CN110007045B - 一种利用rp-hplc测定非甾体类抗雄性激素化合物g含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种反相高效液相色谱法测定非甾体类抗雄性激素化合物G含量的方法，属分析化学的仪器分析领域。该方法确定了反相高效液相色谱法测定非甾体类抗雄性激素化合物G含量的最佳条件：C18(4.6×250mm，5μm)，流动相为乙腈：质量百分含量0.02%甲酸水溶液=51：49，使用DAD检测器检测，最大检测波长为270 nm。本发明检测方法中样品浓度与峰面积线性关系好、准确性高、具有良好的重现性和稳定性。测定非甾体类抗雄性激素化合物G的线性范围为0.10μg/mL～100μg/mL，线性相关系R=1，重复实验RSD=0.11%，稳定实验RSD=0.16%。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗前列腺癌活性的新型非甾体类抗雄激素化合物含量的检测方法，具体涉及非甾体类抗雄性激素化合物G的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)含量测定，属分析化学的仪器分析领域。
背景技术
在欧美发达国家，前列腺癌发病率高达2000/10万。前列腺癌已位居男性恶性肿瘤第六，而其致死率却排在第二，仅低于肺癌。截至目前，在临床上可以治疗晚期阶段前列腺癌的方法只有内分泌治疗。
内分泌治疗前列腺癌的四大类药物中的抗雄激素类药物以其使用更方便、更安全且副作用更小的特点而被广泛应用。但是抗雄激素药物中的甾体类有比较多的缺点，如选择性差、干扰性欲、心血管系统副作用等。而抗雄激素类药物中的非甾体类具有在受体水平拮抗雄激素的功能，抑制癌症肿瘤生长的特异性作用强，同时耐受性良好，而且患者服用后不会有任何类似甾体类抗雄激素药物的活性效应。
目前，市场上的非甾体类抗雄激素药物主要有比卡鲁胺、氟硝丁酞胺和氯硝基丁酰胺类的氟他胺、缓退瘤等。
但是，这些非甾体类抗雄激素药物在一些雄激素受体突变的细胞株中，经常会出现耐药性，甚至转变为激动剂，严重影响了其作为药物治疗前列腺癌的效果和周期，因此迫切需要设计开发新型的非甾体类抗雄激素药物。
本专利发明人团队通过研究，合成制备了一种新型的非甾体类抗雄性激素化合物G，其结构如下式所示。产品后期通过相关研究后有望开发成为治疗前列腺癌的一种新型的非甾体类抗雄性激素药物。
目前，针对合成的新型非甾体类抗雄性激素化合物G含量的测试方法还没见相关报道。非甾体类抗雄性激素化合物G的含量测试直接关系到其是否能够作为高纯度原料药的开发和应用。为此，对非甾体类抗雄性激素化合物G的含量进行检测分析，具有重要的研究、应用和参考价值。
非甾体类抗雄性激素化合物G结构式
发明内容
本发明的目的是提供一种线性关系好，测定准确性高、具有良好的重现性和稳定性的非甾体类抗雄性激素化合物G含量测试方法。
为达上述目的，本发明采用反相高效液相色谱法测定非甾体类抗雄性激素化合物G的含量。具体技术方案如下：
(1)非甾体类抗雄性激素化合物G溶液配制：称取非甾体类抗雄性激素化合物G，置于容量瓶中，加乙腈并超声溶解，最后定容至刻度线，配置成200μg/mL的溶液，用0.45μm有机滤膜过滤以备分析测试用；
(2)取配制的非甾体类抗雄性激素化合物G溶液再经0.2μm有机系针头滤器过滤后注入样品瓶中，放入液相色谱仪中，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定非甾体类抗雄性激素化合物G的含量，所用的液相色谱柱为C18，以乙腈和质量百分含量0.02％甲酸水溶液为流动相，流动相流速为0.8-1.2mL/min，优选1.0mL/min；进样量为1-20μL；优选5μL。测定非甾体类抗雄性激素化合物G的含量范围为0.10μg/mL～200μg/mL。
优选：所述色谱柱为C18(4.6×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
优选：所述流动相中乙腈与质量百分含量0.02％甲酸水溶液体积比为(65-45)：(35-55)，进一步优选51：49。
反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定条件优选：柱温为40℃，流速为1.0mL/min，进样体积为5μL，样品浓度为200μg/mL。DAD检测器，最大检测波长为270nm。在此优选的液相条件下，非甾体类抗雄性激素化合物G的保留时间t＝17.308min，与其相邻未知物化合物的保留时间t＝14.913min。
本发明优点：本发明确定了采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定非甾体类抗雄性激素化合物G含量的最佳条件，在此液相条件下，非甾体类抗雄性激素化合物G和与其相邻未知物化合物二者的分离度R＝4.18远大于1.5，达到完全基线分离；非甾体类抗雄性激素化合物G的色谱峰形良好，对称因子为1.01，含量为99.4％，见图1所示。经实验验证，非甾体类抗雄性激素化合物G含量测试方法线性关系好(R＝1)，测定准确性高，相对标准偏差为0.11％，具有良好的重现性和稳定性，稳定性相对标准偏差为0.16％。
附图说明
图1为非甾体类抗雄性激素化合物G液相色谱图；
图2为非甾体类抗雄性激素化合物G线性关系；
图3为非甾体类抗雄性激素化合物G工作曲线。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实施例1
色谱条件：
用Agilent 1290高效液相色谱仪，用C18色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)；
柱温：40℃；
检测器：DAD检测器，最大检测波长270nm；
流动相溶液：乙腈：质量百分含量0.02％甲酸水溶液＝51：49；
(1)非甾体类抗雄性激素化合物G溶液配制：精密称取2.0mg，置于10mL容量瓶中，加乙腈并超声使样品溶解，最后定容至刻度线，然后用0.45μm有机滤膜过滤以备分析测试用。
(2)取出0.5mL按上述方法配制的非甾体类抗雄性激素化合物G溶液，再经0.2μm有机系针头滤器过滤后注入2.0mL的样品瓶中，贴上标签，放入液相色谱仪中，进样量：5μL；流速：1.0mL/min，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定非甾体类抗雄性激素化合物G含量。结果显示，非甾体类抗雄性激素化合物G的保留时间t＝17.308min，与其相邻未知物化合物的保留时间t＝14.913min，二者的分离度R＝4.18远大于1.5，达到完全基线分离；非甾体类抗雄性激素化合物G的色谱峰形良好，对称因子为1.01，含量为99.4％，见图1所示。
本发明的方法学考察：
(1)线性关系考察
按上述方法配制的200μg/mL非甾体类抗雄性激素化合物G溶液，用乙腈稀释成100μg/mL，再经0.2μm有机系针头滤器过滤后注入2.0mL的样品瓶中，贴上标签，放入液相色谱仪中，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，如下所述的条件下依次进样1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，对进样量和峰面积进行数据回归，得线性方程为Y＝1724X-1.87(R2＝1)，分析得R＝1，可见本方法的线性关系很好，见图2。
其中，色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)；DAD检测器，检测波长为270nm；流动相溶液：乙腈：质量百分含量0.02％甲酸水溶液＝51：49；色谱柱温度：40℃；进样量：5μL；流速：1.0mL/min。
(2)线性范围考察
按上述配制200μg/mL的非甾体类抗雄性激素化合物G溶液，用乙腈分别稀释成0.1μg/mL，1.0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，再经0.2μm有机系针头滤器过滤后注入2.0mL的样品瓶中，贴上标签，放入液相色谱仪中。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，如下所述的色谱条件下进行检测，并依次记录相应的峰面积，以非甾体类抗雄性激素化合物G的峰面积(Y)为纵坐标，其浓度(X)为横坐标进行线性回归，得线性方程为Y＝86.20X-0.11(R2＝1)，即浓度在0.10μg/mL-100μg/mL范围内，非甾体类抗雄性激素化合物G的含量和峰面积呈良好的线性关系，见图3所示。
其中，色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)；DAD检测器，最大检测波长为270nm；流动相溶液：乙腈：质量百分含量0.02％甲酸水溶液＝51：49；色谱柱温度：40℃；进样量：5μL；流速：1.0mL/min。
(3)精密度考察
按上述配制200μg/mL的非甾体类抗雄性激素化合物G溶液，用乙腈稀释成100μg/mL，再经0.2μm有机系针头滤器过滤后注入2.0mL的样品瓶中，贴上标签，放入液相色谱仪中。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，如下所述的色谱条件下进行检测，重复进样6次，计算相对标准偏差RSD，详见表1。
表1测试100μg/mL非甾体类抗雄性激素化合物G溶液6次结果
结果表明：本发明测定非甾体类抗雄性激素化合物G含量的方法精密度高，重现性好，相对标准偏差RSD＝0.11％，见上表1所示。
其中，色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)；DAD检测器，最大检测波长为270nm；流动相溶液：乙腈：质量百分含量0.02％甲酸水溶液＝51：49；色谱柱温度：40℃；进样量：5μL；流速：1.0mL/min。
(4)溶液的稳定性考察
表2非甾体类抗雄性激素化合物G稳定性结果
按上述制备的200μg/mL非甾体类抗雄性激素化合物G溶液，用乙腈稀释成100μg/mL，再经0.2μm有机系针头滤器过滤后注入2.0mL的样品瓶中，贴上标签，放入液相色谱仪中，分别于不同时间进样。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，如下所述色谱条件进样，并记录24h内不同时间的峰面积，计算相对标准偏差RSD，详见表2。
结果表明：本发明测定非甾体类抗雄性激素化合物G溶液在24小时内的峰面积未见明显变化，稳定性良好，相对标准偏差RSD＝0.16％，见上表2所示。
其中，色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)；DAD检测器，最大检测波长为270nm；流动相溶液：乙腈：质量百分含量0.02％甲酸水溶液＝51：49；色谱柱温度：40℃；进样量：5μL；流速：1.0mL/min。
Claims (2)
1.一种利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定非甾体类抗雄性激素化合物G含量的方法，其特征在于，通过如下方法实现：
（1）非甾体类抗雄性激素化合物G溶液的配制：称取非甾体类抗雄性激素化合物G，置于容量瓶中，加入乙腈溶剂并超声溶解，定容至刻度线，配置成 200 μg/mL的溶液，然后用0.45μm有机滤膜过滤以备分析测试用；
（2）取配制的非甾体类抗雄性激素化合物G溶液再经0.2μm有机系针头过滤器过滤后注入样品瓶中，放入液相色谱仪样品盘中，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定非甾体类抗雄性激素化合物G的含量，所用的液相色谱柱为C18，以乙腈和质量百分含量0.02%甲酸水溶液为流动相，测定非甾体类抗雄性激素化合物G的含量范围为0. 10 μg/mL～200 μg/mL；
所述非甾体类抗雄性激素化合物G结构式如下：
所述色谱柱为4.6×250mm，5μm的C18，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
所述流动相中乙腈与质量百分含量0.02%甲酸水溶液体积比为51：49；
反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定条件：柱温为40℃，流速为1. 0 mL/min，进样体积为5 μL，样品浓度为200 μg/mL；DAD检测器，最大检测波长为270 nm。
2.如权利要求1所述的利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定非甾体类抗雄性激素化合物G含量的方法，其特征在于，非甾体类抗雄性激素化合物G保留时间t=17.308 min，与其相邻未知物化合物的保留时间t=14.913min。
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