KR20040010776A - 치료제 발견을 위해 천연산물 라이브러리를 제조, 선별 및데레플리케이션하는 방법 - Google Patents

치료제 발견을 위해 천연산물 라이브러리를 제조, 선별 및데레플리케이션하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 총괄적으로 신규 생물활성 약제, 기능식품용 제제 및 화장용 제제의 발견과 개발을 위한, Phytologix™라고도 불리는 기술 기반에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 약용 식물을 수집하여 이 식물들과 관련된 정보학 데이터베이스를 구축하기 위한 통합 시스템을 포함한다. 또한, 본 발명은 간소함, 분리 효능, 라이브러리의 품질, 저렴한 공정 및 고 처리량의 측면에서 종래 기술에 비해 유의적인 장점을 제공하는 개선된 표준화된 추출 및 분별 방법에 관한 것이다. 본 발명은 HPLC/PDA/MS와 같은 기술을 고처리량 생물검정 데이터 및 자체적인 정제 화합물 라이브러리와 연계시켜 사용하는 구조 데레플리케이션 방법에 대한 세부사항을 제공한다. 따라서, 본 발명은 종래 기술의 방법과 비교했을 때 보다 더 효율적이고 정확한 것으로 입증되었다. 마지막으로, 본 발명은 천연 COX-2 및 티로시나제 억제제를 신규한 기능식품용 및 화장용 산물로서 발견 및 개발하는 전 공정을 결정하여 Phytologix™ 기반을 실제 효과적인 공정으로 개선시켰다.

Description

치료제 발견을 위해 천연산물 라이브러리를 제조, 선별 및 데레플리케이션하는 방법{METHOD FOR GENERATING, SCREENING AND DEREPLICATING NATURAL PRODUCT LIBRARIES FOR THE DISCOVERY OF THERAPEUTIC AGENTS}
천연산물은 전통적으로 약용 식물의 과학적 기본으로 사용되어 왔을 뿐만 아니라, 현대 의약에서도 중요한 역할을 하고 있다(Newman et al. (2000) Nat. Prod. Rep. 17:215-234). 1983년과 1994년 사이에 승인된 약물을 검토해보면, 천연 기원의 약물이 승인된 항균 약물의 78%, 혈소판 응집 억제제의 75%, 항암제의 61%, 저혈압 치료제의 48%, 궤양치료제의 47.6%, 소염제의 32.5%를 차지하고 있다 (Cragg et al. (1997) J.Nat.Prod. 60:52-60). 그러나, 진통제, 항울제, 항히스타민제, 불안완화제, 강심제, 항진균제 및 최면제는 주로 기원이 합성물인 것이 많다.
천연산물은 잠재적 선도 약물 발견의 매우 다양한 구조 자원으로 입증되어 있다. 공지된 천연산물은 169,000 가지 이상이다 (The Combined Chemical Dictionary, Chapman and Hall/CRC, version 10:2 Feb. 2002). 10495가지의 천연산물과 5757가지의 수입 약물을 분석한 바에 따르면, 천연산물은 1748가지의 상이한 고리 시스템을 갖고 있어서, 무역 약물(trade drug)에서 확인된 807가지의 상이한 고리 시스템 보다 2배 이상 다양한 것으로 발견되었다 (Lee and Scheneider (2001) J.Com.Chem 3:284-289). 무역 약물에서 관찰되는 고리 시스템의 약 35%는 천연산물에서도 발견되지만, 천연산물에서 관찰되는 고리 시스템의 17% 만이 무역 약물에 동일한 대응물을 갖고 있다. 천연산물은 구조의 선도물질로서 작용할 뿐만 아니라, 무역 약물과 매우 유사한 구조 및 약물특이분자단 성질을 갖고 있다(Lee and Scheneider, (2001) J.Com.Chem 3:284-289; Bemis and Murcko (1996) J.Med.Chem. 39:2887-2893). 10495가지의 천연산물과 5757가지의 무역 약물을 비교해 볼 때, 천연산물의 평균 이론적 분자량은 무역 약물의 분자량과 거의 동일하고(356 대 360); 평균 log p값은 무역 약물(2.5) 보다 천연산물(2.9)이 약간 더 높은 것으로 관찰되었다. 천연산물은 무역 약물 보다 분자당 수소 공급체가 보다 적고 분자당 질소 원자도 보다 적으며; 무역 약물 및 합성 약물 보다 교두보 역할을 하는 원자의 수는 매우 많으며; 분자 당 더 많은 키랄 중심원자를 갖고 있다(Henke et al.(1999) Angew.Chem.Int.Ed. 38:643-647). 하지만, 천연산물과 무역 약물은 모두 분자 당 평균 산소 수가 유사하고 "5우설(rule-of-5)" 위반이 적어도 2개인 화합물의 비율이 동일하다(Lipinski et al. (1997) Adv. Drug Delivery Rev. 23:3-25).
신기술, 예컨대 조합 합성법, 전산화된 약물 디자인 및 초고처리량 선별법 등의 진보와 더불어, 주형으로서 천연산물을 사용하는 소분자 라이브러리의 디자인에 대한 관심이 증가하고 있다(Hall et al. (2001) J.Combinational Chem 3(2):125-150; Wang and Ramnarayan (1999) J.Comb.Chem. 1:524-533). 해결 방안으로서 조합 라이브러리가 작제될 수 있으나, 현재까지 작제된 라이브러리의 대부분은 고상 합성법, 예컨대 표적 합성 화합물의 정제에 주로 사용되는 고상 추출법에 의해 수득되었다 (Desai et al. (1994) Drug Devel.Res. 33:174-188). 하지만, 불행히도 복잡한 천연산물 주형, 특히 다중 고리와 다중 키랄 중심 골격을 함유하는 화합물을 함유한 주형으로부터 라이브러리를 작제하는 합성 접근법에는 유의적 제한점이 있다. 이러한 제한점 중 분명한 것은, 반합성 접근법의 경우 특정 골격 변형과 결정적인 작용기 위치를 다양하게 변화시킬 수 없다는 점이다. 지금까지 공개된 모든 화합물 라이브러리는 시초물질 수집물과 특정 조건하에서 최적화되어야 하는 특정 반응이나 반응 순서를 사용하여 작제하였다 (Weber(2000) Current Opinion in Chem Biol. 4:295-302). 또한, 공지된 천연산물 선도물질로부터 합성 라이브러리를 개발하기 위해서는 변형될 수 있는 천연산물 주형 상의 잠재적 부위를 규명하는, 구조와 활성 사이의 관계에 관한 유의적인 양의 정보가 필요하다. 따라서, 조합 합성 화학의 일반 접근법은 이용이 용이한 약리학적 프로필에 근거한 특정 유형의 천연산물 동정 및 골격이나 주형으로의 구조 정밀분석을 수반한다.
집중된 관심을 받고 있는 천연산물 라이브러리의 디자인은 조합 합성 및 전산 화학을 바탕으로 한다 (Wessjohann (2000) Current Opinion in Chem Biol.4:303-309; Kolb (1998) Prog.Drug Res. 51:185-217). 특정 유형의 화합물을 목표로 하거나(Stahura et al. (2000) J.Med.Model 6:550-562), 특정 치료 목표에 초점을 맞추거나 기준으로서 생체이용률을 포함하는(Shu(1996) J.Nat Prod. 61:1053-1071), 특정 유형의 라이브러리를 디자인하기 위하여 많은 노력이 기울여지고 있다. 천연산물 주형의 다양한 많은 유형이 개발되었고, 다음과 같은 화합물, 즉 벤질아민(Green (1995), J.Org.Chem. 60:4287-4290), 퀴나졸린(Wang and Ganesan (2000) J.Comb.Chem. 2:186-194), 인돌리 디케토피페라진(Loevejzijin et al.(1998) Tetrahedron Lett. 39:4737-4740), 맵피신(mappicine) 유사체(Josien and Curran (1997) Tetrahedron 53:8881-8886), 요힘빈(yohimbine) 유사체(Ni et al.(1996) J.Med.Chem. 39:1601, Atuegbu et al.(1996) 4:1097-1106) 및 올리고헤테로고리(Boger et al.(2000) J.Am.Chem.Soc. 122:6382-6394)로부터의 알칼로이드계 라이브러리; 및 플라본 유사체(Marder et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun 249:481-485) 및 벤조피란(Nicolaou et al. (2000) J.Am.Chem.Soc. 122: 9939-9976, Mason et al. (1999) J.Med.Chem. 42:3251-3264)와 같은 화합물로부터의 플라보노이드계 라이브러리를 비롯한 천연산물 라이브러리가 성공적으로 제작되었다.
합성 라이브러리는 일반적으로 HPLC에 의한 순도가 약 70 내지 80%인 정제된 단일 화합물을 1 내지 2mg의 양으로 함유한다. 이러한 합성법에 의해서 산출되는 다른 화학 성분의 동시존재로 인하여 생물학적 선별 검정법은 허위 양성, 허위 음성 및 다른 복잡한 문제들에 의해 큰 영향을 받을 수 있다. 조합 라이브러리 설계는 낮은 수율, 정제 어려움 및 키랄 중심의 손실을 피하기 위하여 반응 선택성과 효율의 신중한 최적화를 요구한다. 천연산물의 바람직한 특정 생물학적 성질은 간단한 작용기 변형을 포함하는 다소 작은 라이브러리에 의해서도 향상될 수 있음은 입증된 바 있다(Hall et al. (2001) J Combinatorial Chem. 3(2): 125-150). 하지만, 지금까지 농업 및 식품 업계에서 조합 라이브러리를 사용한 보고서는 거의 없다(Wang and Rebintson (1999) in Chemicals Via Higher Plant Bioengineering, Shahidi ed., Kluwer Academic/Plenum Publ. Pp 91-105). 뿐만 아니라, 식이성 보충물과 화장품 산업에서 이러한 라이브러리의 적용에 관해 논의한 보고서는 전혀 없다.
그라블리 등은 천연산물에 근거한 라이브러리로부터의 약물 발견에 관하여 상세히 논의한 바 있다(Grabley et al. (2000) Ernst Schering Res. Found Workshop 32:217-252). 천연산물의 선별은 보통 미정제 추출물에서부터 시작하는 것이 일반적이다. 구체적으로 설명하면, 먼저 식물의 생물자원을, 보통 극성에 따라 선택되는 다양한 용매를 이용하여 여러 번 추출한다. 불행히도, 이러한 미정제 추출물은 다양한 화합물을 소량으로 함유하고 있다. 따라서, 일반적으로 주성분만의 생물학적 활성을 동정하는 것이 보통이다. 따라서, 검출 한계 이하의 농도로 존재하지만 강력한 활성을 가진 화합물이 함께 유실될 수 있다. 또한, 활성이 약한 유사 성분들에 의한 상승 효과로 인하여 또는 일반 성분들의 비특이적 방해로 인하여 허위 양성 결과가 얻어질 수도 있다.
현재, 고처리량 선별과 산물 발견에 적합한 천연원으로부터 천연산물 라이브러리를 직접 제작하는 방법에 관한 보고서의 수는 극히 적다. 이러한 방법 중 하나는 Gary et al(2000)에 의해 WO 00133193에 최근 보고되었다. 이 게리 등에 의한 방법은 (a) 알코올/물 또는 헥산과 그 다음 알코올/물을 이용하여 생물학적 공급물을 충분히 추출하는 단계; (b) 이 용매 추출물을 폴리아마이드 컬럼을 통해 용출시켜 이 추출물로부터 생물검정의 방해물을 제거하는 단계; (c) 상기 폴리아마이드 컬럼의 용출물을, 한정 분획(일반적으로 4개)만을 수집하는 단계 구배를 이용하는 고상 추출법으로 처리하는 단계; (d) 이 분획들을 생물활성 화합물 검출을 바탕으로 한 화합물 라이브러리를 수득하기 위해 HPLC로 정제하는 단계; (e) 자동 시스템으로 표준화된 농도로 만들어진 정제된 화합물을 수집하는 단계를 포함한다. 하지만, 이 방법에는 몇 가지 단점이 있다. 첫째는, 추출 용매로서 사용된 알코올/물의 혼합물이 생물자원에 잠재된 모든 생물학적 활성 성분을 추출할 수 없다는 점이다. 그 좋은 예가 알코올/물에 용해되지 않는 다당류로서, 이것은 식물 생물자원으로부터 추출될 수 없다. 하지만, 다당류는 면역 조절 및 항암 효과가 공지된 매우 중요한 천연산물 종류로서, 약제, 기능식품 및 화장품 산업에 이용되고 있다. 둘째, 폴리페놀과 탄닌은 EGCG와 같은 인기있는 허브제품과 녹차(No et al. (1999) Life Sci. 65:PL241-246), 포도씨 및 포도껍질(Cantos et al.(2001) J Agric Food Chem. 49:5052-8)에서 유래되는 다른 카테친 및 페놀 화합물의 효능에 기여하는 생물학적 활성 성분이다(Kolodziej et al.(2001) Planta Med. 67:825-832; Abe et al.(2000) J.Nat.Prod. 64:1010-1014). 이러한 성분들은 상기 게리 등이 기술한 방법에 의해 식물 추출물로부터 제거되어, 질병 예방 및 치료에 효능이 있고 중요한 가치가 있는 것으로 입증된 바 있는 생물활성 화합물이 유의적으로 상실되게 된다. 셋째, 게리 등이 개시한 방법은 최종 화합물 라이브러리 작제에 여러번의 고상 추출과 컬럼 크로마토그래피를 필요로 하는 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 공정이다. 마지막으로, 이 발명자들이 강조하는 것으로서, 잠재된 생물학적 프로필이나 가치를 알기 전에 각 웰 마다 농도와 구조 정보를 제공한다는 점이다. 이와 같은 노력 역시 분석, 분류 및 보관에 비용이 많이 들고 시간 소모적 공정이다.
또한, 빈드세일 등(Bindseil et al., Drug Discovery Today 6:840-847 (2001))에 의해, 6700가지의 화학적 실재물을 ≥5mg의 함량과 ≥80%의 순도로 수집한 비과다성인 순수 화합물 라이브러리를 작제하기 위하여 고안된 합동 프로젝트가 보고되었다. 여기에 사용된 생물재료는 679종의 식물, 2665가지의 박테리아 균주 및 1425가지의 진균 균주이다. 이 생물재료를 비편재적 2차 대사산물의 추출에 앞서 HPLC/ELSD/DAD 및 LC/MS로 예비선별하였다. 그 다음, 섬광 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 구조 정보를 수집한 뒤 400개의 무작위 선발된 화합물의 전체 구조를 조사하였다. 구조 데레플리케이션 절차는 LC/MS 데이터에 근거한 분자량과 잔류 시간을 참조로 하는 조사와 상용 데이터베이스(Dictionary of Natural Products)와의 비교를 포함한다. 세부구조를 추가로 규명하고 완전한 구조 해명을 위해 2D-NMR과 다른 기법을 이용하였다. 상기한 방법으로부터 작제된 순수 화합물 라이브러리는 9개의 상이한 표적에 대하여 선별한 결과, 반응 속도와 확인 속도 측면에서 합성 라이브러리에 비해 우수한 것으로 관찰되었다.
스튜어트 등은 몰리큘라 네이춰 리미티드(Molecular Nature Ltd)의 순수 천연산물 라이브러리 작제에 관한 연구 결과에 대해 보고하였다(Stewart et al. (2000) Saponins, in Food, Feedstuffs and Medicinal Plants, Olesz다 and Marston (eds.) pp. 73-77). 이 라이브러리의 화합물은 일반적인 평행 상 컬럼 크로마토그래피를 이용한 뒤, C-18 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. 이 라이브러리에 포함되기 위해서는 HPLC, NMR, MS 및 GC/MS의 조합으로 구조 확인 결과 화합물이 >90% 순수해야 한다. 미생물 배양액으로부터 2차 대사산물 라이브러리를 제조하는 방법은 슈미드 등(Schmid et al., J.Biomol.Screening 4:15-25 (1999))에 의해 보고되었다. 여기에서 라이브러리의 작제는 배양액을 앰버라이트(Amberlite) XAD-16 컬럼을 통해 다단계 분별한 뒤, 스티렌-디비닐벤젠 수지, 역상 C-8 및 C-18 및 다른 유형의 고상 추출(SPE)을 이용한 크로마토그래피 컬럼 분별을 기본으로 한 신규 자동법을 이용하고 있다. 이와 같은 시도는 각 분획마다 수동 조작이 한정 개입된 자동 절차로 인해 보다 고순도의 화합물을 생산하였다. 하지만, 이 방법은 몇가지 단점을 갖고 있다. 예를 들어, SPE는 대용량인 제한된 수의 분획을 산출하는 단계 구배를 이용하는데, 이것은 96웰 플레이트에 분획을 수집하는 방법에는 적합하지 않다. 마지막으로, 킹스톤 박사는 항암 약물 발견용으로 유용한 천연 조합 라이브러리의 작제에 대하여 개시하였다(Kingston (2001) Abs. Papers Amer.Chem.Soc. 221:ORGN 199; (1997) Abs. Papers Amer. Chem. Sco. 214: AGRO124).
게놈학, 효소학 및 생물공학의 기술적 개발은 조합 생합성을 이용한 천연산물 작제 방법을 제공하였다(Khosla (2000) J.Org.Chem. 65:8127-8133, Hutchinson(1998) Current Opinion Micorb. 1:319-329). 예를 들어, 에리트로마이신 폴리케타이드 신타제의 다중 유전자 변형은 신규한 합성 천연산물 라이브러리를 제공했다(McDaniel(1999) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:1846-1851). 조합 생합성 라이브러리는 토양에서 분리한 다량의 DNA 단편을 스트렙토마이세스 숙주(Wang et al.(2000) Org.Lett. 2:2401-2404)에 클로닝하고, 글리코실트란스퍼라제 촉매화된 형질전환을 통해(Thorson et al.(2001) Abst. Papers Amer. Chem. Soc. 221:Carb 19) 작제된 바 있다.
정보 데이터베이스 구축과 온라인 구조 데레플리케이션을 위한 고처리량 정제, LC/PDA, LC/MS/MS 및 LC/NMR에 있어서의 최근 개발은 생물활성 천연산물의 연구 방향을 기본적으로 변화시켰다. 데레플리케이션의 주목표는 활성 추출물이나 분획으로부터 공지의 화합물을 확인하여 이 공지 화합물의 불필요한 분리를 피하는 것이다. 이러한 데레플리케이션 공정에 중요한 것은 수집한 정보를 평가하기 위하여 적당한 구조 데이터베이스를 선발하는 것이다(Corley and Durley(1994) J.Nat Prod. 57:1484-1490). CA, NAPROLERT, REGISTRY, BEILSTEIN, MEDLINE 등의 서브데이터베이스를 포함하는 화학 초록 서비스 등록 파일(Chemical Abstracts Service's Registration File) 및 생물활성 천연산물 데이터베이스(Bioactive Natural Product Database)와 DEREP 데이터베이스를 포함하는 천연산물 사전(the Dictionary of Natural Products)은 가장 포괄적인 데이터베이스 중 2가지이다.
2차 분획물에서 수득된 생물학적 활성 데이터와 연계된 HPLC/UV/MS를 이용한 활성 미정제 추출물의 데레플리케이션은 코델과 신(Cordell and Shin, PureAppl.Chem. 71:1089-1094(1999))에 의해 보고되었다. 이 보고에서, 활성 식물 추출물의 분석은 HPLC C-18 컬럼을 30분 안에 아세토니트릴/물 구배로 용출시키고, 양성 및 음성 이중 방식으로 단파장 UV 검출과 ESI-MS를 실시하고 있다. 추출물의 UV 흡광성, 분자량 및 이온 크로마토그램(ELC)에 의한 이온 단편화 정보는 NAPRALERT 및 천연산물 사전을 사용하여 분석하였다. 또한, 문헌[Julian et al.(1998), Anal.Chem. 70:3249-3254]에 기술된 바와 같이 미정제 천연 추출물을 정량적으로 구분하기 위하여 LC-ESI-MS 기법을 사용하였다. 간략히 설명하면, 진균 배양물의 에탄올/물 추출물을, C-18 컬럼을 이용하는 이중 컬럼 HPLC 시스템 상에서 아세토니트릴/물/아세트산암모늄 구배를 이용하여 25분 안에 분리하였다. 유사도 지수는 HPLC 잔류 시간 및 ESI-MS 기구의 양성 이온 방식에서 수득되는 질량 대 하전 비율에 근거하여 수득하였다. 하지만, 이 방법은 양성 방식에 적당한 분자 이온 피크를 제공하는 한정된 유형의 화합물과 한정된 구조 정보에 의한 정량적 결과에만 제한되었다. 울펜더의 보고(Wolfender et al.(1995) J.Mass Spectr.Repid Commun. In Mass Spectr. S35-S46)를 통해 입증되는 바와 같이, 일회 미정제 식물 추출물에 존재하는 모든 2차 대사산물의 최적 이온화를 허용하는 단일 이온화 계면은 없다. 여러 이온화 기법, 예컨대 ES, APCI, TSP 또는 CF-FAB가 LC/DAD 및 MS/MS와 함께 필요하다. 믿을만한 재현성이 있는 MS/MS 단편화 스펙트럼을 조사할 수 있는 라이브러리 작제하기 위하여 질량 분광분석법에 의해 수집된 구조 정보를 발전시키는 것이 매우 도움이 된다(Baumann et al.(2000) Rapid Comm. In Mass Spectr. 14:349-356).
브래드쇼 등은 정제 천연산물 라이브러리의 데레플리케이션을 위한 간편하고 신속한 방법을 개시하였다(Bradshaw et al.(2001) J.Nat.Prod. 64:1541-1544). 이 방법은 각 구조를 LC/MS 유래의 분자량 및 NMR 데이터 유래의 메틸, 메틸렌 및 메탄 기의 정확한 수와 연관짓는 텍스트 파일을 조사하는 단계를 포함한다. 이 조사에는 화학적 구조 정보를 특정 형식, 즉 상용 데이터베이스로부터 변환된 SMILES로 보유하는 주문제작된 소프트웨어를 이용한다.
천연산물의 화학 구조는 저온 탐침을 함유하는 NMR 장치를 사용하여 제한된 양의 물질로부터 신속하게 확인할 수 있다(Russell et al.(2000) J.Nat Prod. 63:1047-1049). 공개된 내부 NMR 데이터의 합리적인 양(Smith et al.(2001) J.Chem.Inf.Comput.Sci. 41:1463-1469)와 연관지어 예측할 수 있는 화학적 이동이 많을수록, 구조 해명 과정의 시간과 정확성이 유의적으로 향상될 것이다(Patchkovskii and Thiel (1999) J.Computational Chem. 20:1220-1245; Grzonka and Davies(1998) J.Chem.Inf.Comput.Sci.38:1096-1101; Schutz et al.(1997) Fresenius J.Anal.Chem. 359:33-41). 또한, 직접 연계된 HPLC와 NMR 및 질량 분광분석법(MS)은 더 많은 구조 정보를 제공하고 데레플리케이션 과정에서 얻어지는 결과물의 품질을 유의적으로 향상시킨다(Lindon et al.(2000) J.Chromatogr. B 748:233-258).
고처리량 선별 기법의 발견은 1980년대 중반부터 시작되었다. 시그널 판독 시스템의 소형화와 더불어 실험실 정보 관리 시스템들과 연결된 로봇 작업은 해마다 분석당 사실상 수백만 샘플의 처리량 선별을 가능하게 해주었다(Lin(1995) J.Food & Drug Anal. 3:233-242). 천연산물 라이브러리는 다양한 생물학적 표적(Virador et al.(1999) Analytical Biochemistry 270:207-219), 생화학적 표적(Noreen et al.(1998) J.Nat.Prod. 61:2-7) 및 게놈 표적(Ghai (1999) 미국 특허 제5,955,269호)에 대하여 선별된 바 있다. 디스플레이 클로닝 기법은 천연산물 수용체들의 기능적 동정을 위하여 cDNA 파지 디스플레이를 사용하여 발견된 바 있다(Sche et al.(1999) Chem Biol. 6:707-716).
효소 사이클로옥시게나제(COX)의 억제작용은 대부분의 비스테로이드성 소염 약물(NSAIDS)에 기인하는 작용 기작이다. COX 효소에는 약 60%의 서열 상동성을 공유하지만 발현 프로필과 기능이 상이한 2가지 상이한 이소폼(COX-1과 COX-2)이 있다. COX-1은 생리학적으로 중요한 프로스타글란딘 생산에 연계되어 있는 효소의 구성형 형태로서, 정상적인 생리학적 기능, 예컨대 혈소판 응집, 위 내의 세포 기능의 보호 및 정상 신장 기능의 유지 기능들의 조절을 돕는다. (Dannhardt and Kiefer (2001) Eur.J.Med.Chem. 36:109-26). 다른 이소폼인 COX-2는 전염증성 사이토킨, 예컨대 인터루킨-1β(IL-1β) 및 다른 성장 인자들에 의해 유도될 수 있는 효소 형태이다.(Herschmann (1994) Cancer Metastasis Rev. 134:241-56; Xie et al.(1992) Drugs Dev.Res. 25:249-65). 이 이소폼은 아라키돈산(AA)으로부터 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생산을 촉매한다. COX-2의 억제작용은 통상적인 NSAIDs의 소염 활성에 일 역할을 한다.
류마티스 관절염은 주로 자가면역질환이고 골관절염은 관절에 있는 연골의 붕괴로 일어나지만 각 질환에 따른 염증을 감소시키는 것만으로도 이 질환들을 앓고 있는 환자들의 삶의 질이 유의적으로 개선되게 된다.(Wienberg (2001) Immunol. Res. 22:319-41; Wollhiem (2000) Curr.Opin.Rheum. 13:193-201). 류마티스 관절염 외에도 일반적인 류마티스 질환의 일 구성요소는 염증이다. 따라서, COX 억제제들의 사용이 전신홍반루푸스(SLE)(Goebel et al.(1999) Chem.Res.Tox. 12:488-500; Patrono et al.(1985) J.Clin.Invest. 76:1011-1018) 뿐만 아니라 피부 경화증과 같은 류마티스 피부 질환에까지 확대되었다. COX 억제제는 또한 건선과 같이 류마티스 기원이 아닌 염증성 피부 질환의 경감에도 사용되고 있는데, 이것은 프로스타글란딘의 과잉 생산에 의한 염증을 감소시켜 직접적인 효과를 제공할 수 있었다(Fogh et al.(1993) Acta Derm Venerologica 73:191-3). 간단히 말하면, COX 억제제는 일시적 염증에 의한 간헐적 통증은 물론 만성 염증 질환의 증후군을 치료하는 데에도 유용하다.
[발명의 개요]
본 발명은 총괄적으로 신규 생물활성 약제, 기능식품용 제제 및 화장용 제제의 발견과 개발을 위한, Phytologix™라고도 불리는 기술 기반에 관한 것이다. 본 발명은 생물탐구와 정보과학, 평행 정제용 정제 기법, 온라인(HTP/UV/MS) 및 오프라인(HPLC/PDA/MS) 데레플리케이션(dereplication), 고처리량 생물검정 기법, 전산 데이터베이스 조사 전력 및 약학, 기능식품 및 화장품 분야의 제품 발견에 통상적인 접근방식에 관한 세부항목들을 제공한다. 이와 같은 신규 치료적 약제, 기능식품용 및 화장용 제제를 발견 및 개발시키는 방법은 (a) 생물학적 샘플을 동정하고 수집하는 단계; (b) 2 용매계 추출 절차를 이용하여 상기 샘플을 추출하는 단계;(c) 이 추출물을 2가지 다른 고처리량(HTP) 분별 방법으로 분리하고, 동시에 각 HTP 분획의 활성을 측정하는 단계; (d) 현존하는 화합물을 동정하기 위하여 활성 분획을 데레플리케이션하는 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 얻은 각 신규 화합물의 지표(indication), 약리학적 프로필 및 안전성 프로필을 제작하는 단계를 포함한다. 샘플은 모든 천연원, 예컨대 식물, 미생물, 진균, 광물, 해양생물, 동물 및 인간 기원의 재료 중에서 선택될 수 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 양태에서, 샘플은 식물이다. 또한, 바람직한 양태로서, 샘플은 보고된 통상의 용도 또는 공지의 의약적 성질에 근거하여 예비선택한다.
수집된 각 샘플마다 수집 형태를 만든다. 수집 형태는 샘플에 대한 구체적인 정보, 예컨대 라틴명, 분포, 수집 위치, 치료 정보, 통상적인 제법, 식물 동정 및 공개된 참고문헌 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 정보를 그 다음 데이터베이스에 옮긴다. 구체적인 매크로와 질의를 만들어 상기 정보와 저장된 데이터를 평가한다.
샘플을 수집한 후, 각 샘플 마다 적어도 2장 이상의 표본 증명서를 만들며, 이 표본 증명서는 천연 및/또는 화학적으로 건조 및/또는 보존된 전체 샘플, 예컨대 완전 생식 기관을 포함하며, 각 표본 증명서에는 동정하기 위한 분류 양식을 부착한다. 이 증명 표본은 본 방법의 연구 단계 동안 샘플의 보전성과 신뢰성을 보장하고, 본 방법의 생산 단계 동안 성공적인 재수집 및 생산의 가능성을 보장하는데 중요하고 고유한 것이다.
Phytologix™ 방법의 제2 단계 및 제3 단계는 복수의 표준화된 추출 및 분별프로토콜을 포함하는 것으로서, 다양한 미정제 추출물과 분획 라이브러리가 고처리량 절차에 의해 수득되어진다. 단계 (b)의 용매 추출 절차는 (a) 적당한 양의 샘플을 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 샘플을 2가지 유기 용매 조합(이 때, 조합은 저극성 용매와 고극성 용매로 구성됨)으로 추출하는 단계; (c) 유기 용매 추출 후 샘플을 건조시키는 단계; (d) 건조된 샘플을 수성 용매로 추출하는 단계; 및 (e) 추출 후마다 용매를 증발시키고 추출물을 분리하는 단계를 포함한다. 추출된 샘플의 양은 일반적으로 1g 내지 1000g 사이이다.
유기 추출 단계에 사용된 저극성은 탄소원자수가 6 내지 10개인 알칸, 탄소원자수가 1 내지 4개이고 각 탄소원자가 1 내지 4개의 할로겐 원자를 갖는 할로겐화 알칸, 화학식 R'COOR"(이 때, R'는 탄소원자수가 1 내지 6개 사이인 알킬 기 중에서 선택되고 R"는 탄소원자수가 1 내지 8개 사이인 알킬 기 중에서 선택되는 것이다)를 갖는 에스테르 및 탄소원자수가 3 내지 12개 사이인 케톤으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이다. 저극성의 용매는 염화메틸렌, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이다. 고극성 용매는 DMSO, THF 및 알코올(이 때, 알코올을 1 내지 8개의 탄소를 갖는 것이다)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이다. 바람직한 양태에서, 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이다. 수성 용매는 비제한적으로, 물, 산성 물, 염기성 물 또는 수성 완충액(이 때, pH는 1 내지 14 사이에서 조정됨)을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것이다. 추출은 비제한적으로 진탕, 초음파처리, 환류, 교반, 가압 혼합 및 여과를 포함하는 당해 기술분야에 공지된 모든 방법에 의해 수행될수 있다.
추출 공정에서 수득되는 추출물은 생물검정을 위하여 (a) 칭량한 뒤 유기 추출물을 용매에 용해시키고; (b) 칭량한 뒤 수성 추출물을 용매에 용해시키며; (c) 각 추출물 용액을 샘플 마스터 플레이트의 각 셀로 이동시켜 준비해둔다. 유기 추출물과 수성 추출물을 용해시키는 용매는 독립적으로, DMSO, DMF, THF, 탄소원자수가 3 내지 10개인 케톤 및 탄소원자수가 1 내지 5개인 알코올을 포함하되, 이것에 국한되지는 않는 용매 그룹 중에서 선택한다.
수득한 추출물은 그 다음 (a) 예비충진된 정상상 컬럼으로 유기 추출물을 분리하는 단계; (b) 예비충진된 역상 컬럼으로 수성 추출물을 분리하는 단계; (c) 용출물을 검출기로 검출하는 단계; (d) 분획을 수집하는 단계; 및 (e) 용매를 증발시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 평행 크로마토그래피 시스템 또는 고처리량 정제(HTP) 시스템을 사용하여 각각 분별한다. 이 크로마토그래피/HTP는 상온 또는 20 내지 80℃ 사이의 온도에서 상압, 저, 중, 고 용매 압력 하에 실시한다. 상기 정상상 컬럼은 실리카겔, 알루미나 및 아미노 프로필, 시아노 프로필, 디올 플로리실 또는 폴리아미드, 이온 교환 수지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 수지로 충진한다. 역상 컬럼은 C-2, C-4, C-8, C-18, LH-20, XAD-4, XAD-16 및 폴리스티렌-디비닐 벤젠계 수지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 수지로 충진한다. 각 크로마토그래피 컬럼에 충진되는 수지의 입자 크기는 10 내지 200 ㎛ 사이이고, 샘플의 양과 분리 난이도에 따라 1 내지 500g의 수지로 크로마토그래피 컬럼을 충진한다.
정상상 크로마토그래피 컬럼은 탄소원자수가 6 내지 10개인 알칸, 화학식R1COOR2(여기에서 R1은 탄소원자수가 1 내지 5개 사이인 알킬기 중에서 선택되고 R2는 탄소원자수가 1 내지 6개 사이인 알킬기 중에서 선택된다)으로 표시되는 유기 에스테르, 및 화학식 R3OH(여기에서 R3은 탄소원자수가 1 내지 6개 사이인 알킬기임)으로 표시되는 알코올 중에서 선택되는 3종의 유기 용매 조합물로 용출시킨다. 역상 크로마토그래피 컬럼은 2종의 용매 조합물, 즉 탈이온수(DI)와 탄소원자수가 1 내지 4개인 알코올, 아세토니트릴, THF 또는 탄소원자수가 3 내지 12개인 케톤으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 용매로 용출시킨다.
검출기는 당해 기술분야에서 이 목적용으로 사용되는 모든 검출기, 예컨대 자외선(UV)/가시광선 검출기, 질량 분광계(MS) 검출기, 핵자기공명(NMR) 검출기, 반사지수(RI) 검출기 또는 광산란 검출기(LSD)를 포함하되, 이것에 국한되지는 않는다. 자외선(UV)/가시광선 검출기는 100 내지 1000 nm 사이의 단파장, 연속 파장 또는 광대역 파장을 가진 단일 또는 이중 채널로 이루어질 수 있다. MS 검출기는 전자 분무 이온화 또는 초음파 분무 이온화 챔버; 이온 트랩 또는 양성이나 음성 방식의 단일 또는 삼중 사중 질량 검출부로 이루어질 수 있다. NMR 검출기는 양성자 또는 탄소 탐침으로 이루어질 수 있다.
HTP 분별 후 각 분획들의 생물활성을 테스트한다. 바람직한 양태로서, 생물검정은 HTP 분별과 동시에 수행되기도 한다. 생물검정의 각 분획을 제조하는 방법은 (a) 유기 추출물 유래의 분획을 용매에 용해시키는 단계; (b) 수성 추출물 유래의 분획을 용매에 용해시키는 단계; 및 (c) 분획의 용액을 샘플 플레이트으로 이동시키는 단계를 포함한다. 유기 추출물과 수성 추출물 유래의 분획을 용해시키기 위한 용매는 비제한적으로 DMSO, DMF, THF, 탄소원자수가 3 내지 10개인 케톤, 탄소원자수가 1 내지 5개인 알코올 및 2 내지 3종의 용매 조합물을 포함하는 그룹 중에서 각각 선택한다. 각 분획은 그 다음 특정 활성의 추출물과 화합물을 동정하기 위한 1차 선별 방법으로서 표준화된 생화학적(효소적), 기능적 또는 생물학적 모델을 사용하여 분석한다.
활성 식물 추출물 및/또는 분획, 및/또는 화합물이 작용 기작 및/또는 특수 치료 효과가 있는 것으로 확인되면, 화학적 조성 모방 및 활성 성분 표준화를 실시한다. 즉, 일단 확인된 활성 분획은 데레플리케이션 공정, 즉 (a) 샘플과 관련된 활성 데이터를 수집하는 단계; (b) 샘플과 관련된 물리적 성질, 분광기 및 구조 데이터를 수집하는 단계; (c) 수집한 데이터를 분석하는 단계; (d) 샘플의 성질을 상용 데이터베이스에서 조사하는 단계; 및 (e) 활성 분획의 조성에 관한 결론을 수득하는 단계를 포함하여 데레플리케이션 공정으로 처리한다.
샘플의 활성은 표준화된 수단, 예컨대 비제한적으로 효소 억제, 수용체 결합, 유전자 발현, 세포 기능 조절, 단백질 생산, 동물 기능 조절 및 동물 질병 모델 조작과 다른 생물학적 기능의 측정법 등을 사용하여 측정한다. 활성 데이터는 추출물, 추출물 분획, 정제 화합물, 반합성 화합물 및 합성 화합물로부터 수집할 수 있다. 데레플리케이션 공정에서 수집되는 물리적 성질 데이터로는 흡착이나 UV/VIS 변화를 기초로 하는 크로마토그램으로부터 얻어지는 잔류 시간, 굴절 지수, 레이저 광산란 패턴, 용매 용출 부피, 질량, pH, 용해성 및 log P가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
수집된 분광기 정보로는 UV/VIS 스펙트럼, 분자 이온과 단편 이온을 수반하는 질량 스펙트럼, NMR 스펙트럼 및 광산란 스펙트럼이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 구조 정보는 질량 단편화 패턴 및 딸이온/손녀 이온의 질량 스펙트럼; 양성자, 탄소, 인 및 1차원 및 2차원 핵자기 공명 분광기 데이터 유래의 다른 원소들의 화학적 이동; 적외선 스펙트럼 및 UV 흡수 스펙트럼과 같은 데이터로부터 수득한다. 이러한 데이터 수집 공정은 용출물 일부를 지정 검출기로 분할시키는 온라인 방법 및/또는 HTP 분리 후 수집된 각 샘플을 분석하는 오프라인 공정일 수 있다. 수집한 데이터는 그 다음 다양한 데이터베이스를 사용하여 분석한다. 사용할 수 있는 상용 데이터베이스로는 천연산물 사전(the Dictionary of Natural Products), 화학 초록 서비스 등록 파일(Chemical Abstracts Service's Registration File), NAPROLERT, MEDLINE, NERAC, DEREP 및 생물활성 천연산물 데이터베이스(Bioactive Natural Product Database)가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
이와 같은 공정으로, 각 분획에 함유된 조성물의 데레플리케이션이 이루어진다. 조성물이 신규한 것으로 결정되면, 추가 연구를 수행하여 신규 천연산물 각각의 지표, 약리학적 프로필 및 안전성 프로필을 수득한다. 이러한 결과가 양성이면, 그 화합물을 상용적 가치가 있는 제품으로 개발한다.
상기한 일반적 설명과 이하의 상세한 설명은 예시적, 설명적인 것으로서 청구범위에 기재된 본 발명을 제한하는 것이 아님은 자명한 것이다.
본 발명은 총괄적으로 신규 생물활성 약제, 기능식품용 제제 및 화장용 제제의 발견과 개발을 위한, Phytologix™라고도 불리는 기술 기반에 관한 것이다. 본 발명은 생물탐구와 정보과학, 평행 정제용 정제 기법, 온라인(HTP/UV/MS) 및 오프라인(HPLC/PDA/MS) 데레플리케이션(dereplication), 고처리량 생물검정 기법, 전산 데이터베이스 조사 전력 및 약학, 기능식품 및 화장품 분야의 제품 개발에 통상적인 접근방식에 관한 세부항목들을 제공한다.
도 1은 약용 식물 수집가들이 제출하는 대표적인 수집 형태를 예시한 것이다. 이러한 예시적 수집 형태는 식물 기원, 식물 동정, 지리적 분포, 민족 지표, 화학적 성분 및 참고문헌에 관한 정보를 포함한다.
도 2는 식물에 대한 모든 정보, 연구 데이터 및 공개 참고문헌을 포함하는 데이터베이스에 들어있는 표와 이 표들의 관계를 설명한 것이다.
도 3은 특정 질의에 근거하여 최종 보고서를 작성하기 위해 데이터베이스에 들어있는 표로부터 정보를 도출해내기 위하여 고안된 매크로를 나타낸 것이다.
도 4는 폴리고넘 비비파럼(Polygonum viviparum)에 대한 대표적인 식물 정보 개요를 예시한 것으로서, 식물 정보, 식물 중량, 추출물 중량 및 민족 지표를 포함한다.
도 5는 다프네 젠콰(Daphne genkwa)(P0490) 꽃에서 얻은 유기 추출물(도 5A), 수성 추출물(도 5B) 및 메탄올 추출물(도 5C)의 HPLC/UV 크로마토그램을 도시한 것이다. 메탄올 추출물에 존재하지 않는 피크는 유기 추출물이나 수성 추출물에도 존재하지 않았다.
도 6은 다프네 젠콰(P0490) 꽃에서 얻은 유기 추출물(도 6A), 수성 추출물(도 6B) 및 메탄올 추출물(도 6C)의 HPLC/MS 총 이온 크로마토그램(TIC)을 도시한 것이다. 메탄올 추출물에 존재하지 않는 피크는 유기 추출물이나 수성 추출물에도 존재하지 않았다.
도 7은 펄사틸라 키넨시스(Pulsatilla chinensis) 뿌리에서 얻은 유기 추출물에 사용된 고처리량 정제 시스템의 분리 효율을 예시한 것이다. HTP 분획을 하나 걸러 실리카겔 TLC 플레이트 상에 점적하고 헥산 중의 60% EtOAc로 전개시켰다. 이 TLC 플레이트에 황산 중의 아니알데하이드를 발색제로서 살포하였다.
도 8은 펄사틸라 키넨시스(Pulsatilla chinensis) 뿌리에서 얻은 유기 추출물을 분별한 후 96웰 심부성 플레이트에 수집된 각 HTP 분획의 중량 분포를 도시한 것이다.
도 9A 내지 도 9L은 본 명세서에 개시된 고처리량 정제 시스템의 재현성을 도시한 것이다. 구체적으로, 이 도면들은 아인슬리애 헨라이(Ainsliaea henryi) 전 식물에서 분리된 동일한 수성 추출물을 12개의 역상 C-18 컬럼 분별 후 얻어지는 12개의 HTP/UV 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 10은 1230가지 식물 추출물을 COX 억제 활성에 대해 선별한 후 얻어지는 양성 적중률을 예시한 것이다. 양성 적중률은 유기 추출물의 경우 1.2%가 양성이었고, 수성 추출물의 경우 0.6%였다. 이 선별 결과, 22개의 활성 식물 추출물이 확인되었다.
도 11은 다양한 식물 종에서 얻은 396가지 유기 추출물의 티로시나제 억제 분포 패턴을 도시한 것이다. >60%의 티로시나제 억제 활성을 나타낸 것은 총 36가지 식물 추출물로서, 양성 적중률이 9.1%였다.
도 12는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)(P0605) 잎에서 얻은 수성 추출물의 역상 분별 HTP/UV 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 13은 카멜리아 시넨시스(P0605) 잎의 수성 추출물에서 얻어지는 다양한HTP 분획이 나타내는 COX-1(■) 및 COX-2(◆) 억제율을 그래프로 도시한 것이다.
도 14는 카멜리아 시넨시스(P0605) 잎의 수성 추출물에서 얻은, 생물활성 HTP 분획 D3의 온라인 PDA/MS 염기 이온 크로마토그램(BIC)을 도시한 것이다.
도 15는 카멜리아 시넨시스(P0605) 잎의 수성 추출물에서 얻은, HTP 생물활성 분획 D3을 오프라인 분석한 결과인 HPLC/PDA 크로마토그램(도 15A) 및 HPLC/MC 총 이온 크로마토그램(TIC)(도 15B)을 도시한 것이다.
도 16A는 온라인 HTP/MS 및 오프라인 HPLC/MS로부터 수집한 데이터를 기초로 한, 동일한 HTP 생물활성 분획 D3의 질량 스펙트럼이다. 도 16B는 실시예 11에 기술된 데레플리케이션 절차의 결과를 도시한 것이다. 이 도 16B로부터 알 수 있듯이 분획 D3은 이 도면에 구조가 병기된 공지의 단일 화합물, 즉 에피갈로카테친 갈레이트를 함유하고 있었다.
도 17은 카멜리아 시넨시스(P0605)의 수성 추출물에서 얻은 총 16가지 생물활성 HTP 분획의 데레플리케이션 결과를 도시한 것이다. 도 17에 도시된 바와 같이, 24개의 HTP 분획에는 구조가 모두 공지된 10개의 화합물이 존재하였다.
도 18은 말로투스 레판두스(Mallotus repandus)(P0368) 전 식물의 유기 추출물에서 얻은 HTP 분획의 멜라닌 생산 억제 활성 대 세포 독성을 도시한 것이다. 멜라닌 생산 억제 활성을 나타내는 여러 피크는 조추출물에 다수의 활성 성분이 존재함을 시사한다. 분획 C10 내지 D12에 위치한 피크는 세포독성에 의한 거짓 피크이다.
도 19는 말로투스 레판두스(전 식물)(P0368)에서 얻은 유기 추출물의 HTP 분획을 멜라닌 억제 분석하여 확인한 활성 피크의 데레플리케이션 결과를 도시한 것이다. 도 19A 내지 도 19F는 오프라인 LC/MS로부터 수집한 활성 분획 D2 내지 D7의 총 이온 크로마토그램이다. 분획 D3 내지 D6에서 나타난 16.33분의 잔류 시간에 위치한 피크는 티로시나제 억제 피크에 정확하게 일치하였다. 도 19G는 분획 D4에서 나타나는 상기 피크(Rt=16.33분)의 질량 스펙트럼이다. 데레플리케이션 결과, 공지 화합물인 폴리페놀 프테로카리아닌 B가 확인되었다(도 19H).
도 20은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)(P0483) 뿌리에서 분리한, 유리 B 고리 플라보노이드인 바이칼레인(Baicalein)에 의한 COX-1 및 COX-2의 억제 프로필을 도시한 그래프이다. 이 시험은 상기 화합물을 사용하여 재조합 양(羊) COX-1(◆) 또는 양 COX-2(□)의 퍼옥시다제 활성 억제율을 조사하였다. 데이터 결과는 억제제를 첨가하지 않은 분석의 억제율(%)로서 나타냈다. COX-1의 IC50은 0.18㎍/㎖/효소 단위인 반면, COX-2의 IC50은 0.48㎍/㎖/단위였다.
도 21은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리에서 분리한, 표준화된 유리 B 고리 플라보노이드 추출물이 나타내는 아라키돈산 유도 염증의 억제율을 도시한 것이다. 이 시험은 아라키돈산을 직접 투여하여 유도한 종기를 억제하는 성질에 근거하여 생체내 효능 실험으로 평가하였다. 처리 귀와 대조용 귀에서 나타나는 종기의 평균 차이는 도 21A에 도시하였다. 도 21B는 아라키돈산 처리 대조군과 비교한, 각 그룹의 억제율을 도시한 것이다.
도 22는 본 발명의 Phytologix™기술 기반을 사용하여 발견, 개발시킨 건강식품 Univestin™의 판매 전단지이다.
도 23은 기능식품 및 화장품 시장에서 판매되는 시판 제품으로서 대표적인 1회분 Univestin™에 대한 분석 증명서(COA)를 제시한 것이다.
도 24는 Phytologix™ 발견 공정의 모식도이다. 식물 수집소 라이브러리와 시장 요구사항을 검토하여 우선적인 식물 추출물을 분석하기 위한 고처리량 선별법 모델을 발견하였다. 생물학적 활성을 확인한 후 표준화된 추출물/농축 분획/순수 화합물에 근거하여 약리학적 프로필과 안전성 프로필을 제작하였다. 이 공정 결과는 산물 후보이다.
도 25는 Phytologix™발견 공정의 모식도이다. 산물 후보, 정보 조사 및 산물 발견을 통해, 생산용 식물 공급원을 확인하고 지적재산권 입장과 시장에서의 잇점에 관한 충고를 얻는다. 효능과 안전성 프로필을 확인한 후 제조 공정 발견 및 파일로트 규모의 원형 제품 생산을 실시한다. Phytologix™공정은 성공적인 임상 시험과 최종 제품 사업 착수로 완성되어질 것이다.
도 26은 중요한 활성 및 데이터 생성의 행적을 유지하기 위하여 Phytologix™공정에서 이용할 수 있는 중요한 직무 체크리스트를 예시한 것이다.
도 27은 Phytologix™기반 기술에 소요되는 시간, 추정 비용 및 결정 과정을 설명한 것이다. 각 발견 및 개발 단계에 관련된 시간과 비용 및 피고용인들에게 요구되는 총 시간을 나타내었다. 이것은 이 프로젝트의 관리자가 각각의 중대한 결정 시점에서 프로젝트의 진행을 평가할 수 있는 기회를 제공한다.
본 명세서에 사용된 다양한 용어들은 본 발명의 관점에 관한 것이다. 본 발명의 성분들을 석명하게 설명하기 위하여 다음과 같은 정의를 제시한다.
본 명세서에 사용된 "샘플"이란 식물, 미생물, 진균, 광물, 해양생물, 동물 또는 인간 기원의 재료로 구성된 그룹 중에서 선택되는 생물학적 또는 천연 물질을 의미한다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서 샘플은 약용 식물이다. "표본" 및 "생물자원(biomass)"이란 용어는 이 샘플이라는 용어와 상호교환적으로 사용되고 있다. 바람직한 양태에 있어서 샘플은 식물이다.
본 명세서에 사용된 "기능식품"이란 "건강보조식품 건강 및 교육법, 1994(DSHEA)"에 의해 규정된 산업이나 시장에 목표가 된 물질 조성물을 의미하는 것으로서, 인간은 물론 다른 동물을 표적으로 한다.
본 명세서에 사용된 "화장품"이란 인간은 물론 다른 동물의 피부, 털, 외모 및 다른 신체 외관의 정상 기능과 양상 및 보전의 유지, 치료 및 예방을 목표로 하는 산업이나 시장에 지향성인 물질 조성물을 의미한다.
"천연산물"이란 천연 자원에 존재하는 원소, 화합물, 2차 대사산물 또는 구조 성분을 의미한다. 천연산물은 단일 화합물이거나 여러 화합물의 혼합물일 수 있다.
"천연물"이란 천연 자원에서 직접 수득한 원물질을 의미한다. 이것은 전식물이거나 식물 일부분, 동물, 해양생물, 미생물 발효 배취, 토양샘플, 광물 단편 등일 수 있다.
"추출"이란 용매, 초임계액을 이용하여 증류, 압착 또는 승화 공정을 통해천연물에서 천연산물을 분리하는데 사용되는 공정을 의미한다. 추출 공정의 산물은 "추출물"이라고 한다. 공지된 모든 추출 방법은 본 발명의 방법으로 사용될 수 있다.
"분별"이란 추출물을 단일 천연산물이나 천연산물의 혼합물을 함유하는 여러 부분이나 분획으로 분리하는 공정을 의미한다.
"데레플리케이션(dereplication)"이란 천연산물, 분획 또는 추출물을 분리함이 없이 물리적 정보, 분광기 정보 및 구조 정보에 대하여 분석하고; 이 정보를 내부 데이터베이스 및 상용 데이터베이스와 비교한 뒤; 신규 화합물 및/또는 공지 화합물의 존재에 대한 결론에 이르는 공정을 의미한다. 데레플리케이션은 추가 연구의 진행 방향을 결정짓는데 사용한다.
"활성제" 및/또는 "생물학적 활성제" 및/또는 "생물활성제"란 천연산물의 생물학적 기능을 의미한다. 생물학적 활성의 예로는 효소 억제, 수용체 결합, 유전자 발현에 대한 영향, 세포 기능 조절, 단백질 생산 변화, 동물 기능 조절 및 동물 질병 모델 조작은 물론 다른 생물학적 산출물의 측정값들에 미치는 영향들을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
"관련 데이터베이스"란 데이터를 저장 및 검색하고 정보를 처리 및 제공하며 반복적 작업을 자동화하는 전산화된 데이터 관리 시스템을 의미한다.
"매크로(macro)"란 상기 데이터베이스가 특정 업무 또는 일련의 업무의 자동화를 위해 지정된 작용을 수행할 수 있게 한 소프트웨어 코드, 예컨대 "비쥬얼 베이직(Visual Basic)" 또는 "VBA 언어"를 의미한다.
"질의"란 상기 데이터베이스에 있는 표들에 저장된 정보에 관하여, 관련 데이터베이스에 부쳐진 질문이나 문의를 의미한다. 구체적으로 지정된 질의는 특정 표에서 데이터를 선택하고, 그 데이터를 분류 및 여과제거한 뒤 계산한 후, 표, 서식, 그래프 및 리포트를 작성할 수 있다.
"농도"란 소정 용량의 용매에 존재하는 추출물, 분획 또는 천연산물의 양을 의미한다. 추출물 플레이트는 유사한 농도의 추출물과, 천연산물의 정상적인 분포를 반영하는 각 셀마다 컬럼에서의 행정과 그 물리적 성질에 따라서 다양한 농도가 되는 분획 플레이트를 가지고 준비한다. 데레플리케이션 공정에서 나타나는, 생물학적 프로필과 어울리는 농도 피크는 생물활성 성분의 동정에 중요한 정보이다. 천연산물의 농도는 생물검정법이나 선별법 모델의 감도 및 성질에 따라서 조정되어야 한다.
"생물검정법" 또는 "생물학적 선별법"이란 시험관내 및/또는 생체내 생물학적, 생화학적 또는 게놈상의 기능 모델로서 천연산물의 효과를 측정하는 시험 방법을 의미한다.
"고처리량 정제" 또는 "평행 크로마토그래피"란 여러 컬럼 분리를 1조로 수행하고, 동시에 다른 조의 컬럼을 세척 및 평형화시키도록 고안된 방법을 의미한다. 이 과정은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 조절되는 기구에 의해 수행된다.
"예비충전된 컬럼"은 동일한 종류, 양, 입자 크기의 수지로 동일한 크기 및 직경의 컬럼에, 표준화된 충전 프로토콜에 따라서 제조된 컬럼을 의미한다. 이것은 자체적으로 충진해서 사용하거나 또는 시판품을 구입하여 사용할 수 있다.
"크로마토그램"은 특수 검출기를 통해 용출물을 통과시킴으로써 검출되고 도출되는 용출물 성분들에 대한 UV/VIS 흡광도, 이온화 강도, 핵자기 공명 시그널, 광산란능, 반사 지수 및 다른 물리적 성질에 기초하는 크로마토그래피 용출물의 도해를 의미한다.
"신규 화합물"은 미지의 화학적 구조와 조성의 천연산물; 및/또는 화학적 구조는 공지이나 새로운 생물학적 활성/기능을 갖는 천연산물을 의미한다.
"공지 화합물"은 생물학적 활성/기능이 알려진, 공개된 화학적 조성/구조를 가진 천연산물을 의미한다.
"상용 데이터베이스"는 예약금을 지불하면 접속할 수 있는 서비스 및/또는 정보 관리 시스템을 의미한다. 이와 같은 데이터베이스로는 NERAC, DIOLOG, 천연산물 사전, 화학 초록 서비스 등록 파일(Chemical Abstracts Service's Registration File), NAPROLERT, MEDLINE, DEREP 및 생물활성 천연산물 데이터베이스(Bioactive Natural Product Database)가 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "치료적"이란 치료 및/또는 예방을 포함한다. 치료적은 사용된 경우 인간은 물론 기타 다른 동물에 대한 것이다.
"약학적 또는 치료적 프로필"은 생물학적 시스템, 생화학적 물질 및 유전자 표적의 활성과 기능을, 유효 용량 범위에서 유의적 독성 없이 조절할 수 있는 능력을 의미한다.
"약학적 또는 치료적 유효 용량 또는 함량"은 목적한 생물학적 결과를 유도해내기에 충분한 투여량 농도를 의미한다. 그 결과, 약제의 전달, 질병 징후, 증상또는 원인의 경감, 또는 생물학적 시스템의 다른 바람직한 임의의 변화가 초래될 수 있다.
"숙주"는 본 명세서에 기술한 조성물이 투여되는 생물 피검체, 인간 또는 동물이다.
"안전성 프로필"은 활성 기능식품 및/또는 화장품 제제가 상당한 양으로 투여된 후 생물학적 시스템, 생화학적 물질 및 분자생물학 표적들의 정상적 활성과 기능을 유지시키는 수준을 의미한다.
"표준화된 추출물"은 각 활성 천연산물 및/총 활성 천연산물 중에서 소정 함량으로 특정 성분 프로필 또는 핑거프린트 화합물을 함유하는, 정제 공정으로부터 수득한 추출물을 의미한다.
"산물 후보"는 목적하는 생물학적 활성과 안전성 프로필을 갖고, 기능식품 및/또는 화장품 산업에 시판 성분으로서 적합한 표준화된 추출물/분획/천연산물을 의미한다.
"원형 제품"은 제시된 생물자원에서 얻어진 활성제 농도와 화학적 프로필의 세부사항에 기초하여 제조업 규모로 생산된 시험 제품을 의미한다.
"임상 평가"는 구체적으로 고안하여 사전승인을 받은 임상 시험 프로토콜에 따라서 천연산물의 인간에 대한 효과, 안전성, 부작용 및 금기사항을 연구하는 것이다.
또한, 본 명세서를 통해 다양한 인용문이 제시되어 있다. 이러한 각 인용문은 그 전체내용이 참고적으로 본 발명에 각각 인용된 것이다.
PhytoLogix™ 발견 공정은 가장 일반적으로 신규한 치료적 약제, 기능식품용 및 화장품용 제제를 발견 및 개발하기 위한 포괄적 방법이라고 설명할 수 있는 것으로서, (a) 예비동정된 생물학적 샘플을 동정하고 수집하는 단계; (b) 2 용매계 추출 절차를 이용하여 상기 생물학적 샘플을 추출하는 단계; (c) 이 추출물을 2가지 다른 고처리량(HTP) 분별 방법으로 분리하고, 동시에 각 HTP 분획의 활성을 측정하는 단계; (d) 현존하는 화합물을 동정하기 위하여 활성 분획을 데레플리케이션하는 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 얻은 각 신규 화합물의 지표, 약리학적 프로필 및 안전성 프로필을 제작하는 단계를 포함한다. 수집할 샘플의 예비선택은 통상적인 용도에 근거하여 실시한다.
PhytoLogix™ 발견 프로그램의 성공을 보장하기 위해서, 전세계의 약용 식물과 기타 다른 생물샘플을 수집하는 것은 필수적이다. 따라서, PhytoLogix™ 프로그램은 생물다양성에 관한 협약의 국제 조약에 따라, 아시아, 남미, 북미, 아프리카 대륙과 기타 다른 지역에 미치는 8가지 국제 민족-식물 수집 협정을 수립하였다. 또한, PhytoLogix™은 무작위적 식물 수집 프로그램과 달리, 문서화된 약용 식물과 기타 다른 문서화된 생체재료에 초점을 맞추고 있다. 이러한 약용 식물과 기타 다른 생체재료는 수천년 동안의 역사적 이용으로 인해 이미 예비선택되고 인간 소비를 통해 임상 시험된 것이다. 따라서, 무작위적으로 수집된 생체재료와 달리, 이러한 재료는 안전하고 효과적인 약제, 기능식품 및 화장품용 산물을 수득할 수 있는 가능성이 가장 크다. 역사적 이용과 관련된 유용한 정보는 현대의 약물 식물과 다른 생체재료에 대한 연구를 통해 제공된 유용한 정보와 함께, 가능한 작용 기전은물론 잠재적 임상 징후들에 대한 상당한 증거를 제공한다. 이러한 정보는 또한 이용가능한 민족의약 정보에 기초하여 선별 모델을 작제하는데 도움이 된다. PhytoLogix™ 발견에 있어서 식물 및 다른 천연 생체재료의 통상적인 용도에 근거한 예비선택 과정은 본 발명에 고유한 것으로서 높은 양성 적중률, 안전한 산물 및 발견 사이클의 단축을 보장하는데 중요하다. 바람직한 양태에 있어서, 샘플은 약용 식물이다.
모든 샘플 수집은 실시예 1에 설명된 바와 같은 표준화된 수집 및 증명서 표본 제작 절차를 사용하여 실시하였다. 바람직한 양태로서 1g 내지 10,000g의 샘플을 수집한다. 수집한 각 샘플에 대하여 표준화된 식물/샘플 수집 양식을 기입하고 그 정보를 실시예 2와 도 2에 예시된 바와 같은 조사용 정보 데이터베이스에 입력한다. 하나의 양태로서, 본 발명은 수집한 각 샘플에 고유 코드를 제공하는 것을 수반하는 고유 생물자원 등록 시스템을 개시한다. 지정된 코드는 실시예 1에 예시한 바와 같이 생물자원의 천연 기원과 직접 연관되어지고, 정보 데이터베이스내의 모든 정보를 함께 연결하는 주요 키로서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 수집한 각 샘플 마다 2장의 표본 증명서를 작성하는 것을 포함한다. 동정용으로 각 증명서 표본에 분류 양식을 첨부한다. 분류 양식은 샘플 동정, 샘플 수집 및 수집자 명 등에 관한 정보를 포함한다. 이와 같은 노력은 본 공정의 연구 단계 동안 생물자원의 완전성과 진위성을 확인하고 본 발명의 생산 단계 동안 재수집과 생산의 성공 가능성을 보증하는데 중요하고 절대적인 요소이다. 실시예 1에 기술한 바와 같이, 현재 PhytoLogix™ 수집 공정으로 획득한 약용식물과 다른 천연 재료는 1170 가지이다. 실시예 1에 기술한 한 바와 같이 획득한 각 샘플 마다 2장의 증명서 표본을 작성하였다. 또한, 생물자원 마다 건량으로 500 내지 2000g의 재료를 보관하였다. 이와 같이 수집된 표본은 전세계적으로 수집된 266개 과, 805개 속 및 932개 다른 종을 포함한다.
본 발명은 생물정보학 구동에 의한 새로운 약용 식물 라이브러리의 평가 단계를 포함한다. 전세계를 통해 현재 수집된 1000 가지 이상의 수집물과 10000 가지 이상의 약용 식물 및 다른 생물 표본의 접근 가능성으로 인해, PhytoLogix™ 발견 프로그램은 민족 지표 및 식물 화학을 포함하나 이에 제한되지 않는 정보를 함유하는 관련 데이터베이스를 포함한다. 이 데이터베이스는 전통적인 용도에 근거하여 최대 가능성이 있는 약용 식물을 우선적으로 선별할 수 있게 해준다. 이의 실례로서, 표 1에 관절염 통증에 대한 신규 기능식품 산물의 발견과 개발을 예시적 목표로 하여 증명하였다. 이를 위해서, 키워드로서 "관절염"을 사용하여 정보 데이터베이스를 조사할 수 있다. 이러한 조사를 통해 관절염 통증 치료에 통상적으로 사용되어 온 18가지 식물 목록이 얻어진다.(표 1). 즉, 이러한 발견 과정으로, 모든 식물에 대한 무작위적 선별과 달리, 상기 18가지 식물에 대한 평가에만 초점을 맞출 수 있다. 이 전략은 통상적으로 선별 방법이 동물 모델을 사용하여 한정된 수의 샘플만을 선별할 수 있는 무작위적 선별법 보다 탁월한 장점을 제공한다. 하지만, 무작위적 선별법이 본 발명의 방법에 따라 배제되는 것은 아니다. 본 발명의 방법은 또한 통상적 용도는 물론 작용 기전에 근거한 고처리량 선별 방법에 까지 확대될 수 있다. 또한, 본 발명은 96웰 심부 플레이트에 표준화된 추출물과 HTP 분획을 제공하여, 무작위 선별법의 대안 방법을 제공한다.
PhytoLogix™ 발견 공정은 다양한 추출물과 분별 라이브러리를 제한된 비용에서 고처리량 양식으로 생산할 수 있도록 하는 복수의 표준화된 추출 및 분별 프로토콜에 의존적이다. PhytoLogix™ 프로그램에서 수집된 모든 생물자원은 실시예 3에 기술된 바와 같이 표준화된 추출 프로토콜에 따라 가공처리하였다. 이 추출 방법은 현재까지 사용된 추출 방법과 비교했을 때 여러 가지 장점을 제공한다. 무엇보다도 우선적으로 본 발명에 기술된 이중 추출 전략은 각 생물자원으로부터 훨씬 더 완전하고 광범위한 천연산물 프로필을 제공한다. 이 공정을 사용하면 천연산물의 중요한 형태 중 하나라도 놓치지 않을 것이다.
실시예 3에 기술된 바와 같이, 먼저 샘플, 바람직하게는 1g 내지 1000g 사이의 샘플을 중간 극성의 용매 혼합물, 예컨대 1:1 비율의 염화메틸렌:메탄올로 추출한다. 염화메틸렌 같은 저극성 용매와 메탄올 같은 고극성 용매의 혼합물은 저극성 내지 중간 극성의 화합물, 예컨대 테르페노이드, 알칼로이드, 지방산, 플라보노이드, 스테로이드, 리그난, 벤조페논, 크로몬 및 안트라퀴논을 용해시킬 수 있을 뿐만 아니라 복수의 극성 작용기 및/또는 모노글리코사이드, 디글리코사이드 및 트리글리코사이드를 함유하는 고극성 화합물, 예컨대 테르페노이드, 알칼로이드, 지방산, 플라보노이드, 스테로이드, 리그난, 벤조페논, 크로몬 및 안트라퀴논 등을 용해시킬 수 있는 용매 시스템을 제공할 것이다. 저극성 용매는 추출을 위해 당해 기술분야에서 사용되었던 공지의 모든 저극성 용매 중에서 선택할 수 있다. 바람직한 양태로서, 저극성 용매는 탄소원자수가 6 내지 10개인 알칸, 탄소원자수가 1 내지4개이고 각 탄소 원자가 1 내지 4개의 할로겐 원자를 갖는 할로겐화 알칸, 화학식 R'COOR"(이 때, R'는 탄소원자수가 1 내지 6개인 알킬 기 중에서 선택되고 R"는 탄소원자수가 1 내지 8개인 알킬 기와 탄소원자수가 3 내지 12개인 케톤 중에서 선택된다)로 표시되는 에스테르로 구성된 군 중에서 선택된다. 저극성 용매의 예로는 염화메틸렌, 에틸아세테이트 및 클로로포름이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 극성 용매는 또한 당해 기술분야에서 추출에 사용되었던 공지의 모든 극성 용매 중에서 선택될 수 있다. 바람직한 양태로서, 극성 용매는 DMSO, THF 및 탄소원자수가 1 내지 8개인 알코올을 포함하되 이것에 국한되지는 않는 그룹 중에서 선택한다. 알코올의 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올이 있으며, 이것에 국한되지는 않는다. 수용성의 고극성 성분, 예컨대 4차 이온화 알칼로이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 유기산의 염, 페놀염, 안트로시아니딘, 아미노산, 펩타이드, 탄닌, 무기물 및 다른 무기 화합물은 물, 산성 물, 염기성 물 또는 수성 완충액에 의해서만 추출될 것이다. 따라서, 이중 유기 용매 시스템으로 추출한 후에는 생물자원에 함유된 수용성 성분을 용해시키기 위하여 물, 산성 물, 염기성 물 또는 수성 완충액으로 생물자원을 추출한다. 바람직한 양태로서, 이러한 두 추출 과정에서 사용되는 용매의 양은 추출 샘플 중량의 1 내지 10배 비율이다. 추출은 진탕, 초음파처리, 환류, 교반 및 가압 혼합, 및 여과를 포함하되 이것에 국한되지는 않는 공지된 모든 추출 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 다양한 식물 종에 실시된 대표적인 유기 및 수성 추출물은 표 2에 제시하였다.
본 명세서에 기술한 추출 방법의 효율은 실시예 4에 예시하였다. 실시예 3에서 기술한 유기 추출 및 수성 추출 후, 메탄올을 이용한 생물자원의 추가 추출은 정확하게 동일한 HPLC 크로마토그램을 갖는 소량의 추출성 물질만을 제공했다(도 5 및 도 6). 도 5와 도 6에 도시된 HPLC 크로마토그램은 2가지 다른 검출법, 즉 배열광다이오드(도 5) 및 이온 포집 질량 분석기(도 6)를 사용하여 수득한 것이다. 도 5와 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 어느 검출법을 사용하여도 메탄올 추출물에 존재하지 않는 특정 피크는 유기 추출물이나 수성 추출물 중 어느 것에도 존재하지 않았다.
본 발명에 기술된 추출 방법의 다른 장점은 이 추출 방법이 추가 분별 및 생물검정법에 충분한 물질을 생산한다는 점이다. 예를 들어, 생물자원 60g의 추출은 약 1 내지 8의 유기 추출물과 1 내지 6g의 수성 추출물을 생산한다. 이 양은 다수의 선별 및 HTP 분별에 충분한 물질을 제공한다.
본 발명의 일 양태로서, 고처리량 분석을 위한 추출물 라이브러리를 제조하는 신규 방법을 제시한다. 이 방법은 유기 및 수성 추출물을 각각 DMSO 및 탈이온(DI) 수에 용매의 0.01 ㎎ 내지 1000 ㎎/ml의 농도로 용해시켜 추출물 마스터 플레이트 세트를 제작하는 단계를 포함한다. 바람직한 양태로서, 추출물의 농도는 용매의 50 ㎎/ml 이다. 샘플 마스터 플레이트는 96웰, 192웰, 384웰, 576웰, 768웰, 960웰, 1152웰, 1344웰 또는 1536웰 플레이트를 포함하나 이것에 국한되지는 않는 그룹 중에서 선택한다. 바람직한 양태에 있어서, 용액은 플레이트 당 88개의 샘플을 제공하여 96웰 심부 플레이트에 보관하였다. 그 다음, 추출물을 일정량 취하여 고처리량 모델로 선별할 수 있다. 각 셀에는 50 내지 100회의 전형적인 고처리량 선별을 완료할 수 있는 충분한 추출물을 제공한다. 유기 추출물 및 수성 추출물 용해에 사용할 수 있는 다른 용매로는 DMSO, DMF, THF, 탄소원자수가 3 내지 10개인 케톤 및 탄소원자수가 1 내지 5개인 알코올을 포함하며, 이것에 국한되지는 않는다.
본 명세서에 개시한 유의적 발견은 효율적이며 실용상 충분한 새로운 추출물의 크로마토그래피 또는 고처리량 분별 방법이다. 이 방법은 실시예 5와 6에 제시되어 있다. 추출물을 고처리량 분별하는 방법은 (a) 평행 크로마토그래피 시스템 또는 고처리량 정제(HTP) 시스템을 사용하는 단계; (b) 예비충전된 정상 상 컬럼으로 유기 추출물을 분리하는 단계; (c) 예비충전된 역상 컬럼으로 수성 추출물을 분리하는 단계; (d) 용출물을 검출기로 검측하는 단계; (e) 분획을 수집하는 단계; 및 (f) 용매를 증발시키는 단계로 이루어진다. 바람직한 양태에 있어서, 크로마토그래피 시스템은 2 내지 4개의 용매 전달 펌프, 용매 혼합기 및 적당한 자동 라인 변환기로 구성되어진다. 이 크로마토그래피는 상압, 저압, 중압 또는 고압의 용매 압력하에서 상온 또는 20 내지 80℃에서 실시되어진다. 정상 상 컬럼은 실리카겔, 알루미나 및 아미노 프로필, 시아노 프로필, 디올 플로리실 또는 폴리아미드, 이온 교환 기-결합 수지를 포함하되 이것에 국한되지는 않는 그룹 중에서 선택되는 수지로 충전한다. 역상 컬럼은 C-2, C-4, C-8, C-18, LH-20, XAD-4, XAD-16 또는 폴리스티렌-디비닐 벤젠계 수지를 포함하되, 이에 국한되지는 않는 그룹 중에서 선택되는 수지로 충전한다. 수지의 입자 크기는 10 내지 200㎛이다. 이 수지 1 내지 500 g으로 크로마토그래피 컬럼을 충전한다.
식물 추출물의 분별에 사용된 것으로 보고된 다른 방법은 많다. 이러한 방법 중 일부는 심지어 본 명세서에 기술된 것과 유사한 고상, 예컨대 실리카겔 및 역상 C-18 컬럼을 이용하기도 한다. 하지만, 상기 배경기술 부문에 기술한 바와 같이 종래 기술의 방법들은 대부분이 제한된 수의 분획(보통 20 분획 미만)을 제공하는 단계 구배를 이용하고 불완전한 분리로 추가의 크로마토그래피 정제를 필요로 한다. 이러한 종래 기술의 방법에 비하여, 본 발명은 정상 상 컬럼에서의 분리가 탄소원자수가 6 내지 10개인 알칸, 에스테르 R1COOR2(여기에서 R1은 탄소원자수가 1 내지 5개인 알킬기 중에서 선택되고 R2는 탄소원자수가 1 내지 6개인 알킬기 중에서 선택된다) 및 알코올(R3OH)(여기에서 R3은 탄소원자수가 1 내지 6개인 알킬기임)을 포함하는 3종의 유기 용매들의 독특한 조합의 구배를 사용하여 실시된다는 점에서 우수하다. 이러한 3 용매 시스템 조합은 도 7과 8에 도시된 바와 같이 분리 및 각 웰 마다 분획의 품질을 유의적으로 개선시킨다. 본 발명에 의해 입증되는 바와 같이 유기 추출물(실시예 5) 및/또는 수성 추출물(실시예 6) 유래의 천연산물은 단일 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다. 또한, 이 산물은 제한된 수의 셀/분획(보통 2 내지 8개의 셀)에 분포되어 있다. 역상 컬럼에서의 분리는 2 용매 조합물, 즉 탈이온(DI)수와 탄소원자수가 1 내지 4개인 알코올, 아세토니트릴, THF 또는 탄소원자수가 3 내지 12개인 케톤으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 용매에 의해 수행되어진다.
공지된 일부 방법이 구배능과 우수한 분리능이 있는 HPLC 시스템을 이용하더라도, 컬럼에 장입될 수 있는 재료 양과 분별 처리량은 본 발명에 비교할 수 없다. 실시예 5와 6에 예시한 바와 같이 유기 추출물과 수성 추출물은 상용성인 예비충전된 컬럼, 일반적으로 유기 추출의 경우에는 실리카겔 컬럼에, 수성 추출의 경우에는 C-18 컬럼에 100 mg 내지 2000 mg의 농도로 장입될 수 있다. 이러한 농도에서, 고처리량 정제로부터 수득되는 각 분획은 1 내지 10 mg/ml의 농도로 용액에 용해될 수 있는 수 밀리그램의 재료를 함유할 것이다. 따라서, 본 발명은 천연산물 연구의 주요 문제점 중 2가지를 해결하였는데, 그 하나는 부수적 활성이지만 상당히 신규한 화합물로서 생물검정 검출 한계 또는 양성 시초값 이하에 속해있는 거짓 음성 결과를 해결하는 방법이다. 해결된 다른 문제점은 바람직한 생물학적 효능 보다는 낮은, 복수 화합물의 혼합물에 의한 상승 효과로부터 얻어지는 거짓 양성을 제거하는 방법이다. 본 명세서에 개시된 방법은 조추출물에 존재하는 각 성분을 분리할 뿐만 아니라 식물 추출물 중의 부수적 활성 성분을 유의적으로 농축시켜 이러한 부수적 성분이 선별 과정에서 검출될 수 있는 기회를 훨씬 더 증가시킨다.
검출기는 당해 기술분야에서 이러한 목적에 사용되고 있는 모든 검출기일 수 있으며, 그 예로는 자외선(UV)/가시광선 검출기, 질량 분광계(MS) 검출기, 핵자기공명(NMR) 검출기, 반사지수(RI) 검출기 또는 광산란 검출기(LSD)를 포함하되, 이것에 국한되지는 않는다. 자외선(UV)/가시광선 검출기는 100 내지 1000 nm 사이의 단파장, 연속 파장 또는 광대역 파장을 가진 단일 또는 이중 채널로 이루어질 수 있다. MS 검출기는 전자 분무 이온화, 초음파 분무 이온화 또는 화학 이온화 챔버; 이온 트랩 또는 양성이나 음성 방식의 단일 또는 삼중 사중 질량 검출부로 이루어질 수 있다. NMR 검출기는 양성자 또는 탄소 탐침으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 독특한 특징은 온라인 구조 정보 수집이다. 본 발명은 평행 처리 방식의 고압 크로마토그래피 컬럼을 이용하는데, 즉 예정된 시간 또는 용량이나, 또는 화학 반응 패턴, 바람직하게는 자외선 흡수 스펙트럼이나 이온화 패턴에 기초하여 크로마토그래피 용출물(각 화학적 화합물 함유) 전달을 유발하는 로봇 제어식 액체 취급 시스템이 연결된 다중 동시 컬럼 작업을 이용한다. 상기 패턴을 패턴들의 라이브러리와 컴퓨터 분석을 통해 비교하면 그 화합물이 공지 또는 미상의 화학적 실체인지를 결정할 수 있다. 도 14 내지 16은 하나의 HTP 분획에 관한 온라인 질량 분광기 데이터 및 동 분획의 오프라인 분석을 도시한 것이다. 이 방법은 수집 분획들이 별도의 공정으로 분석되기 보다는 분광기 데이터가 분리 시에 수집되기 때문에 보다 더 효율적이다. 또한, 본 방법은 정확한 것으로 확인되었다. 도 14 내지 16에 예시한 실례에서와 같이, 이 HTP 시스템은 샘플을 용출물 일정량을 미량역가 플레이트에 분배하는 액체 취급 시스템과 화합물의 분자 이온 및 단편 패턴이 측정되는 초과 초음파 이온화 챔버를 구비한 이온 트랩 질량 분광기로 동시에 유도한다. 질량 스펙트럼에 의해서는 분획의 성분들에 관한 분자량과 일반적인 구조 정보를 얻을 수 있을 것이다. 이 정보를 컴퓨터 분석을 통해 화학적 라이브러리와 비교하면 순도와 임시 신원을 확인할 수 있다.
실시예 5와 6을 통해 증명되는 바와 같이, 본 발명에 개시된 방법은 고효율성인 것으로 확인된다. 분별 공정의 처리량은 14개 유기 추출물로부터 1일당 1232 분획 또는 32개 수성 추출물로부터 2618 분획이다. 이 처리량은 배경기술 부문에서전술한 임의의 공지 방법 보다 10배 이상 높은 것이다.
마지막으로, 본 발명에 개시된 방법의 유의적 장점은 저렴한 작업 비용이다. 소비재 비용에 관한 상세한 내역을 표 4와 5에 제시하였다. 유기 또는 수성 추출물로부터 샘플 1 분획을 제작하는데 소요되는 재료비는 각각 16센트와 32센트에 불과하다. 정상 상 컬럼은 1회만 사용될 수 있으나, 역상 컬럼은 각 작업 당 적당한 세척에 의해 60회까지 재사용될 수 있다. C-18 컬럼의 성능은 공지 화합물인 알로에 크로몬(chromone) 혼합물로 면밀하게 조사된 바 있다(데이터는 제시 안됨). 분리는 동일한 수성 추출물에 대하여 12개 C-18 컬럼 분별을 수행하였을 때 도 9에 제시된 바와 같이 재현성이 높은 것으로 확인되었다. 이와 같은 저비용과 고처리량으로 고품질의 천연산물 분획 라이브러리를 생산할 수 있는 비교할 만한 종래 기술의 방법은 없다.
일단 생물학적 및/또는 지표 표적물이 결정되면 고처리량 선별법(HTS)을 실시하는 PhytoLogix™ 접근법을 실시하는데, 추출물에 존재하는 특정 활성을 갖는 화합물을 동정하기 위해 추출물을 선별하는 1차 수단으로서 생화학적(효소, 수용체 결합 분석), 유전자 발현, 기능적 또는 생물학적 모델을 이용하여 실시한다. 바람직한 양태에서 사용되는 모델로는, 효소 억제, 수용체 결합, 유전자 발현, 세포 기능 조절, 단백질 생산, 동물의 생리학적, 신경학적 및 행동 기능 조절과 동물의 질병 모델 조작과 당업자에게 공지된 다른 생물학적 기능의 측정법이 있으며, 이것에 국한되지는 않는다. 분획의 활성에 관한 데이터는 추출물, 추출물 분획, 정제 화합물, 반합성 화합물 및 합성 화합물로부터 수집할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 제작한 추출물 라이브러리의 가치를 증명하기 위하여, 실시예 7은 효소적 선별법과 이로부터 수득한 결과를 설명하고 있다. 작용 기전이 사이클로옥시게나제(COX) 효소 억제인 소염 화합물을 동정하기 위하여, 중국, 인도 및 다른 국가에서 수집한 615가지 약용 식물 유래의 1230가지 추출물로 이루어진 추출물 라이브러리를 평가하기 위한 COX 효소 억제 분석법을 개발하였다. 이 추출물의 제조에 사용된 일반적 방법은 실시예 3에 기술하였다. 이 추출 방법은 조사된 각 종 마다 유기 추출물과 수성 추출물을 생산하였다. 이러한 1차 추출물은, 사이클로퍼옥시게나제의 주요 기능적 활성 중 하나이고 PGG2를 PGH2, 그 다음 최종적으로 PGE2로 변환시켜 염증의 원인을 제공하는 상기 효소의 퍼옥시다제 활성에 대한 억제제를 동정하기 위한 예비 분석의 출발 물질이다. 이 분석법에 대해서는 실시예 7에 기술하였으며, 그 결과는 도 10에 요약하였다. 도 10을 참조로 하여 설명하면, 1230가지 식물 추출물 선별 후, 총 15개의 유기 추출물(1.2%)과 7개의 수성 추출물(0.6%)이, 하기 기술되는 별도의 실험으로 용량 반응이 확인되듯이 60% 초과의 억제율을 갖는 것으로 확인되었다. 각 식물 추출물에 대한 대표적인 활성 측정값은 표 6에 제시하였다. 표 6에 제시된 바와 같이, 공통 성분으로 유리 B 고리 플라보노이드를 함유하는 2종의 스쿠텔라리아(Scutellaria)와 다른 3종의 식물은 COX-2의 퍼옥시다제 활성에 대한 1차 선별에서 그 정도는 상이하지만 억제 활성을 나타내었다. COX-2 억제 활성은 대부분의 배지 극성 유리 B 고리 플라보노이드를 함유하는 유기 추출물에서 주로 발견되었다. 조추출물의 1차 분석을 통해 수득한 COX-2 억제 활성은 용량 반응 시험과 IC50(효소 활성의 50%를 억제하는데 필요한 농도)을 측정하여 확인하였다. IC50값은 표 7에 제시하였다. 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이 분석에 사용된 스쿠텔라리아 오르토칼릭스(Scutellaria orthocalyx) 뿌리 추출물과 뮤리카 나나(Murica nana) 잎 추출물이 가장 효능적이었다(IC50= 6 내지 10㎍/ml). COX-1에 상대적으로 COX-2에 대한 최대 선택성을 나타내는 스쿠텔라리아 종 유래의 추출물은 스쿠텔라리아 라테리플로라(Scutellaria lateriflora)에서 수득된 것이었다(COX-2 IC50: 30㎍/ml; COX-1 IC50: 80 ㎍/ml). 즉, COX 효소 억제제에 대한 1차 선별법을 통해 시험관내에서 효능적인 22개 추출물이 확인되었고, 이 중 일부는 COX-1에 상대적으로 COX-2 효소에 대한 특이성을 나타내었다.
실시예 8은 화장품용의 신규 피부 미백제를 동정하기 위한 시도로서 티로시나제 효소 억제제에 대한 식물 추출물 라이브러리 선별법을 예시한 것이다. 이 분석법을 통해서는, 5.6% 적중률에 해당하는, 43개의 유기 추출물이 티로시나제 억제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 이것은 774가지 식물 추출물 선별을 기준으로 했을 때 수성 추출물의 경우 확인된 0.78% 적중률 보다는 상당히 높은 것이었다. 이 결과는 도 11에 제시하였다. 표적이 된 지표는 피부 미백제로서 사용하기 위한 화장품이므로, 극성이 보다 낮은 화합물의 피부 투과력이 보다 우수할 것이다. 따라서, 선별 결과는 추출과 생물검정, 양 공정의 선택성으로 인해 불필요한 물리적 성질을 가진 천연산물이 자동 제거된 추출물 라이브러리의 품질을 증명하였다.
분별 라이브러리의 직접적인 선별은, 각 분획이 하나의 주요 화합물을 일반적인 조추출물의 문제점인 거짓 양성과 거짓 음성의 수득 가능성을 제거할 수 있는 충분히 높은 농도로 함유할 것이기 때문에, 그 자체가 가치가 있는 것이다. 또한, 부수적 생물활성 성분이 검출가능한 충분한 농도로 농축되어 있기 때문에 검출될 가능성이 많다. 실시예 9는 실시예 7에 기술한 바와 같이 분리한 생물활성 추출물의 선별법을 설명한 것이다. 이 실시예에서는 HTP 분획 각각을 COX-1 및 COX-2 모두의 퍼옥시다제 활성 억제력에 대하여 조사하였다. 카멜리아 시넨시(Camellia sinensi)의 수성 추출물에서 얻은 분획들의 대표적인 HTP/UV 크로마토그램은 도 12에 제시하였다. 96웰 플레이트에서 총 88개 분획을 선별한 결과, 총 8개의 HTP 분획이 60% 이상의 COX 억제율을 나타내었다(도 13). 실시예 11에 기술한 데레플리케이션 공정 이후에는, 이 분획들과 COX 활성을 나타내는 주위 분획에서 10가지 개별된 화합물이 확인되었다. 수성의 조추출물에는 분석을 방해하거나 효능을 은폐할 수 있는 다수의 성분이 존재한다. 하지만, 본 발명에서는 이러한 성분들이 다른 웰로 분리된다. 이 공정은 여러 생물활성 화합물이 동정된 8개의 양성 분획에 대한 조추출물 중의 단일 데이터 결과로부터 양성 적중률을 크게 향상시킨다.
본 발명에 개시된 방법을 사용하여 제작한 HTP 분획 라이브러리의 주요 장점 중 하나는 데레플리케이션의 유의적으로 향상된 효율과 정확도이다. 데레플리케이션은 샘플에 신규 화합물의 존재 가능성을 결정하기 위한 활성 샘플의 구조 및 물리적 성질 프로필을 가능한 한 최대로 확인하는데 사용되는 방법이다. 신규 화합물일 수 있다는 결정은 추가 분리 및 확인 시도의 정당성을 부여한다. 이러한 목적달성을 위하여, 일반 천연산물의 대표적인 구조 골격을 보유하는 250가지 이상의 공지된 순수 화합물을 가지고 내부 구조 및 분광기 특성 데이터베이스를 개발하였다. 실시예 10은 이러한 데이터베이스 제작에 사용된 방법을 설명한다. 실시예 10에 설명된 바와 같이, 이 화합물들의 분석에 사용된 HPLC법은 공지 방법에 비해 개선된 것이었다. 이 방법은 입자 크기가 보다 작은 C-18 수지와 직경은 작으나 길이가 보다 긴 컬럼을 사용함으로써 분리능의 손실없이 시간이 훨씬 단축되었다(분석 당 총 8.5분). 이러한 자체 데이터베이스는 현재 각 개별 화합물에 대한 6개 분야, 예컨대 화합물의 종류, 화합물명, 분자량, 화학적 구조, UV 스펙트럼과 잔류 시간을 포함한다. 표 8은 이 데이터베이스에 들어있는 플라보노이드, 알칼로이드, 카페인산, 테르페노이드, 크로몬, 안트라퀴논, 이리도이드, 아세토페논 및 쿠마린에 대한 대표적 정보를 기재한 것이다. 전술한 표준화된 HPLC법을 사용하면 구배 용매 시스템과 함께 사용된 역상 및/또는 정상 상 컬럼에 의해 활성 샘플이 분리될 것이다. PDA 및 MS의 검출 피크는 다음과 같이 분석할 수 있다. 즉, 피크의 UV 스펙트럼은 화합물의 구조 골격이나 종류, 즉 플라반, 이소플라보노이드, 테르페노이드, 카페인산 유도체 등에 대한 내부 스펙트럼 데이터베이스와 외부 데이터베이스에 대하여 조사하고; 그 다음 피크의 분자 이온을 사용하여 천연산물 사전과 같은 데이터베이스를 통해 분자량 조사와 함께 다른 조사가능한 분야, 예컨대 식물 라틴명, 화합물 종류, UV 스펙트럼 등을 조사하며; 마지막으로 잔류 시간을 통해 그 화합물의 극성, log P, 용해도 및 다른 물리적 성질에 대한 일반적 양상을 수득한다.
PhytoLogix™ 데레플리케이션 공정의 고유함은 실시예 10과 11에 설명하였다. 실시예 11은 녹차의 수성 추출물에서 얻은 COX 퍼옥시다제 억제제에 대한 HTP 분획 라이브러리의 데레플리케이션을 설명한 것이다. 도 13에 도시된 바와 같이 COX 억제 피크 주위에 있는 총 24개 분획을 표준화된 HPLC로 분석하였다. 잔류 시간, UV 및 MS 데이터를 수득하여 평가한 후, 24 셀 각각에 있는 주 성분들은 모두 데레플리케이션되고 공지의 카테친 및 플라보노이드 종류의 화합물인 것으로 확인되었다. 그 결과는 도 17에 도시하였다. 각 화합물은 3 내지 4개의 각 셀 중에 분포되었다. 카테친과 플라보노이드의 COX 억제 활성은 공지된 것이므로, 데레플리케이션 공정의 결과는 이 활성 분획들이 더 이상 연구 가치가 없음을 확인시켜 준다.
실시예 12는 B16 세포주에서의 멜라닌 형성 억제에 대한 HTP 분획 라이브러리의 데레플리케이션 결과를 설명한 것이다. 간략히 설명하면, 억제 및 세포 생육성 분석 후, 말로투스 레판두스(Mallotus repandus) 전식물의 활성 유기 추출물을 실시예 5에 기술한 바와 같이 HTP로 분별하였다. HTP 분획 전부를 티로시나제 억제 활성에 대해 시험하고 그 결과를 도 18에 도시하였다. 도 18을 참조로 하여 보면, 멜라닌 합성에 대해 >50%의 억제율을 나타내는 주 피크는 3개이고 이보다 약한 억제율을 나타내는 다른 피크는 7개였다. 예리한 활성 피크는 분리 성능의 지표이며, 활성 성분은 3 내지 5개 셀에 분포해 있다.
멜라닌 형성 분석을 세포 생육성 분석에 대하여 진행하였으므로 분획 D11에서의 최대 활성 피크는 세포독성에 의한 피크일 가능성이 크다. 분획 D2 내지 D7에 위치한 다른 활성 피크의 데레플리케이션은 도 19에 도시하였다. 모든 활성 분획 마다 HPLC로 분석하였다. 각 분획의 HPLC 크로마토그램에는 Rt = 16.33분인 피크가존재하였다. 이 피크는 각 분획의 멜라닌 억제 활성에 의해 나타나는 경향으로서 동일한 증가 내지 감소 강도를 나타내었다. UV 스펙트럼의 추가 분석을 통해, 이 화합물이 갈릭산 유도체임을 확인하였다. 이 화합물을 천연산물 사전을 통해 분자 이온 및 식물 속명을 조사한 결과, 공지 화합물, 즉 프테로카리아닌 B(구조는 도 19H에 도시하였음)임이 확인되었다. 이 구조 중의 다수의 하이드록실 기는 멜라닌 합성 억제에 중요한 역할을 하는 것이다. 이것은 공지의 화합물이었기 때문에 추가 분리는 불필요하였다.
결론적으로, 천연산물 사전 및 NERAC 서비스를 통해 접속가능한 다른 외부 데이터베이스와 함께 사용되는 자체 구조 및 분광기 데이터베이스를 포함하는 데레플리케이션이라고 하는 가속화된 활성 확인 공정은 공지 성분, 거짓 양성 및 거짓 음성을 제거하고 분리 동정에 관한 분석의 수행으로 신규 활성 천연산물의 발견을 유도하는 매우 효율적이고 신속한 구조 동정을 제공한다. 본 발명에 기술된 방법은 공지의 방법, 특히 정제 화합물 라이브러리의 개발 및 사용에 비하여 다음과 같은 유의적 장점을 제공한다. 첫째, 고유한 분리 조건과 단독 크로마토그래피 시도로, PhytoLogix™ HTP 분획 라이브러리는 본 발명의 배경기술 부문에 설명된 바와 같은 다른 공지의 라이브러리 보다 제작하기가 더 용이하고 비용도 적게 든다. 증명된 바와 같이, PhytoLogix™ HTP 라이브러리는 각 셀에 다수의 고처리량 분석을 수행하기에 충분한 야의 고순도 천연산물을 함유한다. 둘째, PhytoLogix™ 기반에 따른 데레플리케이션 공정은 생물검정 결과와 밀접한 관련이 있다. 따라서, 활성 분획과 한정된 주위 분획만이 분석되는 바, 종래 기술에 기술된 바와 같은 모든 분획의 데레플리케이션 및/또는 일부 분획의 무작위적 데레플리케이션과 달리, 상기한 분석은 시간을 절약하고 집중된 노력을 기울일 수 있다. 셋째, PhytoLogix™ 데레플리케이션은 생물학적 활성 프로필에 부합시켜 UV 또는 MS 크로마토그램으로부터 수득되는 활성 분획의 천연 중량 분포 곡선을 이용하는 바, 활성 성분을 보다 더 정확하고 신속하게 확인시켜 준다. 마지막으로, PhytoLogix™ 공정에 의한 온라인 데이터 수집과 오프라인 HPLC법의 시간 단축은 비용과 시간 측면에서 보다 더 효율적으로 동일한 결과와 결론을 도출해낼 수 있다.
데레플리케이션 공정으로부터 활성 HTP 분획이 신규 화합물 또는 화합물들을 함유하고 있는 것이 측정되면, 실시예 13에 예시한 바와 같이 충분한 분리, 정제 및 동정 공정을 개시한다. 실시예 13은 COX 효소의 활성을 억제하는 화합물 바이칼레인의 분리, 정제 및 동정에 대한 것이다. 일단 정제하면, 정제된 화합물의 소염 활성을 확인하였다. 그 결과는 도 20에 도시하였다.
활성 식물 추출물 및/또는 분획 및/또는 화합물이 일단 신규 작용 기전 및/또는 특이적 치료적 가치가 있는 것으로 확인되면 화학적 조성 프로필 작성과 활성 성분 표준화를 완성한다. 화합물의 안전성 및 치료적 효능의 평가 및 확인은 단백질, 세포, 유전자 및 동물 모델을 이용한 2차 선별을 통해 실시한다. 실시예 14는 PhytoLogix™ 기반을 사용하여 동정 및 개발된 표준화된 식물 추출물의 소염 활성 확인에 관한 것이다. 그 결과를 도 21에 도시하였다. 확인 공정은 시험관내 및 생체내 효능, 안전성 및 독성에 관한 정보, 생체이용률 및 투여량을 조사하기 위하여 디자인하였다. 종합적으로, PhytoLogix™ 발견 공정은 신규 성분들의 시장 동정 및차별화를 경쟁성이 있는 장점으로 확립시킨 것이다.
PhytoLogix™ 발견 공정의 최종 단계는 생물정보 데이터베이스에 의해 얻어진, 지적재산권 선점, 원료 공급 및 파일로트 규모 공정의 최적화를 위한 제품 개발 전략이다. 생산 후 얻어진 제품은 약학적 활성과 안전성/독물학 프로필화를 재확인하여 규제국의 승인을 얻기 위해 준비하고 소비자에 대한 규제국의 안내와 효과적인 권리 실체를 제공한다.
실시예 15는 기능식품 산물로서 천연 COX 억제제를 개발하는데 있어서 실제 생물 예를 이용한 전 과정을 요약한 것이다. 여기에서 결과물은 관절 통증과 염증을 표적으로 하는, Univestin™이라고 하는 당해의 신규 조성물이다. 이 조성물은 본 발명에 그대로 참고인용되는 특허문헌인, "Isolation of a Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia"라는 발명의 명칭으로 2002.3.22 출원된 특허 출원 일련번호 10/104,477에 기술되어 있다. 이 제품은 현재 시판중이며 도 22와 23에는 이 제품의 판매 시이트와 분석 증명서를 제시하였다.
PhytoLogix™ 공정을 개략하여 실시예 16에 제공하고 도 24 내지 27에 예시하였다. 도 24는 PhytoLogix™ 발견 공정의 모식도이다. 식물 수집 라이브러리와 시장 요구물의 분석으로부터 우선적인 식물 추출물을 분석하기 위한 고처리량 선별 모델을 개발하였다. 생물학적 활성을 동정한 후 표준화된 추출물/농축분획/정제 화합물에 대하여 약리학적 프로필과 안전성 프로필을 제작하였다. 이 과정의 결과물은 제품 후보이다. 도 25는 PhytoLogix™ 개발 공정의 모식도이다. 도 25를 참고하여 볼 때, 정보 연구와 제품 개발은 생산 사용을 위한 식물 공급원을 동정하고 지적재산권 선점과 유리한 시장에 관한 충고를 얻을 수 있게 한다. 효능과 안전성 프로필을 확인한 후에는 파일로트 규모의 원형 제품의 제조 공정 개발과 생산을 실시한다. Phytologix™ 공정은 성공적인 임상 시험과 최종 제품 사업 착수로 완성되어질 것이다. 도 26은 중요한 활성 및 데이터 생성의 행적을 유지하기 위하여 Phytologix™ 공정에서 이용할 수 있는 중요한 직무 체크리스트를 예시한 것이다. 도 27은 Phytologix™ 기반 기술에 소요되는 시간, 추정 비용 및 결정 과정을 설명한 것이다. 각 발견 및 개발 단계에 관련된 시간과 비용 및 피고용인들에게 요구되는 총 시간을 나타내었다. 이것은 이 프로젝트의 관리자가 각각의 중대한 결정 시점에서 프로젝트의 진행을 평가할 수 있는 기회를 제공한다.
이하 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
식물 및 증명서 표본 수집
먼저, 수집할 식물을 동정하고 논밭이나 식물 농장에서 신선한 식물을 수집하였다. 가능하다면 전 식물을 식물 부분 마다 절단했다. 충분한 재료를 수집하여 신선한 잎 10 내지 12kg, 신선한 열매 또는 씨 또는 전 식물 7 내지 8kg, 또는 신선한 줄기 또는 뿌리 5 내지 6kg을 얻었다. 전 식물 또는 식물 부분(이하, 식물/식물 부분이라 부른다)을 물로 세척하고 곤충, 먼지 및 기타 다른 오염물을 제거하였다. 그 다음, 식물/식물 부분을 개방된 공기 중에서 건조시키거나 60℃ 미만의 온도에서 건조기로 건조시켰다. 건조 전과 후에 식물/식물 부분의 총 중량을 기록하였다. 또한, 건조 과정의 결과로서 나타난 식물 샘플의 모든 변화를 기록하였다. 포장하기 전에, 식물/식물 부분의 다양한 상태, 예컨대 건조도, 곤충 및 진균 감염, 청결도 등에 대하여 평가하였다. 그 다음, 식물/식물 부분을 증명서 번호, 식물명, 식물 부분 및 중량이 표지된 클린백에 넣었다. 가능하다면, 각 식물 샘플은 하나의 백에 포장하였다. 하지만, 식물 샘플이 여러 백에 포장된다면 백 번호도 샘플 라벨에 표시해야 한다. 식물 수집 양식(도 1)을 기입하여 포장 식물과 함께 넣는다. 각 식물 백 여러 개를 하나의 판지 박스에 포장하였다. 각 박스 마다, 포장일, 식물명, 증명서 번호, 각 식물에 대한 백 수 및 각 식물의 중량 등을 포함하는 포장 리스트를 작성하였다. 건조제 백을 박스에 넣고 박스를 밀봉하였다. 수집 양식(도 1)의 사본과 포장 리스트는 운송과 취급 과정 중의 손실이나 손상을 방지하기 위하여 우편으로 송달하였다.
증명서 표본을 작성하기 위하여, 꽃과 열매를 비롯하여 성숙한 전 식물을 수집하였다. 신선한 식물을 편평하게 압착시켜 신문지나 다른 종류의 미가공 종이에 넣었다. 식물이 완전히 건조될 때까지 매일 종이를 교체해 주었다. 식물의 꽃과 씨는 작은 백에 따로 담아두었다. 수정한 식물을 얻을 수 없다면 이 식물의 꽃 및/또는 열매에 대한 정보는 수집가로부터 입수하였다. 하지만, 식물이 개화하고 열매를 맺고 있을 때 증명서 표본을 수집하고자 시도하였다. 각 식물 마다 각각의 증명서 번호를 지정하였다. 식물 증명서 번호, 라틴명, 지역명, 수집 장소, 일자 및 수집가명을 라벨에 기록하고, 이 라벨을 식물 증명서에 보관하였다. 증명서는 2통을 작성하여, 하나는 동정하기 위한 식물과 함께 연구실로 보내고 다른 하나는 추후 비교하기 위하여 수집가의 파일에 보관해 둔다.
연구실에서는 식물 재료를 받는 즉시, 증명서 표본을 꺼내어 수집 기록지 또는 다른 임의의 첨부 서류에 첨부해둔다. 식물 샘플의 상태를 점검하고 각 샘플마다 식물 기록 양식을 작성하였다. 각 샘플 마다 독립적으로 번호를 지정하였는데, 식물에 대해서는 Pxxxx, 해양생물에 대해서는 Mxxxx, 박테리아와 미생물에 대해서는 Bxxxx, 진균에 대해서는 Fxxxx, 토양에 대해서는 Sxxxx, 동물에 대해서는 Axxxx, 곤충에 대해서는 Ixxxx, 광물에 대해서는 Mxxxx, 비타민에 대해서는 Vxxxx, 유기 합성 화합물에 대해서는 Oxxxx, 게놈 변조된 2차 대사산물에 대해서는 Gxxxx로 표시하였다. 이 번호는 증명서 표본에 부착하였다.
식물 샘플이 완전히 건조되지 않았다면, 가능한 한 즉시 작게 부수거나 분쇄하여 동결건조시켰다. 분쇄하기 전에 각 식물 샘플 마다 표본(10g, 표본 #1)을 유지하였다. 이 표본은 표지된 병(125ml)에 넣어 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. 표본 #1은 식물의 거시적 및 미시적 동정용으로만 사용하였다. 분쇄 후, 건조 분말의 표본(100g, 표본 #2)을 유지하고 표지된 병(250ml)에 넣어 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. 표본 #2는 식물의 화학적 동정과 비교용으로 사용하였다. 증명서 표본은 수집 기록지 사본 및 식물 샘플(10g)과 함께 식물 동정을 위한 식물 연구소로 보냈다. 이 동정 결과는 식물 정보 양식에 기록하였다. 식물이 건조한 지와 만연되지 않았는지를 확인하기 위하여 식물 상태를 점검하였다. 그 다음, 분쇄된 식물 샘플을 폴리프로필렌 광구병에 넣었다. 샘플을 칭량하고 그 중량을 라벨에 기록하였다. 그 후, 식물 기록 양식, 식물 추적 기록 및 식물 정보 양식을 해당 직원에게 제출하였다. 이 양식들의 모든 기록은 컴퓨터 데이터베이스에 입력하고 상기 모든 양식은 안전한 장소에 적당히 보관해두었다. 2002년 6월 현재, Phytologix™ 라이브러리는 총 1170가지 식물과, 300개 이상의 과, 900개 속 및 1100개 초과의 상이한 종으로부터 얻은 천연 재료를 갖고 있다. 이 식물들은 중국, 인도, 가나, 미국 및 아시아, 남미, 북미 및 아프리카의 다른 국가들에서 수집한 것이다.
실시예 2
데이터베이스 생성
약용 식물과 다른 천연 재료에서 수집한 모든 정보를 취급하기 위하여 주문제작한 액세스(Access) 데이터베이스를 개발하였다. 이 데이터베이스는 특별히 고안된 관계를 이루고 있는 여러 표들 뿐 아니라 기타 다른 표들로 구성되어 있다. 도 2에 예시한 바와 같이, 표들은 Log(실험기록), Plant Ethno Indication(식물 민족 지표), Ext.(추출물), Fractionations(분별), Ext.Tracking(추출물 추적), Storage(보관), Compound Type(화합물 종류), Compound Registration(화합물 등록번호), Sender(공급자), Activity(활성), Assay(분석법) 등의 정보를 포함하는 것이 일반적이다. 각 표에는 수집한 각 샘플에 대한 정보, 예컨대 ID#, 증명서 ID, 속(Genus), 종(Species), 과(Family), 식물 부분(plant part), 식물 상태(plant status), 식물 초기 중량(plant fresh weight), 건조 중량(dry weight), 지리학적 분포(geological distribution), 식물 동정(Botanical identification), 식물 수집 양식(plant collection forms), 추출물 정보(extract information), 민족지표(ethno indication), 분석 결과(assay results) 등을 저장하였다. 따라서, 각 표로 들어가면 특정 매크로(도 3)와 질의에 따라 정보가 분석 조사된다. 이 정보는 리포트(도 4 참조) 양식으로 요약되어진다. 표 1은 류마티스 관절염 및 관절염의 치료에 통상적으로 사용된 약용 식물들에 대한 조사 결과를 제시한 것이다. 이와 같은 정보는 특정 목표에 대하여 제한된 수의 식물(20 내지 50가지)에만 집중적인 연구 노력을 우선적으로 기울일 수 있도록 도와줄 것이다. 이러한 "정보과학 데이터베이스"는 발견 공정에 관한 것으로서, 산물 발견 및 개발 위험율, 비용 및 시간을 유의적으로 감소시키며 실제 유효한 신생 산물의 발견 가능성을 높여줄 것이다.
실시예 3
식물 추출물 라이브러리 작제
식물 재료는 입자 크기 2mm 이하로 분쇄하였다. 분쇄하여 건조한 식물 재료(60g)를 그 다음 어얼렌메이어 플라스크에 옮겨 놓고, 여기에 메탄올:디클로로메탄(1:1) (600ml)을 첨가하였다. 이 혼합물을 1시간 동안 진탕시키고, 여과한 뒤, 다시 새 메탄올:디클로로메탄(1:1) (600ml)으로 생물자원을 추출하였다. 이 유기 추출물을 합하여 40℃ 진공하에 증발시켜 유기 추출물을 수득하였다(하기 표 2 참조). 이 유기 추출 후, 생물자원은 공기 건조시키고 초정제수(600ml)로 1회 추출하였다. 여과하여 수용액을 얻어서 이를 동결건조시켜 수성 추출물을 수득하였다(하기 표 2). 각 추출물(수성 및 유기 추출물)의 샘플(100 내지 200 mg)은 보유하였으며, 이후에 참조하기 위하여 -20℃에 보관하였다.
생물검정용 추출물 마스터 플레이트의 제작
각 추출물은 70±25 mg 범위의 샘플로서 바이엘에 담고, 각 바이엘 마다 DMSO(1.5ml) 또는 초정제수(1.5ml)를 첨가한 뒤, 이 혼합물을 초음파처리하여 고체를 완전히 용해시켰다. 이 용액을 그 다음 각 바이엘에서 심재형 96웰 블록으로 옮겼다. 그 위치와 해당 샘플 코드를 기록하였다. 이 심재형 96웰 블록은 사용전까지 -70℃의 냉동고에 보관하였다. 생물검정시에는 각 샘플을 해동시켜 각 생물검정마다 50 내지 200ml의 샘플을 사용하였다.
실시예 4
추출 방법의 확인
식물 재료는 입자 크기 2mm 이하로 분쇄하였다. 분쇄하여 건조한 식물 재료(60g)를 그 다음 어얼렌메이어 플라스크에 옮겨 놓고, 여기에 메탄올:디클로로메탄(1:1) (600ml)을 첨가하였다. 이 혼합물을 1시간 동안 진탕시키고, 여과한 뒤, 다시 메탄올:디클로로메탄(1:1) (600ml)으로 생물자원을 추출하였다. 이 유기 추출물을 합하여 40℃ 진공하에 증발시켜 유기 추출물을 수득하였다(하기 표 3 참조). 이 유기 추출 후, 생물자원은 공기 건조시키고 초정제수(600ml)로 1회 추출하였다. 여과하여 수용액을 얻어서 이를 동결건조시켜 수성 추출물을 수득하였다(하기 표 3). 수성 추출 후, 얻은 생물자원을 건조하고 메탄올(600ml)로 2회 추출하였다. 이 메탄올 용액을 합하여 40℃ 진공하에 증발시켜 MeOH 추출물을 수득하였다. 같은 식물의 유기 추출물, 수성 추출물 및 메탄올 추출물을 핑거프린트 화합물과 비교하여 HPLC/PDA/MS로 분석하였다. 그 대표적인 결과를 도 5와 6에 제시하였다.
실시예 5
유기 추출물의 HTP 분획 라이브러리 제작
유기 추출물(400mg)을 최소량의 MeOH(약 1 내지 1.5ml)에서 초음파 처리하여 용해시키고, 예비충전된 섬광 컬럼(ID 2cm x 8.2cm, 10g 실리카 겔)에 수작업으로 부하하였다. 이 컬럼을 모든 용매가 증발될 때까지 건조시켰다. 이 컬럼은 특별한 구배 이동상인 (A) 50:50 EtOAc:헥산 및 (B) 메탄올을 100% A에서부터 100% B로 사용하여 5ml/min의 유속하에 30분내에 히타치 고처리량 정제(HTP) 시스템으로 평행 용출시켰다. 광대역 파장 UV 검출기를 사용하여 분리를 모니터하고 용출물은 길슨(Gilson) 분획 수집기를 사용하여 심재형 96웰 플레이트에 웰 당 1.9ml씩 88개 분획으로 수집하였다. 사반트(Savant) 제품인 SpeedVac Plus(모델 #SC250DDA)를 사용하여 저진공 원심분리 하에 샘플 플레이트를 건조시켰다. 도 7A 및 7B는 HTP 분획들의 박층 크로마토그래피(TLC) 분석 결과를 예시한 것이다. 이 도면으로부터 HTP가 극성에 근거하여 다른 종류의 화합물을 분명하게 분리한다는 것을 알 수 있었다. 이와 같이 분리된 성분들은 6 내지 10개의 셀에 분포되어 있을 수 있으나, 대부분 각 셀마다 하나의 화합물, 많아야 3종 미만의 화합물이 함유되어 있었다.
도 8은 각 웰에 존재하는 샘플의 중량 분포를 도시한 것이다. TLC 화합물 점들 마다 조사한 결과 중량 분포 프로필이 서로 일치하는 여러 피크가 존재하였다. 각 웰에 DMSO(1.5ml)를 첨가하여 샘플을 용해시킨 뒤 심재형 96웰 플레이트는 -70℃에 보관하였다. 지정된 모든 생물검정을 위한 딸 플레이트 제조 시, 이 마스터 분획 플레이트를 실온에서 해동시킨 뒤, 각 웰로부터 각 용액의 일부(50 내지 200㎕)를 분취하였다. 2개의 HTP 컬럼 분별을 완료하는 데에는 약 40분이 소요되고, 8개의 심재형 96웰 플레이트를 건조시키는 데에는 약 5시간이 소요되었다. 유기 추출물의 1일 처리량은 14개 컬럼과 1232개 분획이었다. 표 4는 유기 추출물의 고처리량 분별에 대한 비용 분석을 기술한 것이다.
실시예 6
수성 추출물의 HTP 분획 라이브러리 제작
수성 추출물(750mg)은 탈이온(DI)수(5ml)에 용해하고, 1㎛ 주사기 필터를 통해 여과한 다음, 4ml HPLC 바이엘에 담았다. 그 다음, 예비충진된 역상 컬럼(C-18, 15㎛ 입자 크기, ID 2.5cm x 10cm, 예비컬럼 삽입물 함유)에 상기 용액을 자동샘플주입기로 주입하였다. 이 컬럼을 100% A에서부터 100% B까지 20분 내에 (A)물과 (B)메탄올의 구배 이동상을 이동시킨 다음, 100% 메탄올을 5분 동안 10ml/min의 유속으로 이동시키는 히타치 고처리량 정제(HTP) 시스템으로 용출시켰다. 광대역 파장 UV 검출기로 분리를 모니터하고 용출물은 길슨(Gilson) 분획 수집기를 사용하여 심재형 96웰 플레이트에 웰 당 1.9ml씩 88개 분획으로 수집하였다. 사반트(Savant) 제품인 SpeedVac Plus(모델 #SC250DDA)를 사용하여 저진공 원심분리 하에 메탄올을 제거하고 플레이트를 동결건조시켰다. 멸균여과하고 내독소 시험된 초정제수(1.5ml)를 각 웰에 첨가하여 샘플을 용해시키고, 이 심재형 96웰 플레이트는 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다. 지정된 모든 생물검정을 위한 딸 플레이트 제조 시, 이 마스터 분획 플레이트를 실온에서 해동시킨 뒤, 각 웰로부터 각 용액의 일부(50 내지 200㎕)를 분취하였다. 도 9A 내지 도 9L은 식물 아인슬리에 헨리(Ainsliaea henryi) 전체에서 얻은 수성 추출물의 HTP 분리에 관한 재현성을 예시한 것이다. 수성 추출물은 HTP에 사용된 4개의 평행 C-18 컬럼을 통해 3회 추출하고, 총 12개의 심재형 96웰 플레이트를 만들었다. 12회 컬럼 분리 후 수득되는 HTP/UV 크로마토그램은 동일하였는 바, 12개 플레이트의 동일한 웰 위치에 있는 샘플을 모았다.
2개의 HTP 컬럼 분별을 완료하는 데에는 약 20분이 소요되고, 8개의 심재형 96웰 플레이트를 건조시키는 데에는 약 10시간이 소요되었다. 유기 추출물의 1일 처리량은 32개 컬럼과 2618개 분획이었다. 표 5는 수성 추출물의 고처리량 분별에 대한 비용 분석을 기술한 것이다.
실시예 7
COX-2 및 COX-1의 천연 억제제에 대한 식물 추출물 라이브러리의 선별
특정 COX-2 억제제를 동정하기 위한 생물검정 의존성 선별 공정으로서, 하기 기술되는 바와 같이 효소의 퍼옥시다제 활성 검정법을 사용하였다. COX-1과 COX-2 활성을 억제하는 화합물의 선별을 위한, 이 두 효소의 퍼옥시다제 활성 억제를 이용하는 고처리량 시험관내 분석법은 개발되어 있다(Raz and Needleman et al.(1990) J.Biol.Chem. 269:603-607). 간단히 설명하면, 공지 농도의 Univestin™ 및/또는 이의 각 성분, 즉 유리 B 고리 플라보노이드 또는 플라반을 일정량의 COX-1 및 COX-2 효소 각각에 대하여 적정하였다. 이 분석에서 각 효소의 퍼옥시다제 활성을 가시화하기 위하여 보조제로서 아라키돈산과 함께 과산화물 발색단을 첨가하였다. 일반적으로, 분석은 96웰 형식으로 실시하였다. 각 억제제는 100% DMSO에 10mg/ml 농도로 용해시킨 스톡 용액으로 만들고, 다음과 같은 농도 범위로 실온에서 3반복으로 시험하였다: 0, 0.1, 1.5, 10, 20, 50, 100 및 500 ㎍/ml. 각 웰에, 100mM Tris-HCl(pH 7.5) 150㎕를, 트리스 완충액으로 희석한 22μM 헤마틴 10㎕, DMSO로 희석한 억제제 10㎕, 및 COX-1 또는 COX-2 효소 25 단위와 함께 첨가하였다. 각 성분을 회전대 상에서 10초 동안 혼합하고, 그 다음 반응 개시를 위하여 2mM TMPD 20㎕ 및 1.1mM 아라키돈산 20㎕를 첨가하였다. 플레이트를 10초 동안 진탕한 후 5분 동안 항온처리한 다음, 570nm에서의 흡광도를 판독하였다. 발광도는 월락 빅터(Wallac Victor) 2 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 억제제 농도 vs 억제율%을 플롯팅하고, IC50을 등온선을 따라 최대값의 1/2을 표시한 뒤 x축의 농도를 교차시켜 측정하였다. 그 다음, 이 분석에 사용된 효소 단위 수로 IC50을 규정화하였다. 도 10은 1230가지 식물 추출물의 선별 후 얻어지는 양성 적중률을 도시한 것이다. 대표 식물 종의 추출물이 나타내는 COX-2 퍼옥시다제 억제율은 표 6에 제시하였다. 표 6의 데이터는 재조합 양 COX-2 효소 및 기질 단독물에 상대적인 퍼옥시다제 활성의 비율(%)로서 나타냈다. 대표적인 유기 추출물에 의한 억제율은 30% 내지 90% 범위였다.
COX-1 및 COX-2 이소폼의 상대적 억제율을 비교하기 위해서는 이 효소들 각각의 IC50값이 필요하다. 이 IC50은 특정 억제제에 의해 대조군에 상대적인 효소 활성의 50% 억제가 달성되는 농도를 의미한다. 본 실험에서는 IC50값이 표 7에 제시된 바와 같이 COX-2 및 COX-1 효소에 대해 각각 6 내지 50㎍/ml과 7 내지 80㎍/ml범위인 것으로 나타났다. 이와 같이 COX-2 및 COX-1의 IC50값을 비교한 결과, 이들 효소 각각에 대한 각 식물 종 유래의 유기 추출물의 특이성을 알 수 있었다. 예를 들어 스쿠텔라리아 라테리플로라의 유기 추출물은 IC50값이 각각 30㎍/ml 및 80㎍/ml로서 COX-1 보다 COX-2를 우선적으로 억제함을 알 수 있다. COX-2에 대해 우선적인 억제를 나타내는 일부 추출물도 있지만, 그렇지 않은 것도 있다. HTP 분획 및 이들 분획에서 분리한 정제 화합물의 조사는 이들 추출물 및 화합물에 대한 진정한 억제 특이성을 측정하는데 필요하다.
실시예 8
천연 억제제 티로시나제에 대한 식물 추출물 라이브러리의 선별
포메란쯔(Pomerantz(1991) J Biol.Chem. 241:161-8)의 변법을 사용하여 티로시나제 활성을 측정하였다. 간략히 설명하면, 조추출물을 DMSO에 30mg/ml의 농도로 용해시키고, 이 샘플을 그 다음 인산칼륨 완충액(pH 6.8)에 1:10으로 희석하였다. 추가 희석에는 10% DMSO/완충액을 사용하였다. 대규모 선별을 위하여 분석 형식을 96웰 방식으로 옮겼다. 샘플의 시험 웰에는 완충액 50㎕, 0.5ml/ml 추출물 50㎕, 2mM L-dopa 50㎕ 및 50U/ml 버섯 티로시나제 50㎕를 첨가하였다. 양성 대조군은 상기 샘플 대신에 10% DMSO/완충액을 사용한 것을 제외하고는 전술한 것과 같다. 기질은 마지막에 12 채널의 다중웰 피펫으로 첨가하여 반응을 개시시켰다. 플레이트를 즉시 96웰 플레이트 판독기로 450nm에서 판독하여 도파크롬의 형성을 측정하였다. 플레이트는 실온에서 항온처리한 뒤, 정확히 1분 후에 재판독하였다. 흡광도의변화는 2분 동안 선형이었다. 대조군의 변화율은 450nm에서 △0.2A/min인 것이 가장 적절한 것으로 결정되었다. 시험 샘플의 억제율은 다음과 같은 식으로 계산하였다:
억제율 = (Rc-Rs)/Rc x 100
Rc: 샘플 무첨가 하에서의 △ 흡광도/분 (대조군)
Rs: 샘플 첨가하에서의 △ 흡광도/분
이러한 96웰 플레이트 형식으로, 정제된 버섯 티로시나제에 대하여 미정제 유기 및 수성 식물 추출물을 시험하였다. L-Dopa 기질과 티로시나제 효소의 농도를 포메란쯔 변법을 사용하여 나란히 비례적으로 감소시켰다. 도 11은 다양한 식물 종에서 얻은 396가지 유기 추출물의 티로시나제 억제 결과를 도시한 것이다. 774가지 식물 추출물 중 43가지 추출물은 >60% 억제율(5.6% 양성 적중률)을 나타내고; 6가지 식물은 IC50이 <100㎍/ml(0.78% 확인 적중률)인 활성 분획을 나타내어 6개의 활성 화합물을 분리 동정하였다.
실시예 9
COX 퍼옥시다제의 억제제에 대한 HTP 분획 라이브러리의 선별
실시예 7에서 얻은 각 생물활성 유기 및 수성 추출물을, 실시예 7에 기술된 방법을 사용하여 COX-1 및 COX-2 재조합 효소 모두의 퍼옥시다제 활성 억제능에 대하여 각 HTP 분획을 조사하여 추가로 특성규명하였다. 도 12는 카멜리아 시넨시스(P0605) 수성 추출물의 HTP 분획에 대한 광대역 파장 UV 크로마토그램을도시한 것이다. 대표적인 COX 억제 결과는 도 13에 도시하였으며, 이것은 실시예 3 및 6에 기술된 바와 같이 제작된 카멜리아 시넨시스(P0605) 유래의 HTP 분획에 의해 COX-2 및 COX-1 활성이 억제됨을 나타내고 있다. 도 13에 도시된 프로필은 COX-1에 대한 특정 선택율을 가진 총 16개의 분획 중 분획 C4 내지 E4 사이에 위치한 억제율 피크를 나타낸다. COX-1 및 COX-2 효소는 모두 다수의 억제 피크를 나타내어, 카멜리아 시넨시스(P0605)의 수성 추출물이 나타내는 초기 억제 프로필에 1 이상의 화합물이 관여함을 시사하였다.
실시예 10
구조 및 분광기 특성으로 이루어진 데이터베이스 제작
대표적인 구조 형태를 가진 250가지 순수 천연산물을 5 내지 500 mg과 >90%의 순도(HPLC)로 함유하는 데이터베이스를, 화합물의 자체 분리 및 시그마, 인도핀(Indofine) 및 크로마덱스(Chromadex) 시판원으로부터 화합물의 구입을 통해 제작하였다. 각 화합물은 메탄올에 용해시켰다(1mg/ml). UV 흡광성과 질량 이온화성이 상이하기 때문에 각 화합물의 희석과 농축이 추가로 필요하기도 한다. 샘플 용액은 35℃ 온도, 0.4ml/min의 유속하에 루나(Luna) C18 컬럼(2x50mm, 3㎛)을 이용한 HPLC로 분석하였다. 이 컬럼은 0 내지 4분 사이에는 10% 내지 90% 아세토니트릴(ACN) 수용액 구배 시스템으로, 4.1 내지 6.0분 사이에는 100% ACN으로, 6.1 내지 8.5분 사이에는 10% ACN 수용액으로, 총 8.5분간 평형화 용출시켰다. 용출액의 분석에는 배열 광다이오드 검출기를 이용하여 200 내지 500nm 사이의 파장으로 분석하고, 다음과 같은 조건하의 이온 트랩 MS로 분석하였다: 검출기 475v, 포커스35v, 드리프트 40v, SSI 챔버 0.5 kv, 구경 1 150℃, 구경 2 120℃, 커버 플레이트 250℃ 및 음성 또는 양성 검출. 잔류 시간, UV 스펙트럼, 분자 이온 및 단편화를 기록하고 조사가능한 라이브러리에 저장하였다. 표 8은 구조 및 분광기 데이터베이스에 포함된 일반 정보를 기술한 것이다. 데레플리케이션 공정에서 미상의 분획을 동일한 조건하에 분석하고 PDA 검출 후의 HPLC 피크를 UV 라이브러리에서 구조 골격과 화합물 종류에 대하여 조사하였다. 이 분자 이온 및 잔류 시간은 데이터베이스인 천연산물 사전 및 NERAC을 조사하여 공지 화합물인지를 동정하는데 사용하였다.
실시예 11
COX 퍼옥시다제의 억제제에 대한 HTP 분획 라이브러리의 데레플리케이션
HTP 플레이트로부터 생물검정 결과를 수득한 후 데레플리케이션 공정을 개시하였다. 그 결과는 도 13에 도시하였으며, 이것은 총 16개 분획 중 분획 C4 내지 분획 E4에 COX 억제 활성이 남아있음을 보여주고 있다. 이 분획을 사용하여 실시예 10에 기술된 바와 같이 LC/PDA/MS에 대하여 각각 분석하였다. 그 결과는 생물활성 분획 D3의 온라인 PDA/MS 염기 이온 크로마토그램(BIC)을 도시한 도 14에 제시하였다. 도 15A와 도 15B는 분획 수집 후 오프라인으로 분석한 분획 D3의 UV 및 MS 크로마토그램을 도시한 것이다. 분획 D3의 분자 이온 스펙트럼은 도 16A에 도시된 바와 같이 분석이 온라인 또는 오프라인으로 수행되었는지의 여부에 관계없이 동일하였다. 실험 데이터와 천연산물사전에서 수득한 정보를 사용하여 구조 및 분광기 라이브러리를 조사한 결과, 분획 D3은 공지된 하나의 주요 화합물인 에피갈로카테친갈레이트(EGCG)(도 16B)(공지의 COX 억제제)를 함유하고 있었다. 이와 같은 전략으로, 총 16개의 활성 HTP 분획을 데레플리케이션한 결과 도 17에 예시한 바와 같이 공지의 카테친과 플라보노이드를 함유한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 12
티로시나제 억제제에 대한 HTP 분획 라이브러리의 데레플리케이션
멜라닌형성 억제는 시그리스 및 에벌리(x)이 변법으로 측정하였다. B16 F1 마우스 흑색종 세포(2.0 x 104세포/ml)를 GibcoBRL 변형 이글 배지(10% FBS, 1% Gibco 비필수 아미노산, 1% PSG, 1.5% Gibco 비타민 용액)에 2차 배양하였다. 배양(37℃, 5% CO2) 3일 후 세포를 96웰 멸균 배양 플레이트(Costar)에 접종(2500 세포/웰, 200㎕)하고 하룻밤 동안 항온배양하였다(37℃, 5% CO2). 다음 날, 세포 배양 배지를 새 배지 100㎕로 교환하였다. 추출물 샘플은 30 mg/ml의 농도로 DMSO에 용해하고, 별도의 멸균 96웰 플레이트에서 세포 배양 배지에 1:1000의 비율로 희석하였다. 샘플(50㎕)을 12웰 다중웰 피펫을 사용하여 희석 플레이트에서 세포 배양 플레이트로 옮겼다. 모든 양성 웰에 α-멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)(시그마)을 첨가하여(150 pM, 50㎕) 멜라닌형성을 자극하였다. α-MSH를 첨가하지 않은 샘플 웰은 대조군으로서 멜라닌 색소 형성과 관련없는 샘플의 450nm 흡광도 측정에 사용하였다. 멜라닌 색소 형성은 4일 후에 육안으로 관찰되었다. 멜라닌 형성 정도는 96웰 플레이트 판독기로 450nm에서 측정하였다. 샘플의 억제율은 다음과 같은 식으로 결정하였다:
억제율% = [(Ac MSH+)-(Ac MSH-)]/[(As HSH+)-(Ac MSH-)][Ac MSH+)-(As MSH-)] x 100
Ac MSH+: 샘플은 첨가되지 않고 MSH는 첨가된 셀의 450 nm 흡광도
Ac MSH-: 샘플은 첨가되지 않고 MSH도 첨가되지 않은 셀의 450nm 흡광도
As MSH+: MSH와 함께 샘플을 함유하는 셀의 450nm 흡광도
As MSH-: MSH 없이 샘플을 함유하는 셀의 450nm 흡광도
말로투스 레판두스(전식물)(P0368)에서 분리한 활성 유기 추출물을 실시예 5에 기술한 바와 같이 HTP로 분별하였다. HTP 분획 모두 티로시나제 억제 활성 vs 세포 독성에 대해 시험하고 그 결과는 도 18에 예시하였다. 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이 미정제 추출물에 다수의 활성 화합물이 존재함을 시사하는 다수의 피크가 나타났다. 최대 활성 크기는 분획 C10 내지 D10에 위치한 것으로서, 효소 억제 보다는 세포 독성에 기인하는 것일 수 있다. 가장 흥미로운 활성은 세포 독성을 나타내지 않는 분획 D2 내지 D7 사이의 피크에 존재하였다. 이 분획들의 HPLC/PDA/MS 분석(도 19A 내지 도 19F)은 티로시나제 억제 활성 위치와 중복되는 16.33 분의 잔류 시간에 음의 이온 강도값의 증가를 나타냈다. 이 피크는 UV 및 MS에 의한 추가 분석 결과(도 19G), 이 화합물의 골격이 갈레이트 골격임을 시사하였다. 이 실험 데이터와 천연산물사전에서 입수한 정보를 이용한 구조 및 분광기 라이브러리 조사를 토대로 할 때, 이 피크가 공지의 폴리페놀, 즉 프테로카리아닌 B에 상응하는 것임을 결정지을 수 있었다. 이 화합물의 구조는 도 19H에 제시하였다. 폴리페놀은 티로시나제 억제 활성이 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 데레플리케이션 공정은 미정제 추출물과 HTP 분획의 양성 적중률이 공지 공급원 유래의 일부 세포 독성 외에도 주로 공지 화합물 때문임을 신속하게 확인시켜 주었다. 따라서, 이 식물 추출물에는 추가 노력을 기울일 필요가 없다.
실시예 13
스쿠텔라리아 오르토칼릭스의 유기 추출물에 존재하는 유리 B 고리 플라보노이드의 분리 및 정제
스쿠텔라리아 오르토칼릭스의 뿌리로부터 실시예 3에 기술된 바와 같이 분리한 유기 추출물(5g)을, 예비충진된 섬광 컬럼(120g 실리카, 입자 크기 32 내지 60㎛, 25cm x 4 cm) 상에 부하하고, (A) 50:50 EtOAc:헥산 및 (B) 메탄올 구배 이동상을 60분 동안 15ml/min의 유속으로 100% A에서부터 100% B까지 용출시켰다. 분획 당 10ml씩 시험관에 분획을 수집하였다. 진공하에 용매를 증발시키고, 각 분획의 샘플을 DMSO 1ml에 용해시킨 뒤, 20㎕ 일정량을 박층성 96웰 디쉬 플레이트에 옮겨 담아 COX 억제 활성에 대해 시험하였다. COX 분석 결과에 기초하여 활성 분획 #31 내지 #39를 합한 뒤 증발시켰다. HPLC/PDA 및 LC/MS 분석 결과, 주요 화합물이 잔류 시간 8.9분과 272 m/z의 MS 피크에서 나타났다. 산물을 (A) 물과 (B) 메탄올의 구배 이동상으로 45분 동안 5ml/분의 유속으로 용출시키는 C18 반정제 컬럼(25cm x 1cm)을 통해 추가 정제하였다. 88개의 분획을 수집하여 백색 고체 5.6mg을 수득하였다. HPLC/PDA와 LC/MS를 이용하여 표준물과 비교하여 순도를 측정하고 NMR 데이터를 수득하였다. H NMR:δppm(DMSO-d6) 8.088(2H, m, H-3',5'), 7.577(3H, m, H-2',4',6'), 6.932(1H, s, H-8), 6.613(1H, s, H-3). MS: [M+1]+ = 271 m/e. 그 결과, 화합물은 바이칼레인으로 확인되엇다. COX-1에 대한 IC50은 0.18㎍/ml/효소 단위인 반면 COX-2에 대한 IC50은 0.28㎍/ml/효소 단위였다(도 20).
실시예 14
표준화된 기능식품 추출물의 생체내 COX 억제 활성 연구
2가지 모델 시스템을 사용하여 생체내 염증 억제율을 측정하였다. 제1 시스템(귀 종기 모델)은 아라키돈산에 의해 직접 유도된 염증을 측정한다. 이것은 COX-2 억제율의 우수한 측정방법이나, 세포막 인지질로부터 포스포리파제 A2(PLA2)에 의한 아라키돈산 방출의 업스트림을 일으킬 수 있는 임의의 세포 사건은 측정하지 못한다. 따라서, 억제제가 생물학적 관련성이 깊은 반응에 작용하는 방식을 측정하기 위하여 에어 파우치 모델을 사용하였다. 이 모델은 강한 세포 침윤 및 염증성 매개인자 생산을 특징으로 하는 염증 반응을 유도하는 보체의 강한 활성인자, 예컨대 시토킨 및 아라키돈산 대사산물을 이용한다.
귀 종기 모델은 전술한 바와 같이 아라키돈산 대사 억제의 직접적인 측정방법이다(Greenspan et al.(1999) J.Med.Chem. 42:164-172; Young et al.(1984) J.Invest.Dermat. 82:367-371). 아세톤 중의 아라키돈산을 마우스의 귀에 국소 적용하였다. 아라키돈산 대사는 COX-2와 같은 효소의 작용으로 생산되는 전염증성 매개인자를 생성시킨다. 종기 억제는 이 경로에 관여하는 효소를 억제하는 직접적인 측정방법이다. 아라키돈산(AA)을 적용하기 24시간 및 1시간 전에 시험 화합물의 3가지 투여량을 복막간(I.P.) 또는 위관영양법에 의한 경구 경로로 5마리의 Balb/c마우스 7 그룹에게 투여하였다. 아세톤 중의 AA(2mg/15㎕)는 좌측 귀에 투여하고, 음성 대조군인 아세톤(15㎕)은 우측 귀에 투여하였다. 1시간 후, 동물에게 CO2를 흡입시켜 죽이고 귀의 두께를 공학용 마이크로미터로 측정하였다. AA를 투여하고 소염제를 처리하지 않은 동물 및 AA와 인도메타신(I.P.) 5㎎/kg을 처리한 동물도 대조군으로 사용하였다.
그 결과는 도 21에 도시하였으며, 이것은 2회(24시간 및 1시간전)에 걸쳐 위관영양법에 의한 경구 경로 또는 복막간(IP) 경로로 전달한 3가지 추출물의 효과를 나타내고 있다. S.바이칼렌시스에서 분리된 유리 B 고리 플라보노이드는 IP 및 위관영양법으로 전달했을 때 종기를 억제했으며, IP 전달시 보다 효과적이었다(도 21A 및 도 21B). S.오르토칼릭스에서 분리된 유리 B 고리 플라보노이드는 경구 전달이 아닌 IP 전달에서만 AA 대사산물의 생성을 억제한 반면, S.라터리플로라에서 분리된 추출물은 시험관내에서는 효능이 있었지만 생체내 시험에서는 효과를 나타내지 않았다(데이터 제시 안됨).
실시예 15
PhytoLogix™기반의 결과로서 천연 COX-2 억제제의 기능식품 산물로의 개발
COX-II 억제제의 화학적 특징을 함유하는 신규 기능식품 성분을 개발하기 위하여, PhytoLogix™ 공정을 수년 동안 사용하여 수천 가지의 식물 추출물을 선별하였다. 천연 COX-2 억제제에 대한 여러 효소 분석 및 세포 종류 분석을 통해 1230개의 식물 추출물 라이브러리가 1.8% 양성 적중류로 선별되었다. 전술한 고처리량 정제 시스템을 사용하여 22개 활성 추출물을 추가 조사하고, 분리된 정제 화합물을 전술한 COX 분석으로 시험하였다. 정제 화합물 및 식물 추출물의 생물학적 활성은 양의 COX-1 및 COX-2 효소, 인간의 COX-2 효소, 벌독 PLA2, 인간 5-LO, 인간 말초혈액 세포 및 THP-1 세포주 분석으로 확인하였다. 그 다음, 시험관내 모델에서 효능이 있는 것으로 측정된 추출물에 대하여 에어 파우치 및 국소 귀 종기 모델을 사용하여 여러 경로(IP 및 경구)로 투여했을 때 생체내 염증 억제능을 시험하였다. 지금까지 이러한 연구를 통해, 모든 시험 농도에서 활성을 나타내는 소염제로서 유리 B 고리 플라보노이드 및 플라반을 확인할 수 있었다.
이러한 집중적인 노력으로, Univestin™이라고 하는 당해의 신규 조성물이 발견되었다. 이 조성물은 "Isolation of a Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia"라는 발명의 명칭으로 2002.3.22 출원된 특허 출원 일련번호 10/104,477에 기술되어 있다. 이 당해의 조성물은 유리 B 고리 플라보노이드와 플라반이라는 2종의 특정 화합물의 배합물로 이루어져 있다. 이 조성물은 COX-2 효소를 직접 억제할 뿐만 아니라 5-리폭시게나제 활성도 억제하고 유전자 발현 단계에서 영향을 미치는 것으로 증명되어 있다. 염증 과정을 억제하는 Univestin™의 능력은 유전자 발현, 정제 효소, 세포 기반 분석 및 생체내 동물 모델을 포함하는 4 단계의 시험 모델에서 입증되었다. 이 산물의 효능은 약학적 약물과 다른 표준화된 식물 추출물에 대하여 평가되었다. COX-2의 억제와 관련하여 Univestin™은 일반적으로 이부프로펜 보다 8 내지 10배 효과적이고, 처방시에만 이용가능한 강력한 소염제인 인도메타신과 동등하거나 인도메타신 보다 생체내에서 보다 우수하다. 또한, Univestin™은 염증 반응을 앓고 있는 세포에서 LTB4의 생산을 억제하는 반면, 이부프로펜과 인도메타신은 세포로부터의 방출만을 억제할 수 있다는 점에서 상기 두 약물 보다 우수한 장점을 갖고 있다. 이것은 유리 B 고리 플라보노이드와 COX-2 억제 활성 간의 상관성을 제시하는 최초의 보고서일 것으로 생각된다. 또한, 플라반이 5-LO 경로를 억제한다는 최초의 보고서일 것으로도 생각된다. COX-2와 5-LO 매개의 질병 및 증상을 예방 및 치료하기 위한 상기 2종의 특정 화합물의 신규 배합은 여러 염증 질환 치료에 유용한 신종의 기능식품을 시사한다. 이 산물과 그 성분에 대하여 그 다음 세포 및 동물 모델을 가지고 안전성 평가를 실시하였다. 급성 프로토콜에서, 고농도의 유리 B 고리 플라보노이드 및 플라반과 함께 2 g/kg(인체 1일 용량인 500mg의 20배 이상)의 투여량으로 제공한 제품 Univestin™을 함유하는 각각 표준화된 추출물은 체중 증가, 외모, 행동, 기관의 전반적인 부검 상황, 위와 간의 조직학 및 혈액 연구에서 이상을 나타내지 않았다.
도 22는 기능식품용 제품인 Univestin™의 판매 시이트의 일예를 예시한 것이고, 도 23은 이 제품의 분석 증명서(COA)이다.
실시예 16
기능식품 및 화장품 개발을 위한 PhytoLogix™ 공정
신규한 기능식품 및 화장품 조성물을 개발하기 위한 PhytoLogix™ 공정은 도 24와 25에 개략한 바와 같이 2가지 다른 프로토콜로 예시할 수 있다. 도 24에 예시된 바와 같이, PhytoLogix 개발은 약용 식물 라이브러리에 보관된 수천 가지 약용 식물의 수집에서부터 시작한다. 그 다음, 지표와 용법에 근거한 정보학 데이터베이스를 조사하여 유사한 통상의 용도를 가진 20 내지 50가지 약용 식물을 수득할 수 있다. 이 식물들은 그 다음 실시예 3에 기술된 바와 같이 추출된 다음, 얻어지는 유기 및 수성 추출물을 전술한 바와 같이 선택한 표적과 지표에 근거하여 개발한, 바람직하게는 고 처리량 모델로 개발한 생화학적, 생물학적 및 유전자 발현 표적에 대하여 선별한다. 가능하다면, 잠재적인 적중률을 최대화하기 위하여, 추출물 및/또는 HTP 분획 형태의 전식물 라이브러리를 고처리량 선별(HTS) 시스템을 통해 선별할 수 있다. 양성 적중물을 그 다음 전술한 바와 같이 분별, 데레플리케이션, 분리 및 재분석하여 상기한 실시예들에 예시한 바와 같이 신규한 활성 천연산물을 확인할 수 있다. 그 다음, 활성 프로필과 화학적 핑거프린트에 근거하여 식물 추출물의 표준화 및/또는 농축 및/또는 정제를 계속한다. 표준화된 추출물 및/또는 농축 성분 및/또는 정제 활성 화합물의 시험관내 및 생체내 모델에 대한 2차 효능 분석 및 안전성과 독성 평가를 통해 제한된 수의 제품 후보들의 여러 가능성을 최대로 확인할 수 있다.
도 25에 예시한 바와 같은 PhytoLogix™ 공정은 상기 발견 공정으로부터 약리학적, 화학적 및 안전성 프로필이 제작된 제품 후보들로부터 시작된다. 후보들에 대한 정보의 추가 조사는 지적재산권의 위치, 생산 가능성에 대한 원 식물의 출처확인 및 시장과 규제에 대해 초점을 맞춘다. 이러한 노력을 통해 산물의 신규성, 시장 잠재성 및 추가 개발 계획에 대한 결론을 얻을 수 있을 것이다. 개발의 마지막 단계는 제조 공정, 품질 관리 방법, 원형 제품, 원형 제품에 근거한 효능 및 안전성의 후속 확인, 임상 평가 및 최종 제품 사업 착수로 이루어질 것이다.
제품 발견 및 개발 노력을 진행시키기 위한 현실적인 가이드라인을 포함하여 시간적으로 효율적이고 비용면에서 민감한 Phytologix™을 만들기 위해 이중 공정 관리 메카니즘을 개발하였다. 도 26에 도시한 바와 같이, 상이한 발견 및 개발 공정 단계에서 사용되는 Phytologix™ 직무 체크리스트는 중요한 직무를 수행하고 최종 제품에 중요한 정보와 데이터를 분실하지 않도록 도움을 줄 것이다. 도 27에 예시한 바와 같은 비용과 시간 계산은 프로젝트 담당자에게 전체 공정에 요구되는 노동, 운영비 및 시간을 개략적으로 알 수 있게 해 줄 것이다. 분석의 가장 중요한 부분은 중요한 데이터 결과에서 얻어지는 결론과 프로젝트 진행에 근거한 결정 과정이다.
각종 식물 종 유래의 대표적인 유기 및 수성 추출물
식물명(라틴명) 식물 부분 ID# 함량 유기 추출물 수성 추출물
카타란투스 로세우스(Catharanthus Roseus) (화이트) 전 식물 P0066 60g 5.16g 5.49g
스쿠텔라리아 바이카엔시스 (Scutellaria baicaensis) 뿌리 P0987 60g 9.18g 7.18g
카시아 토라 (Cassia tora) 씨 P0124 60g 10.67g 7.7g
마호니아 포투네이 (Mahonia fortunei) 줄기 P0585 60g 4.17g 2.26g
카에살피니아시에 아프젤리아 (Caesalpiniaceae Afzelia) 잎 P0079 60g 3.21g 4.58g
가데니아 자스미노이즈 (Gardenia jasminoides) 열매 P0012 60g 8.4g 9.64g
알비지아 추리브리신 (Albizzia julibrissin) 나무 껍질 P0430 60g 5.87g 2.56g
매그놀리아 비온디 (Magnolia biondii) 꽃 P0451 60g 5.91g 4.17g
안지오프테리스 오메이엔시스 (Angiopteris Omeiensis) 뿌리줄기 P0095 60g 4.8g 6.78g
여러 식물 재료의 유기, 수성 및 메탄올 추출물의 비교
ID# 라틴명 식물 부분 유기추출물(g) 수성추출물(g) MeOH 추출물(g)
P0490 다프네 젠콰(Daphne genkwa Sieb. Et Zucc.) 꽃 6.178 5.022 1.289
P0491 매그놀리아 오피시날리스 (Magnolia officinalis Rehd. Et Wiis) 줄기 껍질 7.617 2.44 0.485
P0492 포르툴라카 올레라시아 (Portulaca oleracea L.) 전 식물 2.579 6.881 0.577
P0493 탈라크트럼 글랜두브시시뮴(Thalictrum glandubsissimum) 뿌리줄기 5.356 4.919 0.895
P0495 크라타에구스 핀나티피다 (Cragaegus Pinnatifida Bge.) 열매 14.243 8.56 0.39
P0496 페릴라 프로테스칸스 (Perilla Frotescans (L.) Britt) 잎 3.614 5.197 0.919
유기 추출물의 고처리량 분별에 사용되는 비용 분석
품목 공급량 재료비 단위 재료비 비용/smp 총비용/smp 총비용/분획
MeOH 105ml $54/20L $0.0027/ml $0.28 $15.32 $0.16
EtOAc 40ml $174.05/20L $0.0087/ml $0.35
헥산 40ml $116.88/16L $0.0073/ml $0.29
컬럼 $137/20 $6.85 $6.85
심재형 웰 $200/50 $4/개 $4.00
웰 매트 $150/50 $3/개 $3.00
신틸레이션 바이엘(20ml) $128.55/500 $0.26/개 $0.26
주사기 $28.64/100 $0.29/개 $0.29
총 비용: $15.32/샘플, $0.16/분획
수성 추출물의 고처리량 분별에 사용되는 비용 분석
품목 공급량(2 smp) 재료비 단위재료비 비용/smp 총비용/smp 분획당 총비용
MeOH 550ml $54/20L $0.0027/ml $0.75 $10.94 $0.11
THF 100ml $54.70/4L $0.013/ml $0.65
자동샘플주입기 바이엘 2 $32/200 $0.16/개 $0.16
필터 2 $274.34/150 $1.83/개 $1.83
주사기 2 $28.64/100 $0.29/개 $0.29
신틸레이션 바이엘 2 $128.55/500 $0.26/개 $0.26
심재형 웰 2 $200/50 $4/개 $4.00
웰 매트 2 $150/50 $3/개 $3.00
컬럼 2 $400/40smp $10/smp $10.00 $20.26 $0.21
컬럼 가드 2 $205/20smp $10.26/smp $10.26
컬럼 홀더 2 $460/개
총 비용: $31.20/샘플, $0.32/분획
대표 식물 종의 추출물이 나타내는 COX-2 퍼옥시다제 활성 억제
식물 공급원 유기 추출물에 의한 COX-2 억제율 수성 추출물에 의한 COX-2 억제율
스쿠텔라리아 오르토칼릭스(뿌리) 55% 77%
스쿠텔라리아 바이카엔시스(뿌리) 75% 0%
데스모듐 샘부엔스(전 식물) 55% 39%
유칼럽투스 글로불러스(잎) 30% 10%
뮤리카 나나(잎) 90% 0%
인간 및 양의 COX-2 및 COX-1의 IC50값
식물 공급원 인간 COX-2 IC50(㎍/ml) 양의 COX-2 IC50(㎍/ml) 양의 COX-1 IC50(㎍/ml)
스쿠텔라리아 오르토칼릭스(뿌리) ND 10 10
스쿠텔라리아 바이칼렌시스(뿌리) 30 20 20
스쿠텔라리아 라테리플로라(전식물) 20 30 80
유칼럽투스 글로불러스(잎) ND 50 50
뮤리카 나나(잎) 5 6 7

Claims (71)

  1. (a) 생물학적 샘플을 동정 및 수집하는 단계;
    (b) 2 용매계 추출 절차를 이용하여 상기 샘플을 추출하는 단계;
    (c) 이 추출물을 2가지 다른 고처리량(HTP) 분별 방법으로 분리하고, 동시에 각 HTP 분획의 활성을 측정하는 단계;
    (d) 현존하는 화합물을 동정하기 위하여 활성 분획을 데레플리케이션(dereplication)하는 단계; 및
    (e) 단계 (d)에서 얻은 각 신규 화합물의 지표(indication), 약리학적 프로필 및 안전성 프로필을 제작하는 단계를 포함하여 신규의 치료학적 약제, 기능식품용 및 화장용 제제를 발견 및 개발하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 식물, 미생물, 진균, 광물, 해양생물, 동물 또는 인간 기원의 재료로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 생물학적 샘플이 식물인 것이 특징인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수집된 샘플 양이 1g 내지 10000g 사이인 것이 특징인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 샘플이 보고된 약용법이나 작용 기작에 근거하여 선택되는 것이 특징인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 수집된 각 샘플에 대해 수집 양식을 작성하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 수집 양식이 라틴명, 분포, 수집 위치, 치료 정보, 통상적인 제법, 식물 동정 및 공개된 참고문헌을 비롯하여 샘플에 대한 특정 정보를 포함하는 것이 특징인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 수집 양식에 기재된 정보가 데이터베이스로 옮겨지는 것이 특징인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 데이터베이스가 주문제작된 액세스(Access), 오라클(Oracle), 포스트그레스클(Postgresql), 미스클(Mysql) 및 세큘(Sequl.)로 구성된 데이터베이스 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 데이터베이스에 있는 정보가 각각의 양식을 사용하여 입력된 각 표에 저장된 것이 특징인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 데이터베이스에 저장된 정보와 데이터에 접근하기 위해 특정 매크로와 질의를 고안하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 수집된 각 샘플에 대한 2장 이상의 표본 증명서를 작성하는 단계를 추가로 포함하되, 이 표본 증명서가 완전 생식 기관을 비롯하여 천연 및/또는 화학적으로 건조 및/또는 보존된 샘플 전체를 포함하고 각 증명서 표본에 확인용 분류 양식이 첨부된 것임이 특징인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (b)의 용매 추출 절차가 추가로
    (a) 적당한 양의 샘플을 분쇄하는 단계;
    (b) 분쇄된 샘플을 2가지 유기 용매 조합(이 때, 조합은 저극성 용매와 고극성 용매로 구성됨)으로 추출하는 단계;
    (c) 유기 용매 추출 후 샘플을 건조시키는 단계;
    (d) 건조된 샘플을 수성 용매로 추출하는 단계; 및
    (e) 추출 후마다 용매를 증발시키고 추출물을 분리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 샘플 양이 1g 내지 1000g 사이에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 저극성은 탄소원자수가 6 내지 10개인 알칸, 탄소원자수가 1 내지 4개이고 각 탄소원자가 1 내지 4개의 할로겐 원자를 갖는 할로겐화 알칸, 화학식 R'COOR"(이 때, R'는 탄소원자수가 1 내지 6개 사이인 알킬 기 중에서 선택되고 R"는 탄소원자수가 1 내지 8개 사이인 알킬 기 중에서 선택되는 것이다)를 갖는 에스테르 및 탄소원자수가 3 내지 12개 사이인 케톤으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 저극성의 용매는 염화메틸렌, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 고극성 용매는 DMSO, THF 및 알코올(이 때, 알코올을 1 내지 8개의 탄소를 갖는 것이다)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 두 추출 단계에 사용된 용매의 양이 추출된 샘플 중량의 1 내지 10배 비인 것이 특징인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 추출은 진탕, 초음파처리, 환류, 교반, 가압 혼합 및 여과로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 수득되는 추출물은 생물검정을 위하여
    (a) 칭량한 뒤 유기 추출물을 용매에 용해시키고;
    (b) 칭량한 뒤 수성 추출물을 용매에 용해시키며;
    (c) 각 추출물 용액을 샘플 마스터 플레이트의 각 셀로 이동시키는 단계를 포함하는 방법으로 준비해두는 것이 특징인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 유기 추출물을 용해시키는 용매가 DMSO, DMF, THF, 탄소원자수가 3 내지 10개인 케톤 및 탄소원자수가 1 내지 5개인 알코올로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 수성 추출물을 용해시키는 용매가 DMSO, DMF, THF, 탄소원자수가 3 내지 10개인 케톤 및 탄소원자수가 1 내지 5개인 알코올로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 각 용액 중의 추출물 농도가 용매 1ml 당 0.01mg 내지 1000mg 범위인 것이 특징인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 샘플 마스터 플레이트가 96웰, 192웰, 384웰, 576웰, 768웰, 960웰, 1152웰, 1344웰 및 1536웰 플레이트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 추출물의 분리가
    (a) 평행 크로마토그래피 시스템 또는 고처리량 정제(HTP) 시스템을 사용하는 단계;
    (b) 예비충진된 정상상 컬럼으로 유기 추출물을 분리하는 단계;
    (c) 예비충진된 역상 컬럼으로 수성 추출물을 분리하는 단계;
    (d) 용출물을 검출기로 검출하는 단계;
    (e) 분획을 수집하는 단계; 및
    (f) 용매를 증발시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 크로마토그래피 시스템이 2 내지 4개의 용매 전달 펌프, 용매 혼합기 및 적당한 자동 라인 변환기로 구성되는 것이 특징인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 크로마토그래피가 상압, 저, 중, 고 용매 압력 하에 실시되는 것이 특징인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 크로마토그래피가 상온 또는 20 내지 80℃의 온도에서 실시되는 것이 특징인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 정상상 컬럼은 실리카겔, 알루미나 및 아미노 프로필, 시아노 프로필, 디올 플로리실 또는 폴리아미드, 이온 교환 수지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 수지로 충진되는 것이 특징인 방법.
  31. 제26항에 있어서, 역상 컬럼은 C-2, C-4, C-8, C-18, LH-20, XAD-4, XAD-16 및 폴리스티렌-디비닐 벤젠계 수지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 수지로 충진되는 것이 특징인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼에 충진되는 수지의 입자 크기가 10 내지 200 ㎛ 사이인 것이 특징인 방법.
  33. 제26항에 있어서, 크로마토그래피가 1 내지 500g의 수지로 충진되는 것이 특징인 방법.
  34. 제26항에 있어서, 정상상 크로마토그래피 컬럼은 탄소원자수가 6 내지 10개인 알칸, 화학식 R1COOR2(여기에서 R1은 탄소원자수가 1 내지 5개 사이인 알킬기 중에서 선택되고 R2는 탄소원자수가 1 내지 6개 사이인 알킬기 중에서 선택된다)으로 표시되는 유기 에스테르, 및 화학식 R3OH(여기에서 R3은 탄소원자수가 1 내지 6개사이인 알킬기임)로 표시되는 알코올 중에서 선택되는 3종의 유기 용매 조합물로 용출되는 것이 특징인 방법.
  35. 제26항에 있어서, 역상 크로마토그래피 컬럼은 2종의 용매 조합물, 즉 탈이온수(DI)와 탄소원자수가 1 내지 4개인 알코올, 아세토니트릴, THF 또는 탄소원자수가 3 내지 12개인 케톤으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 용매로 용출되는 것이 특징인 방법.
  36. 제26항에 있어서, 검출기는 100 내지 1000 nm 사이의 단파장, 연속 파장 또는 광대역 파장을 가진 단일 또는 이중 채널로 이루어진 자외선(UV)/가시광선 검출기인 것이 특징인 방법.
  37. 제26항에 있어서, 검출기는 전자 분무 이온화 또는 초음파 분무 이온화 챔버; 이온 트랩 또는 양성이나 음성 방식의 단일 또는 삼중 사중 질량 검출부로 이루어진 MS 검출기인 것이 특징인 방법.
  38. 제26항에 있어서, 검출기는 양성자 또는 탄소 탐침으로 이루어진 핵자기공명(NMR) 검출기인 것이 특징인 방법.
  39. 제26항에 있어서, 검출기는 반사 지수(RI) 검출기인 것이 특징인 방법.
  40. 제26항에 있어서, 검출기는 광산란 검출기(LSD)인 것이 특징인 방법.
  41. 제26항에 있어서, 단계 (d) 후의 생물검정을 위한 추출물 분획을
    (a) 유기 추출물 유래의 분획을 용매에 용해시키는 단계;
    (b) 수성 추출물 유래의 분획을 용매에 용해시키는 단계; 및
    (c) 분획의 용액을 샘플 플레이트로 이동시키는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 유기 추출물과 수성 추출물 유래의 분획을 용해시키기 위한 용매는 DMSO, DMF, THF, 탄소원자수가 3 내지 10개인 케톤, 탄소원자수가 1 내지 5개인 알코올 및 2 내지 3종의 용매 조합물을 포함하는 그룹 중에서 각각 선택되는 것이 특징인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 용액 중의 추출물 농도가 용매 1ml 당 0.001 mg 내지 100 mg 사이인 것이 특징인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 샘플 플레이트가 96웰, 192웰, 384웰, 576웰, 768웰, 960웰, 1152웰, 1344웰 및 1536웰 플레이트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  45. 제1항에 있어서, 활성 분획의 데레플리케이션은
    (a) 샘플의 활성 데이터를 수집하는 단계;
    (b) 샘플의 물리적 성질, 분광기 및 구조 데이터를 수집하는 단계;
    (c) 수집한 데이터를 분석하는 단계;
    (d) 샘플의 성질에 대해 상용 데이터베이스에서 조사하는 단계; 및
    (e) 활성 분획에 관한 결론을 수득하는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 측정된 활성이 효소 억제, 수용체 결합, 유전자 발현, 세포 기능 조절, 단백질 생산, 동물 기능 조절 및 동물 생리학적, 신경학적 및 행동 기능 조절, 동물 질병 모델 조작과 다른 생물학적 기능의 측정법으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 활성 데이터는 추출물, 추출물 분획, 정제 화합물, 반합성 화합물 및 합성 화합물로부터 수집되는 것이 특징인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 데레플리케이션 공정에서 수집되는 물리적 성질 데이터가 흡착이나 UV/VIS 변화를 기초로 하는 크로마토그램으로부터 얻어지는 잔류 시간, 굴절 지수, 레이저 광산란 패턴, 용매 용출 부피, 질량, pH, 용해성 및 log P 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 수집된 분광기 정보가 UV/VIS 스펙트럼, 분자 이온과 단편 이온을 수반하는 질량 스펙트럼, NMR 스펙트럼 및 광산란 스펙트럼 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 구조 정보는 질량 단편화 패턴 및 딸이온/손녀 이온의 질량 스펙트럼; 양성자, 탄소, 인 및 1차원 및 2차원 핵자기 공명 분광기 데이터 유래의 다른 원소들의 화학적 이동; 적외선 스펙트럼 및 UV 흡수 스펙트럼 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 물리적 성질, 분광기 데이터 및 구조 데이터가 추출물의 분리 동안에 용출물 분획을 1 이상의 검출기로 분할시킴으로써 수집되는 것이 특징인 방법.
  52. 제45항에 있어서, 물리적 성질, 분광기 데이터 및 구조 데이터가 각 분획의 분석으로부터 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 수집되는 것임이 특징인 방법.
  53. 제52항에 있어서, HPLC가 2종 용매 펌프, 용매 혼합기, 수지 함유 스테인레스 강철 컬럼, 컬럼 오븐 및 1종 이상의 검출기로 구성되는 것이 특징인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 컬럼이 실리카겔, 알루미나 및 아미노 프로필, 시아노 프로필, 디올 플로리실 또는 폴리아미드, 이온 교환 수지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 정상 상 수지로 충진되는 것이 특징인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 컬럼이 C-2, C-4, C-8, C-18, LH-20, XAD-4, XAD-16 및 폴리스티렌-디비닐 벤젠계 수지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 역상 수지로 충진되는 것이 특징인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 수지의 입자 크기가 1 내지 100 ㎛ 사이인 것이 특징인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼이 0.1 내지 50g의 수지를 포함하는 것이 특징인 방법.
  58. 제45항에 있어서, 상용 데이터베이스가 천연산물 사전(the Dictionary of Natural Products), 화학 초록 서비스 등록 파일(Chemical Abstracts Service's Registration File), NAPROLERT, MEDLINE, NERAC, DEREP 및 생물활성 천연산물 데이터베이스(Bioactive Natural Product Database)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  59. 제1항에 있어서, 신규 성분이 생물검정 의존성 분리, 정제 및 동정 공정에 의해 동정되는 것이 특징인 방법.
  60. 제1항에 있어서, 약리학적 프로필이 생물학적 시스템, 생화학적 물질 및 유전자 표적의 활성 및 기능을 조절하는 능력인 것이 특징인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 활성 및 기능을 조절하는 능력이 효소 억제, 수용체 결합, 유전자 발현, 세포 기능 조절, 단백질 생산, 동물 기능 조절 및 동물 질병 모델 조작으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 생물학적 기능의 측정으로부터 결정되는 것이 특징인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 유전자 표적이 질병이나 대사 또는 생리학적 관련 유전자의 발현인 것이 특징인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 유전자 또는 이의 일부가 인간 기원인 것이 특징인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 질병 관련 유전자가 심혈관 질병, 호흡기 질병, 신장 질병, 간 질병, 췌장 질병, 위장 질병, 혈액 질병, 대사 질병, 신경 질병, 면역 질병, 생식 시스템의 질병, 감염성 질병 및 골격 질병으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 질병과 관련이 있는 것이 특징인 방법.
  65. 제62항에 있어서, 질병 관련 유전자가 염증, 면역반응, 에너지 대사, 상처 치유, 알레르기, 폐경, 노화, 산화적 스트레스 및 암으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 증상과 관련이 있는 것이 특징인 방법.
  66. 제62항에 있어서, 질병, 대사 또는 생리학적 관련 유전자의 발현이 이 유전자의 메신저 RNA의 수준에 의해 측정되는 것이 특징인 방법.
  67. 제62항에 있어서, 질병, 대사 또는 생리학적 관련 유전자의 발현이 노던 블롯 분석, 점 블롯 하이브리드화, DNA 마이크로어레이 하이브리드화 및 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(gPCR)으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 방법으로 측정되는 것이 특징인 방법.
  68. 제1항에 있어서, 안전성 프로필이 상당량의 화합물을 투여하는 동안에 생물학적 시스템, 생화학적 물질 및 분자 생물학 표적의 정상 활성 및 기능을 유지하는 능력을 측정함으로써 결정되는 것이 특징인 방법.
  69. 제1항에 있어서, 상업적으로 존속가능한 산물로 확인된 신규 화합물을 개발하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
  70. 제13항에 있어서, 수성 용매가 물, 산성 물, 염기성 물, 및 완충 용액으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 산성 물, 염기성 물 및 완충 용액이 pH 범위가 1 내지 14 사이인 유기 또는 무기 산, 염기 및 염 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
KR10-2003-7016797A 2001-06-27 2002-06-27 치료제 발견을 위해 천연산물 라이브러리를 제조, 선별 및데레플리케이션하는 방법 KR20040010776A (ko)

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