合适的流动相pH值,实现准确测定作为杂质的哌嗪的含量的目的,本方法尚未在相关文献报道中出现,为哌嗪的液相色谱检测提供了新的思路;
2、本发明利用哌嗪在紫外区的λmax随稀释剂pH增大发生红移,通过调节流动相pH以增强哌嗪在紫外区检测的灵敏度,且通过适度调节流动相pH值(pKa±2之外)改善峰形、并在流动相中加入离子对试剂增强了哌嗪在常规C18色谱柱中的保留,实现了哌嗪作为杂质的准确定量测定;
3、本发明通过色谱柱筛选及洗脱梯度调整,消除了稀释剂、N-Boc-哌嗪及N-Boc-哌嗪中其他杂质(杂质3、杂质4、杂质9及未知杂质)对哌嗪测定的干扰,最终实现了采用配备常规紫外检测器的高效液相色谱法和C18色谱柱对哌嗪含量的测定;本方法具备专属性、灵敏度、线性、精密度、准确度及耐用性良好等优势。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为哌嗪在磷酸盐缓冲液-乙腈(50︰50)溶液中的全波长扫描图;
图2为实施例1中对照品溶液及供试品溶液色谱图;
图3为实施例2专属性试验中加标供试品溶液色谱图;
图4为实施例2耐用性试验中不同流速的加标供试品溶液色谱图,由上至下依次为流速1.0ml/min、0.8ml/min、1.2ml/min;
图5为实施例2耐用性试验中不同柱温的加标供试品溶液色谱图,由上至下依次为柱温35℃、30℃、40℃;
图6为实施例2耐用性试验中不同品牌色谱柱的加标供试品溶液色谱图,由上至下依次为色谱柱1、色谱柱2;
图7为实施例3耐用性试验中不同流动相pH值的加标供试品溶液色谱图,由上至下流动相pH依次为6.4、6.2、7.8、6.5、6.6。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本实施例检测了Y01113301批、Y01020302批N-boc-哌嗪中哌嗪的含量,方法学试验中采用Y01113301批样品进行试验。其他试剂均为市售产品。
实施例1:N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法
1.1紫外吸收波长扫描:
以磷酸盐缓冲液(取1-辛烷磺酸钠2.16g,磷酸二氢钾2.72g,加水1000ml使溶解,用1mol/L氢氧化钾溶液调pH至6.5)-乙腈(50:50)为稀释剂配制浓度为10mg/ml的哌嗪溶液,采用紫外分光光度计在200-400nm范围内进行全波长扫描,如图1所示,可见在该pH值的稀释剂中,哌嗪的最大吸收波长为207nm,在以该稀释剂作为流动相的色谱条件下,最终选择最大吸收波长附近的205nm作为检测波长。并采用较为常用的乙腈-水溶液作为溶剂配制供试品及对照品溶液。
1.2色谱条件
仪器:高效液相色谱仪-紫外检测器,
色谱柱:Waters XBridge C18,4.6mm×150mm,5μm,
检测波长:205nm,
进样体积:20μl,
柱温:35℃,
流速:1.0ml/min,
流动相A:磷酸盐缓冲液(取1-辛烷磺酸钠2.16g,磷酸二氢钾2.72g,加水1000ml使溶解,用1mol/L氢氧化钾溶液调pH至6.5),
流动相B:乙腈,
梯度洗脱:
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 85 | 15 |
8 | 85 | 15 |
8.1 | 30 | 70 |
23 | 30 | 70 |
23.1 | 85 | 15 |
40 | 85 | 15 |
1.3溶液配制
溶剂:乙腈-水(50︰50);
供试品溶液:取N-boc-哌嗪适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约10mg N-boc-哌嗪的溶液,作为供试品溶液。
对照品溶液:取哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约0.1mg哌嗪的溶液,作为对照品溶液。
灵敏度溶液:精密量取对照品溶液1ml,置20ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,即得。
1.4测定法
精密量取溶剂、灵敏度溶液、对照品溶液及供试品溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,按照外标法计算N-boc-哌嗪中杂质哌嗪的含量,结果如图2和表1所示,其中,由上至下依次为对照品溶液、Y01113301供试品溶液、Y01020302供试品溶液。
表1两批N-boc-哌嗪样品中杂质哌嗪的含量
可接受标准 | Y01020302 | Y01113301 |
≤1.0% | 0.59% | 0.35% |
实施例2:方法学验证试验
2.1系统适用性
对照品溶液:取哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约0.1mg哌嗪的溶液,作为对照品溶液。
灵敏度溶液:精密量取对照品溶液1ml,置20ml量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,即得。
按照本发明实施例1色谱条件,精密量取溶剂、灵敏度溶液、对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见表2。
表2方法学验证-系统适用性结果
结论:灵敏度溶液色谱图中,哌嗪色谱峰信噪比大于10;对照品溶液重复进样3针,哌嗪峰面积的RSD小于5.0%,对照品溶液第1针色谱图中,哌嗪色谱峰拖尾因子在0.8~2.0之间,表明本方法系统适用性良好,可准确检测哌嗪含量。
2.2专属性
加标供试品溶液:分别取哌嗪、杂质3、杂质4、杂质9对照品及N-Boc哌嗪适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml溶剂中含约10mg N-Boc哌嗪、0.15mg哌嗪、0.02mg杂质1、0.03mg杂质2及0.05mg杂质3的溶液,作为加标供试品溶液。
按照本发明实施例1色谱条件,精密量取溶剂、加标供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见表3所示,加标供试品溶液色谱图如图3所示。
表3方法学验证-专属性结果
结论:稀释剂不干扰哌嗪的检测;加标供试品溶液中,哌嗪与相邻色谱峰最小分离度大于1.5,表明本方法专属性良好。
2.3检测限
检测限供试液:分别取哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml溶剂中含约1.5μg哌嗪的溶液,即得。
按照本发明实施例1色谱条件,精密量取检测限供试液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见表4。
表4方法学验证-检测限结果
结论:杂质哌嗪信噪比大于3,检测限浓度为1.5050μg/ml,本方法灵敏度良好。
2.4定量限
定量限供试液:分别取哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml溶剂中含约5μg哌嗪的溶液,即得。
按照本发明实施例1色谱条件,精密量取定量限供试液,注入高效液相色谱仪,连续进样6针,记录色谱图,结果见表5。
表5方法学验证-定量限结果
结论:哌嗪信噪比均大于10,定量限浓度为5.0165μg/ml,峰面积的RSD为4.9%,本方法的灵敏度良好。
2.5线性与范围
线性供试液L1~L6:分别取哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml溶剂中含约5μg/30μg/75μg/150μg/225μg/300μg哌嗪的溶液,即得。
按照本发明实施例1色谱条件,精密量取各水平线性供试液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见表6。
表6方法学验证-线性结果
结论:哌嗪在5.0165μg/ml~300.9912μg/ml范围内,相关系数r为0.9999,大于0.99,浓度与峰面积线性关系良好。
5.6准确度
50%回收率供试液:取N-Boc哌嗪及哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约10mgN-Boc哌嗪、75μg哌嗪的溶液,同法配制3份。
100%回收率供试液:取N-Boc哌嗪及哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约10mgN-Boc哌嗪、150μg哌嗪的溶液,同法配制3份。
150%回收率供试液:取N-Boc哌嗪及哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml稀释剂中含约10mgN-Boc哌嗪、225μg哌嗪的溶液,同法配制3份。
按照本发明实施例1色谱条件,精密量取对照品溶液、供试品溶液和各水平回收率供试液,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见表7。
表7方法学验证-回收率结果
结论:哌嗪回收率单值及均值在90%-108%之间,RSD小于2.0%,表明本方法准确度良好。
2.7精密度
重复性供试液:取N-Boc哌嗪及哌嗪对照品适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml溶剂中含约10mg N-Boc哌嗪、150μg哌嗪的溶液,同法配制6份。
按照本发明实施例1色谱条件,精密量取对照品溶液,重复性供试液,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见表8。
表8杂质哌嗪方法学验证-重复性结果
结论:6份重复性供试液中杂质哌嗪含量的RSD小于2.0%,符合可接受标准,表明本方法精密度良好。
2.8耐用性
2.8.1溶液稳定性
杂质哌嗪对照品贮备液:取杂质哌嗪对照品约30mg,精密称定,置20ml量瓶中,用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
加标供试品溶液:分别取哌嗪对照品及N-Boc哌嗪适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml溶剂中含约10mg N-Boc哌嗪、0.15mg哌嗪的溶液,作为加标供试品溶液。
按照本发明实施例1色谱条件,取上述加标供试液于室温条件下放置,分别于适宜时间点精密量取各溶液,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,考察各溶液24h内溶液稳定性,结果见表9。
表9方法学验证-溶液稳定性结果
结论:加标供试液室温放置24h,哌嗪峰面积与0时比值在0.90~1.08之间,表明供试品溶液室温放置24h内稳定性良好。
2.8.2色谱条件耐用性
加标供试品溶液:分别取哌嗪对照品及N-Boc哌嗪适量,精密称定,用溶剂溶解并稀释制成每1ml溶剂中含约10mg N-Boc哌嗪、0.15mg哌嗪的溶液,作为加标供试品溶液。
精密量取溶剂、灵敏度溶液、对照品溶液、加标供试品溶液,分别依次在实施例1色谱条件、在实施例1色谱条件基础上分别调整柱温(30℃、40℃)、流速(0.8ml/min、1.2ml/min)及更换不同品牌色谱柱条件下进样,记录色谱图,结果见表10,不同流速下相同加标供试品溶液的色谱图对比如图4所示,不同柱温下相同加标供试品溶液的色谱图对比如图5所示,不同色谱柱条件下相同加标供试品溶液的色谱图对比如图6所示。
表10方法学验证-色谱条件耐用性结果
注:
柱①为色谱柱1:Waters XBridge(150×4.6mm 5μm),
柱②为色谱柱2:Agilent ZORBAX Extend C18(150×4.6mm 5μm)
结论:适量调整各色谱条件,本方法系统适用性均良好,加标供试品溶液色谱图中,哌嗪与相邻峰分离度均大于1.5;加标供试品溶液中哌嗪含量与正常色谱条件差值的绝对值为0.00%~0.02%,小于0.05%,表明本方法色谱条件耐用性良好。
实施例3:流动相不同pH值对于检测结果的影响试验
流动相中磷酸盐缓冲液调节不同的pH值,其他色谱条件按照实施例1中条件设定,采用相同的样品进行灵敏度、方法学验证试验,结果如表11所示,色谱图如图7所示:
表11流动相不同pH值对于检测结果的影响试验
结论:pH=6.2时,方法的灵敏度下降,灵敏度溶液、对照品溶液及加标供试品溶液中哌嗪未检出。pH=7.8时,哌嗪在本方法色谱条件下无保留,哌嗪未检出。
当流动相pH过高时,哌嗪无保留;流动相pH低于6.4时,方法的灵敏度下降,最终流动相pH选择6.4~6.6,6.5最优。通过色谱柱筛选及洗脱梯度调整,消除了溶剂、N-Boc哌嗪及其他杂质对哌嗪测定的干扰,最终实现了采用常规的高效液相色谱法(紫外检测器)和C18色谱柱对哌嗪的含量测定。
综上所述,本方法根据质量源于设计(QbD)理念对色谱柱、流动相、洗脱梯度、波长等进行了系统的筛选,并进行了系统的分析方法学验证。本方法实现了在伏硫西汀起始物料N-Boc-哌嗪中对杂质哌嗪的监控,使后续的杂质传递研究和工艺参数优化更为科学,为控制成品伏硫西汀的质量提供了有效保障。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,采用高效液相色谱法,其特征在于,色谱条件包括:色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,所述色谱柱规格为4.6×100mm,5μm;检测波长为205nm,以磷酸盐缓冲液为流动相A,乙腈为流动相B;采用紫外检测器;流动相A中所述磷酸盐缓冲液配制方法为:取1-辛烷磺酸钠2.16g,磷酸二氢钾2.72g,加水1000ml使溶解,调节pH值为6.4~6.6;
流动相采用如下梯度程序洗脱:在0~8分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持80~90:10~20不变;在8.0~8.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由80~90:10~20线性渐变至30:70;在8.1~23分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变;在23~23.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由30:70线性渐变至80~90:10~20;在23.1~40分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持80~90:10~20不变,即为色谱柱平衡时间;
柱温选自30~40℃;
流动相流速选自0.8~1.2ml/min。
2.根据权利要求1所述的N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至6.5。
3.根据权利要求1所述的N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,其特征在于,所述色谱柱选自:Waters XBridge C18,4.6×100mm,5μm;或Agilent ZORBAX Extend C18,4.6×100mm,5μm。
4.根据权利要求1所述的N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,其特征在于,柱温为35℃。
5.根据权利要求1所述的N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,其特征在于,流动相流速为1.0ml/min。
6.根据权利要求1所述的N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,其特征在于,采用乙腈-水溶液作为溶剂配制对照品溶液及供试品溶液。
7.根据权利要求1所述的N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,其特征在于,洗脱梯度为:
在0~8分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变;在8.0~8.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由85:15线性渐变至30:70;在8.1~23分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变;在23~23.1分钟内,流动相A和流动相B的体积比由30:70线性渐变至85:15;在23.1~40分钟内,流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变,即为色谱柱平衡时间。
8.根据权利要求1所述的N-Boc-哌嗪中有关物质哌嗪的检测方法,其特征在于,采用乙腈-水=50:50作为溶剂配制对照品溶液及供试品溶液,哌嗪对照品溶液浓度为0.1mg/ml,N-Boc-哌嗪供试品溶液浓度为10mg/ml。
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