CN105891365B - 一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以效应为导向复杂环境样品中目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：样品前处理及初步分离；雄激素活性测试；致毒物质的高通量分离与制备；基于高效液相色谱–飞行时间质谱的活性组分扫描；雄激素干扰物目标性筛选；结合质谱、色谱和毒性特征的雄激素干扰物非目标性鉴别与毒物确认。本发明利用SPE柱和制备分离相串联的方法进行分离，将DMSO作保护剂优化高通量分离浓缩方法，利用目标数据库实现关键毒物目标性鉴别，基于高效液相色谱–飞行时间质谱谱库进行质谱特征鉴别、基于保留时间与化合物物化性质进行色谱特征鉴别、基于分子动力学模拟技术进行毒性特征鉴别，进而实现关键雄激素干扰物的非目标性识别与毒物确认。

Description

一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种以效应为导向的关键雄激素干扰物质的鉴别方法，更具体地说，涉及一种基于报告基因实验的毒性测试和复合污染环境样品分级分离的雄激素干扰物筛选、定性识别和定量确认的方法。
背景技术
随着社会经济的不断发展，在工农业生产及日常生活中，越来越多的化学物质被释放到环境中。由于污染物种类繁多，成分复杂，环境污染往往是由多种污染物相互作用共同引发的，因此依赖传统单一的化学分析方法逐个鉴别复合污染环境样品中的污染物难度大，并会消耗大量的时间和人力，很难进行完善的环境风险评价。而以毒性效应为导向的化学分析方法(Effect-directed Analysis,EDA)则将毒性效应和化学分析结合起来，可有效鉴别复合污染环境样品中的关键致毒物质。
内分泌干扰物是能对人类或野生动物的内分泌干扰系统产生影响的激素或化合物。它们通过摄入、积累等各种途径，类似于激素对生物体起作用，即使数量极少，也能让生物体的内分泌失衡，出现种种异常现象，因此环境样品中内分泌干扰物质的风险值得广泛关注。目前对于内分泌干扰物质的研究就主要集中在拟/抗雌激素活性物质，而对于雄激素活性的研究相对来说较为匮乏。雄激素活性物质可以在较低浓度下干扰生物正常内分泌调节过程，对发育和生殖功能产生不良影响，因而备受关注。目前也有很多研究表明雄激素在环境样品中尤其是在欧美地区是广泛检出的。
但是环境样品中污染物种类繁多，中间产物及副产物也很复杂，因此如何在有效应检出的复杂环境样品中鉴别出主要的致毒物质是极其重要的。
通过检索发现目前国内外文献还没有以效应为导向的基于制备色谱及凝胶排阻色谱分离以及高分辨质谱分析鉴别主要雄激素干扰物的报道，本方法以拟、抗雄激素活性效应为导向，利用固相萃取与制备色谱或凝胶排阻色谱相串联，结合保护液实现高通量分级分离，以目标性与非目标性相结合实现高分辨质谱分析，进而鉴别复合环境样品中雄激素干扰物质。
发明内容
1.发明要解决的技术问题
针对人们日益关注的复合污染的环境样品中关键内分泌干扰物质的提取、分离和筛选鉴别的问题，本发明提供了一种以雄激素活性效应为导向的复合污染环境样品中主要雄激素干扰物的鉴别方法，本发明包括环境样品的提取、高通量分离与制备、目标性和非目标性相结合的高分辨质谱的定性识别、筛选与确认，从而鉴别复合污染环境样品中的关键雄激素干扰物质，为复合污染环境的风险评价提供了科学依据。
2.技术方案
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：
(1)样品的提取：固态样品(如土壤、沉积物、灰尘及大气颗粒物等)干燥研磨过筛后利用加速溶剂萃取装置Dionex ASE350加速溶剂萃取仪来提取其中的有机物质，提取过程中先用二氯甲烷：正己烷＝1：1(体积比)的混合溶剂提取3轮并收集，再用纯甲醇溶剂提取3轮并分开收集；液态样品(如地表水和地下水等)经离心或过膜后利用HLB小柱富集液态样品中不同极性的污染物。
(2)固相萃取：固相萃取柱预先分别用10mL的正己烷、10mL的二氯甲烷和10mL的甲醇进行活化后，将加速溶剂萃取的提取液通过氨基柱与HLB小柱串联进行富集和净化，流速控制在1-2滴/秒。
(3)洗脱浓缩：氨基柱利用乙腈：甲苯＝3：1(体积比)洗脱；HLB小柱依次用10mL的甲醇：二氯甲烷＝1：1(体积比)的混合溶剂，10mL的二氯甲烷：正己烷＝4：1(体积比)的混合溶剂以及10mL的正己烷将物质从固相萃取柱上洗脱下来并收集，根据洗脱液的不同，有机提取物被分离成不同的初级组分，洗脱液经旋蒸、氮吹浓缩后定容于进样小瓶中。
(4)MDA-Kb2(人体乳腺癌细胞)细胞报告基因测试：取部分初级组分浓缩液替换溶剂为二甲基亚砜DMSO后，配制成7个不同的梯度，每组设置3个平行，用基于MDA-Kb2细胞的报告基因测试来检测样品的拟、抗雄激素活性。
(5)高通量分离与制备：可利用制备色谱或凝胶排阻色谱进行制备分离。利用制备色谱分离技术将有效应的初级组分基于物质极性及流出时间进行高通量分离制备，其参数如下：
制备色谱仪：沃特世制备纯化色谱仪(Waters AutoPurification HPLC)；
色谱柱：沃特世制备柱Waters XBridge C18制备柱，制备柱尺寸为19mm×150mm，粒径为5μm，流速：5mL/min；流动相：甲醇，水；收集方式：用15mL的玻璃管根据时间段进行收集。
流动相梯度：
利用凝胶排阻色谱将有效应的初级组分基于物质分子流体力学体积大小进行分离制备，其参数如下：
凝胶排阻色谱仪：J2Scientific,AccuPrep MPS；色谱柱填料：Bio-Beads S-X3；内径：3cm；长度：20cm；淋洗液：环己烷和乙酸乙酯(V：V＝1：1)；流速：5mL/min。用15mL的玻璃管根据时间段进行收集。
(6)分级分离的浓缩方法：对于制备色谱分离的组分最初采用直接氮吹的方式进行浓缩，但由于水和甲醇的混合体系不易浓缩，长时间氮吹导致整体回收率不足20％。本发明在浓缩过程中加入占最终定容体积20％的DMSO作为保护剂，有效提高了浓缩过程中的回收率。加入保护剂后次级组分中标准物质PAHs的回收率如图1所示。具体浓缩方式如下：
(7)分离次级组分的MDA-Kb2细胞报告基因测试：取部分分离次级组分的浓缩液，稀释成7个梯度，每组设置3个平行，用基于MDA-Kb2细胞的报告基因测试来检测次级组分的拟、抗雄激素活性。通过与标准抗雄激素物质氟他胺进行比对，利用Graphpad软件拟合，计算组分的EC50/IC20，从而计算出各组分的毒性当量TEQ。
(8)组分中化合物的定性识别：将有效应的次级组分通过高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-TOF)进行分析，得到精准的相对分子质量和二级质谱图，并通过与仪器本身的数据库及网络数据库Chemspider进行比对，得到可疑化合物清单。所述步骤(8)中仪器的参数条件如下：
高效液相色谱仪HPLC：安捷伦高效液相色谱仪(Agilent 1260)；
色谱柱：安捷伦色谱柱(Agilent C18柱，尺寸为2.1mm×150mm，粒径为2.5μm；)；柱温：30℃；流动相：乙腈，体积百分比为5％的乙腈水溶液；流速：300μL/min；流动相梯度：
质谱仪：Triple TOF 5600–AB ACIEX；离子源：ESI；电离模式：正离子模式和负离子模式；MS扫描范围：100-2000m/z；MSMS扫描范围：60-1250m/z；去簇电压：±80V；碰撞电压：±35±15eV。
(9)组分中可疑雄激素活性物质的目标性筛选：根据已有文献报道的21种拟雄激素活性物质和124种抗雄激素活性物质的数据库，建立包含化学品名称、CAS号、EC20、EC50、特征离子和LogKow等信息的典型拟、抗雄激素活性物质特征离子数据库(详见授权专利《水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法》，专利号：CN201310539205.2)。并同时基于采样点周围环境建立采样点中可能含有物质的可疑物质物化信息数据库。利用质谱谱图数据分析软件PeakView，通过XIC Manager导入目标性物质数据库典型拟、抗雄激素活性物质特征离子对数据库，通过设置峰强度Intensity>1000、信噪比S/N>10和同位素Cl，S，P等参数在样品峰中提取出与目标性物质数据库中物质一级质谱相匹配的一级质谱峰，随后通过比对提取峰对应的二级质谱和文献报道的目标物质已有的二级质谱中至少2个特征子离子是否匹配来鉴别是否为目标物质。
(10)组分中可疑雄激素活性物质的非目标性筛选：利用PeakView软件通过离子提取窗口(XIC)提取质谱峰精确的m/z得到一级质谱图，利用信息依赖检索(IDA)方式获得该物质的二级质谱图。基于得到的质谱信息，通过7条黄金法则，即通过限制元素种类、限制物质价态、不饱和度等基本化学信息筛选得到可能的分子式。利用信息依赖检索方式(IDA)获得该物质的二级质谱图，综合一级二级质谱和网络数据库Chemspider中的化学物质进行比对得到该分子式可能的化学结构。然后再依据色谱特征，基于制备色谱的保留时间和物质极性之间的关系：Log Kow＝0.11501tR-0.21618,r2＝0.9769预测组分中的物质极性范围，或基于凝胶排阻色谱中不同分子量的分子受到不同阻滞而在GPC柱子中流经的途径不同，分子量大的物质由于不能流进凝胶空隙中先流出，分子量小的物质则能够流进凝胶空隙而后流出，预测组分中物质的分子量范围。根据各组分的保留时间所对应的物质极性范围和分子量范围在可疑化合物清单中进行筛选，并查找文献将化合物的特征子离子与二级质谱匹配来进行确认。最后通过毒性特征，首先利用Chemoffice构建配体和受体的3D结构，对配体的结构进行优化，用Sybyl软件中的Surflex-Dock模块将受试小分子对接到AR-LBD的活性位点，接着采用Gromacs4.0分子模拟软件进行MD模拟，采用CHARMM27力场处理蛋白质受体和配体分子。在每个复合物体系外围加上基于TIP3P模型的球型水分子层，溶质同溶剂边缘的最小间距为加入钠离子或氯离子使体系处于电荷平衡状态。所有体系用steepest-descent方法进行能量优化，然后限制配体位置，通过40皮秒(ps)时间将温度从0K上升至300K。在一个大气压和300K条件下，平衡1纳秒(ns)。然后进行分子动力学模拟，其中电相互作用采用particle mesh Ewald(PME)方法进行计算，范德华力的截断值设为所有模拟进行20ns，步长设为2飞秒(fs)，每2ps保存一次。分子动力学模拟得到的数据也在GROMACS4.0中进行处理，观察H12重定位20ns内是否稳定，若稳定则具有雄激素干扰活性，从而筛选得到组分中的主要雄激素干扰物。
(11)毒物确认：针对筛选得到的主要雄激素干扰物，利用高效液相色谱串联质谱(LC-MSMS)进行定量，将毒物按照定量分析的浓度配置到原空白介质中并进行毒物提取与毒性测试，计算毒物的毒性贡献率，从而确认毒物。
3.有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下显著效果：
(1)本发明提供了一种有效降低样品复杂性并快速准确的鉴别目标/非目标性复合污染环境中雄激素干扰物的方法，通过固相液相萃取初步分离和制备色谱/凝胶排阻色谱分级分离相串联的分离方法将不同极性/分子量的化合物分开，有效减少样品分析的复杂性，利用DMSO作为保护剂优化高通量分离浓缩方法，利用目标数据库实现关键毒物的目标性鉴别，在此基础上基于高效液相色谱–飞行时间质谱谱库建立质谱特征鉴别方法、基于保留时间与化合物物化性质建立色谱特征鉴别方法、基于分子动力学模拟技术建立毒性特征鉴别方法，进而实现关键雄激素干扰物的非目标性识别与毒物确认。
(2)本发明的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，利用高分辨率的高效液相色谱-飞行时间质谱仪对有效应组分中的化合物进行定性识别，准确度高，信息量大。
(3)本发明的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，通过目标性与非目标性相结合的分析方式有效提高分析的效率及准确度，有效鉴别复杂环境样品中的关键雄激素效应物质。
附图说明
图1为制备组分浓缩优化方法回收率验证图；
图2为化工园敏感区土壤样品初步分离组分毒性测试结果图；
图3为土壤采样点制备分离组分毒性测试结果图；
图4为目标性筛选结果邻苯二甲酸酐(Phthalic anhydride)的一级及二级谱图，反映了样品中存在邻苯二甲酸酐；
图5为目标性筛选结果环己胺(Cyclohexylamine)的一级及二级谱图，反映了样品中存在环己胺；
图6为可能致毒结构的抗雄激素毒性预测结果图。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例的一种以效应为导向的目标/非目标性雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：
(1)样品的提取：利用加速溶剂萃取装置Dionex ASE350来提取土壤中的有机物质，提取过程中先用二氯甲烷和正己烷(1:1,v:v)的混合溶剂提取3轮并收集，再用纯甲醇溶剂提取3轮并分开收集。
(2)固相萃取：固相萃取柱预先分别用10mL的正己烷、10mL的二氯甲烷和10mL的甲醇进行活化后，将加速溶剂萃取的提取液通过固相萃取柱进行富集和净化，流速控制在1-2滴/秒。
(3)洗脱浓缩：依次用10mL的甲醇：二氯甲烷＝1：1的混合溶液，10mL的二氯甲烷：正己烷＝4：1的混合溶液以及10mL的正己烷将物质从固相萃取柱上洗脱下来并收集，洗脱液经旋蒸、氮吹浓缩后定容于进样小瓶中。根据洗脱液的不同，有机提取物被初步分成4个组分，4个组分按极性的从大到小命名为组分0，1，2和3。
(4)MDA-Kb2细胞报告基因测试：取部分浓缩液替换溶剂为二甲基亚砜DMSO后，配制成7个不同的梯度，并设置3个平行，用基于MDA-Kb2细胞的报告基因测试来检测样品的拟、抗雄激素活性。各初步分离组分的毒性实验结果如图2。
(5)高通量分离与制备：利用制备色谱分离技术将有效应的初级组分基于物质极性及流出时间进行制备分离，其参数如下：
制备色谱仪：沃特世制备纯化色谱仪(Waters AutoPurification HPLC)；
色谱柱：沃特世制备柱Waters XBridge C18制备柱，制备柱尺寸为19mm×150mm，粒径为5μm，流速：5mL/min；流动相：甲醇，水；收集方式：用15mL的玻璃管根据时间段进行收集。
流动相梯度：
时间(min) 甲醇百分含量(％) 水百分含量(％)
0 50 50
50 100 0
65 100 0
收集方法如下：
(6)分级分离的浓缩方法：浓缩时加入最终定容体积20％的DMSO作为保护剂可有效提高浓缩过程的回收率。具体优化后的浓缩方法如下：
(7)分离次级组分的MDA-Kb2细胞报告基因测试：取部分分离次级组分的浓缩液，稀释成7个梯度，每组设置3个平行，用基于MDA-Kb2细胞的报告基因测试来检测次级组分的拟、抗雄激素活性。通过与标准抗雄激素物质氟他胺进行比对，利用Graphpad软件拟合，计算组分的IC20，从而计算出各组分的毒性当量TEQ。化工园敏感区土壤提取物分离组分毒性结果如图3。
(8)初级组分2中次级组分23中化合物的定性识别：将效应最强的次级组分23通过高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-TOF)进行分析，得到一、二级质谱图，并通过与仪器本身的数据库及网络数据库Chemspider进行比对，得到可疑化合物清单。所述步骤(8)中仪器的参数条件如下：
高效液相色谱仪HPLC：安捷伦高效液相色谱仪(Agilent 1260)；
色谱柱：安捷伦色谱柱(Agilent C18柱，尺寸为2.1mm×150mm，粒径为2.5μm；)；柱温：30℃；流动相：乙腈，体积百分比为5％的乙腈水溶液；流速：300μL/min；流动相梯度：
时间(min) 水百分含量(％) 乙腈百分含量(％)
0 100 0
1 100 0
15 50 50
25 0 100
30 0 100
30.5 100 0
40 100 0
质谱仪：Triple TOF 5600–AB ACIEX；离子源：ESI；电离模式：正离子模式和负离子模式；MS扫描范围：100-2000m/z；MSMS扫描范围：60-1250m/z；去簇电压：±80V；碰撞电压：±35±15eV。
(9)次级组分23中可疑雄激素活性物质的目标性筛选：建立已有文献报道的21种拟雄激素活性物质和124种抗雄激素活性物质的包含化学品名称、CAS号、EC20、EC50、特征离子和LogKow等信息的典型拟、抗雄激素活性物质特征离子数据库。以及针对化工园登记的235种化学品生产原料和166种相关化工产品，建立包括化学品名称、CAS号、分子式、相对分子质量、电离方式、母离子、特征离子对、LogKow及其类别信息在内的化工园登记化学品基本物化信息数据库。利用质谱谱图数据分析软件PeakView，通过XIC Manager导入目标性物质数据库典型拟、抗雄激素活性物质特征离子对数据库和化工园登记化学品基本物化信息数据库，通过设置峰强度Intensity>1000、信噪比S/N>10和同位素Cl，S，P等参数在样品峰中提取出与546种目标性物质中一级质谱相匹配的质谱峰，随后通过查阅文献或预测分子结构断裂方式，比对提取峰对应的二级质谱和目标物质已有的二级质谱中至少两个特征子离子是否匹配来鉴别是否为目标物质。目标性筛选结果如图4、图5。
(10)次级组分23中可疑雄激素活性物质的非目标性筛选：利用PeakView软件通过离子提取窗口(XIC)提取精确的m/z得到一级质谱图，通过7条黄金法则，即限制元素种类、元素比及不饱和度等筛选得到分子式C16H35N，利用信息依赖检索方式(IDA)获得该物质的二级质谱图，综合一级二级质谱和网络数据库Chemspider中的化学物质进行比对得到26种可疑化合物清单，基于色谱的保留时间和物质极性之间的线性关系：LogKow＝0.11501tR-0.21618，计算得到该次级组分23对应的物质Log Kow的范围为：1.16-1.28。根据物质的极性范围在可疑化合物清单中进行筛选，再通过二级质谱和文献查找的可疑化合物的至少两个特征子离子是否匹配进一步筛选，26种可能的分子结构被筛选到4种，筛选结果如下：
最后通过毒性特征，首先利用Chemoffice构建配体和受体的3D结构，对配体的结构进行优化，用Sybyl软件中的Surflex-Dock模块将受试小分子对接到AR-LBD的活性位点，接着采用Gromacs4.0分子模拟软件进行MD模拟，采用CHARMM27力场处理蛋白质受体和配体分子。在每个复合物体系外围加上基于TIP3P模型的球型水分子层，溶质同溶剂边缘的最小间距为加入钠离子或氯离子使体系处于电荷平衡状态。所有体系用steepest-descent方法进行能量优化，然后限制配体位置，通过40皮秒(ps)时间将温度从0K上升至300K。在一个大气压和300K条件下，平衡1纳秒(ns)。然后进行分子动力学模拟，其中电相互作用采用particle mesh Ewald(PME)方法进行计算，范德华力的截断值设为所有模拟进行20ns，步长设为2飞秒(fs)，每2ps保存一次。分子动力学模拟得到的数据也在GROMACS4.0中进行处理，其中邻苯二甲酸酐和二正辛胺的H12在20ns内达到稳定，说明具有抗雄激素干扰活性，其分子动力学的模拟结果如图6所示。
(11)毒物确认；购买标准样品，利用高效液相色谱串联质谱(LC-MSMS)进行定量验证，定量结果如下，将毒物按照定量分析的浓度配置到原空白介质中并进行毒物提取与毒性测试，计算毒物的毒性贡献率。

Claims (8)

1.一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其步骤为：
(1)样品的提取：固态样品干燥研磨过筛后利用加速溶剂萃取来提取其中的有机物质；液态样品经离心或过膜后利用固相萃取小柱实现不同极性污染物的同时富集；
(2)初步分离：基于固相萃取小柱，利用不同极性有机溶剂洗脱来进行初步分离；固态样品富集液利用氨基柱与HLB小柱串联进行富集和净化，液态样品利用HLB小柱进行富集和净化；
(3)雄激素活性测试：基于稳定转染的MDA-Kb2细胞系，测试拟、抗雄激素活性；
(4)高通量分离与制备：针对活性效应组分，基于物质极性利用制备色谱进行分级分离，或基于物质分子量大小利用凝胶排阻色谱分离，添加保护液后氮吹，制备获得次级组分；
(5)次级组分活性测试：针对步骤(4)所得组分，利用MDA-Kb2细胞系测试组分的拟、抗雄激素活性；
(6)活性次级组分中关键毒物定性识别：基于高效液相色谱-飞行时间质谱，进行扫描分析，得到一级及二级质谱；
(7)关键毒物目标性筛选：建立可疑雄激素活性物质数据库，导入目标毒物数据库，对目标物进行精确质量数计算和碎片分析，利用软件计算可能的碎裂方式及离子，比对一级和二级质谱来进行目标物质的筛选；
(8)活性组分的非目标物质筛选：结合获得的色谱特征、质谱特征和毒性特征筛选非目标性活性物质；
(9)毒物确认：购买标准品进行定量分析并测定EC50，计算毒物的毒性贡献率，将毒物按照定量分析的浓度配置到原空白介质中并进行毒物提取与毒性确认。
2.根据权利要求1所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(1)固态样品通过加速溶剂萃取的过程中使用的有机溶剂分别为二氯甲烷和正己烷的混合溶剂以及纯甲醇溶剂，二氯甲烷和正己烷的体积比为1:1，采用串联萃取两次并分别收集的方法；液态样品利用基于HLB小柱的固相萃取来实现不同极性污染物的同时富集。
3.根据权利要求1所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(2)中氨基柱利用体积比为3：1的乙腈、甲苯混合溶剂洗脱，HLB小柱依次利用10mL体积比为1:1的甲醇、二氯甲烷混合溶剂，10mL体积比为4:1的二氯甲烷、正己烷混合溶剂，以及10mL正己烷溶剂洗脱。
4.根据权利要求1所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(4)所述高通量分离与制备的参数设置如下：
凝胶渗透色谱：J2Scientific，AccuPrep MPS；色谱柱填料：Bio-Beads S-X3；内径：3cm；长度：20cm；淋洗液：体积比为1:1的环己烷和乙酸乙酯；流速：5mL/min；
制备色谱仪：Waters AutoPurification HPLC；色谱柱：Waters XBridge C18制备柱，制备柱尺寸为19mm×150mm，粒径为5μm，流速：5mL/min；流动相：甲醇，水。
5.根据权利要求4所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(4)采用二甲基亚砜作为氮吹浓缩体系的保护液，二甲基亚砜添加比例为最终定容体积的20％。
6.根据权利要求1所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(6)中的仪器参数如下：高效液相色谱仪HPLC：Agilent1260；色谱柱：Agilent C18柱，所述色谱柱尺寸为2.1mm×150mm，粒径为2.5μm；柱温：30℃；流动相：乙腈，体积百分比为5％的乙腈水溶液；流速：300μL/min；质谱仪：Triple TOF 5600–AB ACIEX；离子源：ESI；电离模式：正离子模式和负离子模式；MS扫描范围：100-2000m/z；MSMS扫描范围：60-1250m/z；去簇电压：±80V；碰撞电压：±35±15eV。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(7)中利用质谱谱图数据分析软件PeakView，通过XIC Manager导入目标毒物数据库，目标毒物数据库中包括物质的分子式，电离方式和母离子质量参数，通过设置峰强度Intensity>1000、信噪比S/N>10和同位素Cl，S，P参数，在样品峰中提取出与目标毒物数据库中物质一级质谱相匹配的一级质谱峰，随后通过比对提取峰对应的二级质谱和文献报道的目标物质已有的二级质谱中至少2个特征子离子是否匹配来鉴别是否为目标物质。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的一种以效应为导向的目标/非目标雄激素干扰物鉴别方法，其特征在于：步骤(8)中质谱特征是利用PeakView软件通过离子提取窗口XIC提取质谱峰精确的m/z得到一级质谱图，利用信息依赖检索方式获得该物质的二级质谱图，综合一级、二级质谱和网络数据库Chemspider中的化学物质进行比对得到可疑化合物清单；色谱特征是根据各组分保留时间与分子量范围之间的关系或者色谱保留时间与物质LogKow之间的关系：Log Kow＝0.11501tR-0.21618,r2＝0.9769在可疑化合物清单中进行筛选；毒性特征是指将所有可疑物质都进行对接，对于可以结合的物质进行进一步的分子动力学模拟，观察H12重定位20ns内是否稳定，若稳定则具有雄激素干扰活性，从而确定可疑毒物清单。
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