CN113075336A - 一种阿魏酸哌嗪有关物质的rt-hplc检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，公开了一种阿魏酸哌嗪有关物质的RT‑HPLC检测方法，它包括：配置分析溶液；使用反相色谱柱，以酸或酸及羧酸盐水溶液‑有机相的混合液为流动相，采用梯度洗脱方法；将配置好的分析溶液上机测定。本发明分析方法能够有效且准确的测定阿魏酸哌嗪中各种相关杂质，从而确保产品的质量可控。

Description

一种阿魏酸哌嗪有关物质的RT-HPLC检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种阿魏酸哌嗪有关物质的反向高效液相色谱检测方法。
背景技术
在药物分析中所称的“有关物质(related substances)”是指在原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质，也可能是制剂在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。有关物质的种类与药物的合成路线和制剂工艺密切相关，药物在合成和制剂过程中的任何一个因素的改变都可能导致其有关物质的种类不同，因而有关物质的检测和控制过程相对复杂。有关物质的检测是控制药品质量的重要指标。
阿魏酸哌嗪，化学名为3-甲氧基-4-羟基桂皮酸哌嗪，其结构式如下：
Figure BDA0002876516460000011
在临床上，阿魏酸哌嗪对心血管疾病有较好的疗效，能增加冠脉流量，改善心肌缺血，缓解血管痉挛，延长凝血时间及抗血小板凝集。阿魏酸哌嗪主要用于各种肾病的治疗，如慢性肾炎、肾病综合征和早期尿毒症等。临床疗效表明，阿魏酸哌嗪可减少慢性肾小球疾病患者的尿蛋白，升高血浆蛋白，降低血尿素氮和肌酐水平，可降低全血黏度及血浆黏度，改善血液流变学，促进肾脏微循环，有助于提高机体的免疫功能，延缓肾脏疾病的发展。
阿魏酸哌嗪有关物质如下：杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I、杂质J；其中杂质F为阿魏酸哌嗪的起始物料；杂质A是阿魏酸顺式异构体，也是光降解杂质；杂质I为阿魏酸哌嗪高温降解杂质；其他杂质均为工艺杂质，上述杂质结构见表1。
表1阿魏酸哌嗪各杂质名称及结构
Figure BDA0002876516460000012
Figure BDA0002876516460000021
中国药典已公开的关于阿魏酸哌嗪的药品标准中采用薄层色谱法，灵敏度低，限度范围宽松，而并未规定特定杂质；欧洲药典、美国药典和日本药典均未收载阿魏酸哌嗪标准。
在文献《HPLC法测定阿魏酸哌嗪的有关物质》中，采用乙酸水溶液-甲醇-乙腈三相梯度洗脱；检测波长为286nm；其中研究了顺式阿魏酸的检测。该方法对仪器要求较高，需要四元液相进行梯度洗脱；特定杂质研究不过充分，仅对顺式阿魏酸进行控制。
在文献《阿魏酸哌嗪片的含量和有关物质的测定》中，采用1％乙酸溶液-甲醇(70:30)为流动相，等度洗脱，检测波长为322nm。该方法的有点是，操作简单，对仪器要求不高，方法不仅可以测定含量，也可以测定有关物质；缺点是该方法重在含量测定，并未对特定杂质进行研究，且检测方法灵敏度不高。
在文献《高效液相方法测定阿魏酸哌嗪片的含量》中，采用水-甲醇(60:40)为流动相，等度洗脱，检测波长为310nm。该方法仅是含量测定方法，无法用以测定有关物质。
已经报道的阿魏酸哌嗪的分析方法未能对阿魏酸哌嗪合成工艺中产生的杂质和降解杂质进行充分的研究，均不能有效测定上述的包括顺式异构体在内的8个特定杂质。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种阿魏酸哌嗪有关物质的RT-HPLC检测方法，通过用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，调整适当的洗脱梯度，解决了阿魏酸哌嗪特征峰与其异构体、高温降解杂质和工艺杂质特征峰分离的问题，实现了对阿魏酸哌嗪原料药质量的控制，且此方法灵敏度高，专属性强，操作简单。
本发明的阿魏酸哌嗪有关物质RT-HPLC的检测方法，包括以下步骤：
a)配置分析溶液；
b)色谱条件；
c)色谱柱为反相色谱柱，以水-有机相-酸组合的混合溶液为流动相A或者羧酸及羧酸盐水溶液-有机相组成的混合溶液为流动相A，所述流动相A中酸或羧酸及羧酸盐水溶液浓度范围为0.005mol/L～0.025mol/L，所述水相体积比为50-90％；水-有机相-酸组合的混合溶液为流动相B或者羧酸及羧酸盐水溶液-有机相组成的混合溶液为流动相B，所述流动相B中酸酸或羧酸及羧酸盐水溶液浓度范围为0.002mol/L～0.025mol/L，所述水相体积比为10-50％；采用梯度洗脱方法，所述梯度洗脱方法流动相A体积比例按0min、36～44min、56～64min、68～72min、73～77min、78～80min、81～83min、87～93min时间点，A相占流动相的体积比为95-85％、95-85％、55-65％、55-65％、5-15％、5-15％、95-85％、95-85％进行梯度洗脱；
d)上机测定；
取步骤a)制成的分析溶液20-100μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。
优选方案，所述步骤a)样品分析溶液配制遵循以下要求：用甲醇-水-酸、甲醇-水-酸铵盐水溶液、乙腈-水-酸、乙腈-水-酸铵盐水溶液混合溶液溶解样品，制成分析溶液。
所述步骤b)色谱条件中，设定高效液相流速为0.8-1.2ml/min；柱温为25-50℃，采用检测波长为220-300nm紫外检测器；
在一些实施例中，所述反相色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
在一些实施例中，所述反相色谱柱的规格为：柱长介于100mm至300mm，色谱柱内径介于1mm至10mm，粒径介于1μm至10μm，优选为规格为4.6mm×250mm，5μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
在一些实施例中，所述流动相A或B中，所述酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、冰醋酸、磷酸中的一种或多种；所述羧酸及羧酸盐选自甲酸及甲酸铵盐、乙酸及乙酸铵盐、乙酸及乙酸钠。
在一些实施例中，所述流动相A或B中所述有机相为甲醇或乙腈，优选甲醇。
在一些实施例中，所述A相为水-甲醇-乙酸，所述水-甲醇-乙酸体积比优选为90:10:1.2～70:30:0.8，更为优选体积比为80:20:0.1。所述B相为水-甲醇-乙酸，所述水-甲醇-乙酸体积比优选为10:90:1.2～30:70:0.8，更为优选体积比为20:80:0.1。
具体的优选方案为：
步骤a)用甲醇-水-酸混合液溶解样品，制成分析溶液，所述的甲醇-水-酸混合液溶液中有机相体积百分比小于50％；
步骤b)所述梯度洗脱条件为反相色谱柱为柱长250mm、直径4.6mm、填料粒径5μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为以水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相、流动相中A相比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
步骤c)取步骤a)制成的分析溶液注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱。
在一些实施例中，所述样品为阿魏酸哌嗪或其相关制剂。所述阿魏酸哌嗪相关制剂为片剂。
上述方法分析可用于分离样品中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I、杂质J和阿魏酸哌嗪。
本发明能够有效的测定阿魏酸哌嗪溶液中各种相关杂质的存在，尤其实现了谱图中阿魏酸哌嗪特征峰与阿魏酸哌嗪顺式异构体特征峰及其相关起始物料、工艺杂质和高温降解杂质特征峰的分离。各个杂质的分离度均大于1.5，其中阿魏酸哌嗪与其顺式异构体分离度达到2.0，理论塔板数均在5000以上。
本发明的分析方法专属性强，各降解条件下，杂质与主成分间分离度良好，杂质与杂质间分离度符合要求，物料均守恒。
本发明的方法耐用性强，不会增加操控难度。色谱条件在柱温、流速、波长等发生微小变化时，各组分间分离度均大于1.5，符合要求；杂质含量无明显变化。样品重复进样，实验结果重复性良好。
本发明的方法能够准确计算各杂质的含量，采用杂质外标法和自身对照法测定，各杂质回收率均在90.0％～108.0％范围内。
上述方法的检测可以确保产品的质量可控，本发明方法可将各杂质有效分离，检测专属性、灵敏度和准确性均良好；方法操作简单，对仪器要求不高。
附图说明
图1、实施例1流动相条件的色谱图；
图2、实施例2流动相条件的色谱图；
图3、实施例3梯度洗涤的色谱图；
图4、实施例4梯度洗涤的色谱图；
图5、实施例5梯度洗涤的色谱图；
图6、实施例6梯度洗涤的色谱图；
图7、实施例7梯度洗涤的色谱图；
图8、实施例8梯度洗涤的色谱图；
图9、实施例9梯度洗涤的色谱图；
图10、实施例10梯度洗涤的色谱图；
图11、实施例11梯度洗涤的色谱图；
图12、实施例12梯度洗涤的色谱图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
配置0.01M醋酸钠溶液-甲醇(80:20)为A相，以0.01M醋酸钠溶液-甲醇(20:80)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、71、80min时间点，A相体积比为90％、90％、20％、20％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[0.01M醋酸盐溶液-甲醇(60:40)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1和表2，可以看出该条件下杂质B峰和杂质I峰完全重合。
表2实施例1色谱结果表
Figure BDA0002876516460000061
实施例2
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、15、25、26、35min时间点，A相体积比为50％、40％、40％、50％、50％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图2和表3，可以看出该条件下阿魏酸哌嗪主峰和其顺式异构体杂质A峰仍未能完全基线分离。
表3实施例2色谱结果表
Figure BDA0002876516460000071
实施例3
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、71、80min时间点，A相体积比为90％、90％、40％、40％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图3及表4所示，可以看出该条件下杂质I和杂质B分离度仅为1.15。
表4实施例3色谱结果表
Figure BDA0002876516460000072
实施例4
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、71、80min时间点，A相体积比为90％、90％、50％、50％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图4及表5所示，杂质E未被洗脱出来。
表5实施例4色谱结果表
Figure BDA0002876516460000081
实施例5
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图5及表6所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表6实施例5色谱结果表
Figure BDA0002876516460000091
实施例6
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-甲醇-甲酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-甲酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图6及表7所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表7实施例6色谱结果表
Figure BDA0002876516460000092
Figure BDA0002876516460000101
实施例7
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置0.01M醋酸钠-甲醇(80:20)为A相，以0.01M醋酸钠-甲醇(20：80)为B相，流动相中A相的比例按0、36、56、68、73、78、81、93min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温40℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图7及表8所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表8实施例7色谱结果表
Figure BDA0002876516460000102
实施例8
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为95％、95％、65％、65％、15％、15％、95％、95％进行梯度洗脱，流速0.9ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图8及表9所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表9实施例8色谱结果表
Figure BDA0002876516460000111
实施例9
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为85％、85％、55％、55％、5％、5％、85％、85％进行梯度洗脱，流速1.1ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图9及表10所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表10实施例9色谱结果表
Figure BDA0002876516460000121
实施例10
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置水-乙腈-乙酸(90:10:0.1)为A相，以水-乙腈-乙酸(10:90:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图10及表11所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表11实施例10色谱结果表
Figure BDA0002876516460000122
Figure BDA0002876516460000131
实施例11
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置甲醇-水-乙酸(15:85:01)为A相，甲醇-水-乙酸(85:15:01)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图11及表12所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表12实施例11色谱结果表
Figure BDA0002876516460000132
实施例12
(1)仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；
色谱柱：Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱
配置乙腈-水-乙酸(25:75:0.1)为A相，乙腈-水-乙酸(25:75:0.1)为B相，流动相中A相的比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
(2)实验步骤
分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质I及杂质J对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪1.0mg、其他各杂质各含1.5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；
取上述分析溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图12及表13所示,阿魏酸与杂质A分离度大于1.5，阿魏酸理论塔板数大于5000，其他各杂质峰分离度均大于1.5。
表13实施例12色谱结果表
Figure BDA0002876516460000141

Claims (12)

1.一种阿魏酸哌嗪有关物质RT-HPLC的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)配置分析溶液；
b)色谱条件
c)色谱柱为反相色谱柱，以水-有机相-酸组合的混合溶液为流动相A或者羧酸及羧酸盐水溶液-有机相组成的混合溶液为流动相A，所述流动相A中酸或羧酸及羧酸盐水溶液浓度范围为0.005mol/L～0.025mol/L，所述水相体积比为50-90％；水-有机相-酸组合的混合溶液为流动相B或者羧酸及羧酸盐水溶液-有机相组成的混合溶液为流动相B，所述流动相B中酸酸或羧酸及羧酸盐水溶液浓度范围为0.002mol/L～0.025mol/L，所述水相体积比为10-50％；采用梯度洗脱方法，所述梯度洗脱方法流动相A体积比例按0min、36～44min、56～64min、68～72min、73～77min、78～80min、81～83min、87～93min时间点，A相占流动相的体积比为95-85％、95-85％、55-65％、55-65％、5-15％、5-15％、95-85％、95-85％进行梯度洗脱；
d)上机测定：取步骤a)制成的分析溶液20-100μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述A相为水-甲醇-乙酸，所述水-甲醇-乙酸体积比优选为90:10:1.2～70:30:0.8；所述B相为水-甲醇-乙酸，所述水-甲醇-乙酸体积比优选为10:90:1.2～30:70:0.8。
3.根据权利要求2所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述A相为水-甲醇-乙酸体积比为80:20:0.1；所述B相为水-甲醇-乙酸体积比为20:80:0.1。
4.根据权利要求1或2所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述流动相A或B中所述有机相为甲醇或乙腈。
5.根据权利要求1或2所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、冰醋酸、磷酸中的一种或多种；所述羧酸及羧酸盐选自甲酸及甲酸铵盐、乙酸及乙酸铵盐、乙酸及乙酸钠。
6.根据权利要求1所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述步骤a)样品分析溶液配制遵循以下要求：用甲醇-水-酸、甲醇-水-酸铵盐水溶液、乙腈-水-酸、乙腈-水-酸铵盐水溶液混合溶液溶解样品，制成分析溶液。
7.根据权利要求1所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述步骤b)色谱条件中，设定高效液相流速为0.8-1.2ml/min；柱温为25-50℃，采用检测波长为220-300nm紫外检测器。
8.根据权利要求1所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述反相色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
9.根据权利要求8所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为：柱长介于100mm至300mm，色谱柱内径介于1mm至10mm，粒径介于1μm至10μm。
10.根据权利要求1所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，
步骤a)：用甲醇-水-酸混合液溶解样品，制成分析溶液，所述的甲醇-水-酸混合液溶液中有机相体积百分比小于50％；
步骤b)：所述梯度洗脱条件为反相色谱柱为柱长250mm、直径4.6mm、填料粒径5μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为以水-甲醇-乙酸体积比80:20:0.1为A相，以水-甲醇-乙酸体积比20:80:0.1为B相、流动相中A相比例按0、40、60、70、75、80、81、90min时间点，A相体积比为90％、90％、60％、60％、10％、10％、90％、90％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长287nm；
步骤c)：取步骤a)制成的分析溶液注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱。
11.权利要求1-10任一项方法的用途，其特征在于，用于检测阿魏酸哌嗪原料药或阿魏酸哌嗪的制剂产品。
12.权利要求1-10任一项方法的用途，其特征在于，用于分离样品中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质J、杂质I和阿魏酸哌嗪。
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