CN102741689B - 利用高分辨率质谱和药理学活性测试发现天然产物的药理学活性物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种从天然产物以高速发现药理学活性物质的方法，其包括：通过测试多个样品的药理学活性而获得活性图谱；获得基于通过质谱对所述样品进行分析得到的质谱图的质量图谱；以及通过比较和分析所述活性图谱和所述质量图谱来确定药理活性物质的分子量。通过对包含在天然产物的提取物样品中的各种组分进行高分辨率质谱，并与活性测试数据进行比较，所公开的方法使得能快速发现药理学活性物质。天然产物的药理学活性物质的活性的强度相关信息使得能有效利用天然产物。

Description

利用高分辨率质谱和药理学活性测试发现天然产物的药理学活性物质的方法
技术领域
本公开涉及一种从天然产物发现药理学活性物质的方法。 
背景技术
从植物资源获得的提取物包含大量的混合物，其中包含各种药理学活性物质。如从柳树获得的止痛剂阿司匹林和从紫杉获得的抗癌药物紫杉醇所示例的，植物提取物是药理学活性物质的丰富宝库。目前，从植物提取物发现药理学活性物质的最重要的两种方法为组分的分离和活性测试。为了分析植物提取物(其是非常复杂的混合物)，通过分级分离(fractionation)和分离来分离单独的组分以降低混合程度。然后，将得自每个分级分离步骤的部分(fraction)进行活性测试以选择具有最高活性的部分，然后将其进行分级分离和活性测试。重复该方法以发现有效组分。 
由于提取物的部分仍然是混合物，并且通过活性测试测试的是部分混合物的总体活性而非单独组分的活性，所以不能获得特定组分的信息，直至通过分级分离步骤完全分离出所述组分。因此，仅在费时耗力的分级分离、分离和纯化之后可以获得期望的物质。 
因此，对于通过提供有关混合物中单独组分的提取信息来减少发现期望的物质所需的时间和劳动存在需求。 
发明内容
技术问题 
本公开涉及提供一种从天然产物发现药理学活性物质的方法，其通过高分辨率质谱从多个样品中获得有关单独组分的信息而由此减少发现药理学活性物质所需的时间和努力。 
技术方案 
在一个方面，本公开提供一种从天然产物发现药理学活性物质的方法，其包括：通过测试多个样品的药理学活性而获得活性图谱(profile)；获得基于通过质谱对所述样品进行分析得到的质谱图的质量图谱；以及通过比较和分析所述活性图谱和所述质量图谱来确定药理活性物质的分子量。 
在另一方面，本公开提供一种从天然产物发现药理学活性物质的方法，其还包括：基于所述质量图谱来确定所述药理学活性物质的分子式。 
发明优势 
本公开的从天然产物发现药理学活性物质的方法的优势在于可以获得天然产物的提取物或其部分中有关药理学活性物质的信息，并且基于有关所述药理学活性物质的信息，通过设计更有效的分离方案可以快速分离期望的物质。 
此外，通过提供有关发现的活性物质的活性的强度信息，本公开使得能有效利用天然产物。 
附图说明
联合以下详细说明和随附的附图，所公开的示例性实施方案以上和其他的方面、特征和优势会更加明显，其中： 
图1示出黄芪(Astragalus membranaceus)提取物分级分离为多个部分； 
图2示出从部分的抗氧化活性测试制作的抗氧化活性图谱； 
图3示出通过高分辨率质谱对部分的组分进行分析而获得的质谱图及其放大的部分，显示出可以分析单独组分而无重叠信号； 
图4示出使用归一化测量值的主组分分析的结果(可见具有与活性图谱相似模式(pattern)的活性组分的分子量为285.076Da和286.076Da)；以及 
图5示出在相同图上直接比较和分析图2的抗氧化活性图谱和图3的质量图谱的结果。 
具体实施方式
以下参考随附的附图更详细地描述示例性实施方案，附图中示出了示例性的实施方案。但是，本公开可以体现为许多不同的形式，并且不应理 解为限制其中所述的示例性实施方案。相反地，提供这些示例性实施方案以使本公开将是详尽和完整的，并向本领域技术人员完全传达本公开的范围。在说明书中，可以省略公知的特征和技术细节以避免使本发明的实施方案不必要地含混不清。 
本文使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并不意图限制本公开。如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”还意图包括复数形式，除非文中另有明确说明。此外，术语“一个(a)”和“一个(an)”等的使用不表示数量限制，而表示存在至少一个的所述项目。术语“第一”、“第二”等的使用不隐含任何特定的次序，但它们意图表示单独要素。此外，术语“第一”、“第二”等的使用不表示任何次序或重要性，但术语“第一”、“第二”等用于区别一个要素与另一要素。还应当理解，当用于本说明书中时，术语“包括(comprise)”和/或“包括(comprising)”或者“包含(include)”和/或“包含(including)”指所述特征、范围、整数、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、范围、整数、步骤、操作、要素、组分和/或组合的存在或加入。 
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括科技术语)具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。还应当理解术语(如在常用辞典中定义的那些术语)应解释为具有与它们在相关领域和本公开的语境中的含义一致的含义，并且不应以理想或过于正式的含义理解，除非另有说明。 
在一个方面，本公开提供一种从天然产物发现药理学活性物质的方法，其包括：通过测试多个样品的药理学活性而获得活性图谱；获得基于通过质谱对所述样品进行分析得到的质谱图的质量图谱；以及通过比较和分析所述活性图谱和所述质量图谱来确定药理活性物质的分子量。 
样品可以是从其中可发现药理学活性物质的任何材料而没有特别的限制。 
在本公开的一实施方案中，样品可以为天然提取物或其混合物。天然提取物指天然产物的提取物。如本文使用，天然产物指天然存在而无人干扰的物质。天然提取物可以为天然产物的任何提取物而没有特别的限制。作为非限制性实例，它可以是植物提取物、动物提取物、微生物提取物或矿物提取物。 
在本公开的一实施方案中，样品可以是天然提取物的部分。由于天然提取物包含多种化合物，可以进行将提取物分级分离为多个部分的方法以发现活性组分。 
分级分离的方法可以是本领域常用的，并且没有特别限制。作为非限制性实例，可以使用选自色谱分离、基于溶解性差异的液-液分离、基于比重差异的分离、基于密度差异的离心、固相萃取和基于色差的分离中的一种或多种方法。 
通过本领域常用的色谱分离方法可以进行色谱分离，而没有特别的限制。作为非限制性实例，可以使用选自高效液相色谱(HPLC)、液相色谱、纸色谱、离子交换色谱、薄层色谱、分配色谱、亲和色谱、气相色谱、吸附色谱和凝胶渗透色谱中的一种或多种方法。 
在本公开的一实施方案中，当获得活性图谱时，药理学活性的测试可以包括定量生理学活性调节作用或者对疾病的预防或治疗作用。 
药理学活性指促进或抑制生物体的生物学功能的活性，并且药理学活性的调节指修正因调节性物质的缺陷或过度分泌而造成的异常病理学状况。在本公开中，药理学活性测试可以是能够定量生理学活性调节效果任意一种测试，而没有特别的限制。 
此外，药理学活性测试可以是能够定量对疾病的预防或治疗作用的任意一种测试，而没有包括疾病类型在内的特别限制。 
作为非限制性实例，药理学活性测试可以包括选自抗氧化活性测试、抗癌测试、抗炎症测试和抗菌测试中的一种或多种。 
在本公开的一实施方案中，活性图谱可以作为药理学活性测试的结果获得。 
在本公开的一实施方案中，质量图谱可以基于通过高分辨率质谱测量组分的分子量和丰度得到的质谱图获得。 
最不受周围环境变化影响的分子的最稳定性质是质量。因此，质谱最常用于分析复杂化合物的构成。质谱允许一次性分析天然提取物的构成。由于质谱信号的重叠，对于混合物样品可能难以精确分析，因此能够避免信号重叠的高分辨率质谱可以用于质谱。 
天然提取物或部分的高分辨率质谱测量不但允许测量单独组分的分子 量，还允许测量其在单质谱图上的相对含量。这称为部分的质量图谱。从质量图谱，可以测量每个部分中单独组分的含量。 
此外，在本发明的一实施方案中，通过从质量图谱和活性图谱的比较和分析确定药理学活性物质的分子量可以发现一种或多种药理学活性物质。 
从天然提取物发现的活性组分可以大量包含在显示出高活性的天然提取物中，并且可以少量包含在显示出低活性的天然提取物中。相似地，从天然提取物发现的活性组分可以大量包含在显示出高活性的部分中，并且可以少量包含在显示出低活性的部分中。也就是说，组分的质量图谱的形状(shape)与活性图谱的形状一致。同样，如果存在多种药理学活性组分，组分的质量图谱的形状与活性图谱的形状一致。 
可以通过本发明人新开发的相关系数的比较进行活性图谱和质量图谱的比较和分析。 
本发明人新设计的相关系数由式1表示： 
<式1> 
C j = &Sigma; i = 1 N ( a 0 k &times; m 0 kj )
其中 
j：当质谱图被分为给定质量间隔的段(bin)时的第j个m/z段； 
a0 k：第k个部分的归一化活性； 
m0 kj：在第j段中的第k个部分的质量峰的归一化强度；和 
N：部分的数目。 
通过将所述部分的活性除以所有部分的活性的平方的总和的平方根而获得归一化活性。如式2所示，通过将在第j段中的第k个部分的峰强度除以在第j段中的所有强度的平方的总和而获得所述质量峰的归一化强度。 
<式2> 
m0 kj=mkj/{(m1j)2+(m2j)2+(m3j)2+...+(mNj)2}1/2
当相关系数最大时，可以将相应的质量图谱段确定为显示与活性图谱的模式最相似的药理学活性组分。 
具体地，药理学活性物质的分子量可以通过比较如下的活性图谱和质 量图谱而确定。 
假设将从N个部分{f1,f2,f3,...,fN}中的第i个部分fi的质谱获得的质谱图以1Da的间隔，从100Da-2000Da分为1900段。在各段处的峰强度可以由{mi1,mi2,mi3，...,mi1900}表示，其中mij表示满足在第i个部分处m/z=(100+j)Da的质量峰的强度。 
将矢量Vj={m1j,m2j,m3j,...,mNj}(j=1,...,1900)定义为第j段的质量图谱的值。如式2所示，归一化1901个矢量{A,V1,V2,V3，...,V1900}(其中A={a1,a2,a3，...,aN})，使得Vj的最大值变为1，并且比较相关系数之后，将具有较高相关系数的质量段选择为显示出与所述活性更相似模式的质量段。 
确定所选质量段的药理学活性物质的分子量，所述质量段通过本发明人新开发的相关系数的比较来进行活性图谱和质量图谱的比较和分析而选择所述质量段。 
将根据本发明人新开发的相关系数的比较而定义的活性图谱矢量和质量段强度矢量的归一化矢量分别表示为A0={a0 1,a0 2,a0 3，...,a0 N}和V0 j={m0 1j，m0 2j，m0 3j，...，m0 Nj}。如果由式1定义A0和V0 j之间的相关系数，则将具有最大的Cj值的段j确定为显示出最相似模式的段。 
当通过比较和分析活性图谱和质量图谱而确定药理学活性物质的分子量时，利用聚类算法以及本发明人新开发的相关系数的比较，可以在具有相同分子量的部分中确定显示出与药理学活性图谱最相似的模式的质量图谱。 
作为非限制性实例，聚类算法可以包括主组分分析或支持矢量机。 
除了本发明人新开发的相关系数的比较之外，聚类算法如主组分分析或支持矢量机的使用可以改善分辨率并减少从天然产物发现有效的药理学活性物质的分析时间。将聚类算法应用于药理学活性和质量图谱矢量{A,V1,V2,V3,...,V1900}允许确定显示出与药理学活性矢量相似模式的质量图谱的组。 
在一实施方案中，本公开还可以包括基于质量图谱来确定药理学活性物质的分子式。 
由于高分辨率质谱允许精确测量，所以基于单独组分的分子量测量可 以确定分子式。 
由于质量图谱包括有关包含在天然提取物或部分中的多种化合物的分子量和含量的信息，所以基于从与活性图谱比较而获得的药理学活性物质的质量图谱的信息可以确定分子式。此外，可以提供允许鉴别化合物的重要信息。 
通过提供有关包含在天然产物中的药理学活性物质的活性的强度的信息，本公开使得可以有效利用天然产物。 
以下描述实施例和实验。以下的实施例和实验仅用于说明目的，并不意图限制本公开的范围。 
实施例
实施例1天然提取物分级分离为多部分 
将黄芪(200g)的乙醇提取物通过液相色谱分级分离为11个部分。固定相为填充在柱中的细C18颗粒，并且流动相为蒸馏水和乙醇。流动相组成的变化为：开始为100%蒸馏水，保持10分钟，100分钟内变为100%乙醇。每隔10分钟收集洗脱液而获得11个部分(图1)。 
实施例2活性图谱的制作 
进行1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)抗氧化活性测试以评价每个部分的抗氧化活性。清除自由基的抗氧化活性可以通过测量DPPH自由基清除活性进行评价。首先，向通过冷冻干燥11个部分而获得的提取物粉末加入50%乙醇以制备11个样品溶液(100μg/mL,1mL)。用乙醇将11个样品溶液稀释2倍后，向每个样品溶液加入60μM DPPH溶液(100μL)。等待30分钟后，通过利用UV吸收检测器，在517nm处测量吸光度来确定从每个样品溶液清除的DPPH的量。将绿原酸用作评价用的标准品。表1和图2中显示结果。 
表1 
  样品   浓度   抑制(%)   转化因子
  绿原酸   25μg/mL   93.5   122.5
  部分1   稀释2倍   3.87   5.1
  部分2   稀释2倍   1.526   2.0
  部分3   稀释2倍   3.252   4.3
  部分4   稀释2倍   2.329   3.1
  部分5   稀释2倍   3.875   5.1
  部分6   稀释2倍   76.3   100.0
  部分7   稀释2倍   6.174   8.1
  部分8   稀释2倍   1.726   2.3
  部分9   稀释2倍   2.492   3.3
  部分10   稀释2倍   0.763   1.0
  部分11   稀释2倍   0.031   0.0
  (-)DPPH     100   131.1
  (+)DPPH     0   0.0
实施例3质量图谱的制作 
利用高分辨率质谱(Apex-Qe 15T FT-ICR MS:Bruker Daltonics)获得11个部分的质谱图。对于每个部分，平均质量分辨率为400,000，并且平均误差在1ppm以内。根据质谱图，获得显示出每个部分中包含的物质的分子量和相对含量的质量图谱(图3)。 
实施例4图谱的比较和分析 
将从质谱获得的11个部分{f1,f2,f3,...,f11}的第i个部分fi的质谱图从276.204Da至295.227Da分为23段。每个段的峰强度表示为{mi1,mi2,mi3，...,mi23}，其中mij是第i个部分的质谱图中m/z升序下的第j个峰的强度。并且，将矢量Vj={m1j,m2j,m3j,...,m11j}(j=1,...,23)定义为第j段的质谱图谱。 
归一化23+1个矢量{A,V1,V2,V3，...,V23}(其中A={a1,a2，a3，...,a11})之后，通过本发明人新开发的相关系数的比较来确定显示出与活性相似的模式的质谱段。 
将定义的活性图谱矢量和质量段强度矢量的归一化矢量分别表示为A0 ={a0 1,a0 2,a0 3,...,a0 11}和V0 j={m0 1j,m0 2j,m0 3j,...,m0 11j}。A0和V0 j之间的相关系数定义为 
C j = &Sigma; i = 1 N ( a 0 k &times; m 0 kj ) , N=11。 
将具有最大Cj值的段j确定为显示出最相似模式的段。 
段总数为23，对每个部分检测多于1个的峰。表2给出了Cj值。 
表2 
从表2可见，发现分子量为285.0755的组分及其分子量为286.0762的同位素组分是显示出最大Cj值的活性组分。精确度高达检测到同位素峰。 
表2给出基于归一化值的主组分分析。结果示于图4。从图4可见，通 过选择更接近活性矢量的质量段，可以容易地确定具有更高的相关性的质量值，即与活性图谱更相似的模式。 
实施例5分子式的确定和药理学活性物质的鉴定 
分子量为285.0755的组分被确定为显示出与活性图谱相同模式的活性组分。可以容易地鉴定该组分的分子式为C16H12O5(图5)。 
虽然显示并描述了示例性实施方案，但是本领域技术人员应当理解在不背离所附的权利要求限定的本公开的精神和范围的情况下，可以对其进行形式和细节上的各种改变。 
此外，可以进行许多修改以使特定情况或材料适应本公开的教导，而不背离其实质范围。因此，本公开并不限制为作为实施本公开的最佳模式而公开的特定示例性实施方案，但是本公开包括在所附的权利要求范围中的所有实施方案。 

Claims (7)

1.一种从天然产物发现药理学活性物质的方法，其包括：
通过测试多个样品的药理学活性而获得活性图谱，所述样品为天然产物提取物、其混合物或者天然产物提取物的部分；
获得基于通过质谱对所述样品进行分析得到的质谱图的质量图谱；以及
通过比较和分析所述活性图谱和所述质量图谱来确定药理活性物质的分子量，
其中通过相关系数的比较来进行所述活性图谱和所述质量图谱的比较和分析，
其中所述相关系数由式1表示：
<式1>
C j = &Sigma; i = 1 N ( a 0 k &times; m 0 kj )
其中
j：当质谱图被分为给定质量间隔的段时的第j段；
a0 k：第k个样品的归一化活性；
m0 kj：在第j段中的第k个样品的质量峰的归一化强度；
其中m0 kj＝mkj/{(m1j)2+(m2j)2+(m3j)2+(m4j)2+…+(mkj)2}1/2；并且
N：样品的数目。
2.权利要求1的从天然产物发现药理学活性物质的方法，其还包括：
基于所述质量图谱来确定所述药理学活性物质的分子式。
3.权利要求1的从天然产物发现药理学活性物质的方法，其中使用选自以下的一种或多种方法从分级分离获得所述部分：色谱分离、基于溶解性差异的液-液分离、基于比重差异的分离、基于密度差异的离心、固相萃取(SPE)和基于色差的分离。
4.权利要求3的从天然产物发现药理学活性物质的方法，其中所述色谱分离使用选自以下的一种或多种方法：高效液相色谱(HPLC)、液相色谱、纸色谱、离子交换色谱、薄层色谱、分配色谱、亲和色谱、气相色谱、吸附色谱和凝胶渗透色谱。
5.权利要求1的从天然产物发现药理学活性物质的方法，其中在所述获得活性图谱的步骤中，药理学活性的测试包括定量生理学活性调节作用或者对疾病的预防和治疗作用。
6.权利要求1的从天然产物发现药理学活性物质的方法，其中在所述获得活性图谱的步骤中，药理学活性的测试包括选自以下的一种或多种：抗氧化活性测试、抗癌测试、抗炎症测试和抗菌测试。
7.权利要求1的从天然产物发现药理学活性物质的方法，其中在所述获得质量图谱的步骤中，所述质量图谱基于通过高分辨率质谱测量组分的分子量和丰度得到的质谱图获得。
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