CN103529145B - 水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法。其主要包括以下步骤：水样通过固相萃取柱进行富集，萃取柱负压真空干燥；依次用有机溶剂洗脱萃取柱，将洗脱液浓缩，定容，一半用于拟/抗雄激素总毒性测试，并基于标准物质EC50与稀释倍数计算总毒性当量，另一半用于有毒样品的主要致毒物质鉴别；基于常见拟/抗雄激素活性毒物的质谱特征与毒性当量建立毒物质量平衡数据库，进而基于定性分析与定量分析的结果，进行毒性当量与毒性贡献率计算，确定主要致毒物质。本发明样品需求量少，试剂消耗少，成本低，步骤少，却能较快速的鉴别不同污染水平水体中的拟/抗雄激素毒物。
Description
技术领域
本发明涉及一种不同污染程度水体拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别的前处理与测定方法，更具体地说，是一种结合了化学分析与毒性当量计算的方法，即针对含有常见拟/抗雄激素干扰活性物质的复杂环境水样同柱萃取污染物再基于质量平衡数据库，利用建立的毒性当量计算方法与GC-MSMS的SRM扫描模式进行毒物筛查的快速毒性来源的鉴别方法。
背景技术
随着经济的发展和人们生活水平的不断提高，在工、农业生产及生活、消费过程中，大量的有机污染物被不断排放到水体环境中，造成环境有机污染日趋严重。这些有机污染物中的很多种类都被证明具有内分泌干扰活性，特别是雄激素干扰效应，称为环境雄激素干扰毒物，过去对环境雄激素干扰毒物的监测多采用将化学分析和毒性鉴定手段结合起来的方法，即在毒性测试的基础上用化学分析的方法对有毒组分中的主要物质进行定性分析，该方法仅基于分级分离技术，由于缺乏对雄激素干扰效应潜在致毒物质的了解，不能进行质量平衡分析，只能靠穷尽法将有机提取物分为更多组分，以达到定性识别的目的，样品甚至需被分为近百组分，因此该过程需要大量环境样品，特别是对于污染程度不高的水环境样品的需求量甚至可以达到100L，造成实验步骤繁琐，相关毒物定性鉴别不确定性高，工作难度大。
《Environmental Science&Technology》2009年第43期上8066页公开了一篇有关北海近海岸带地区水样有机提取物中的雄激素活性物质鉴别的文章《Effect-Directed Identification ofNaphthenic Acids As Important in Vitro Xeno-Estrogens and Anti-Androgens in North Sea OffshoreProduced Water Discharges》，其中叙述的方法是用C18的固相萃取柱富集水中的有机污染物，然后利用正己烷进行洗脱，再利用高效液相色谱分离富集液为31个组分，对不同的组分进行毒性测试，对有毒性效应的组分进行定性分析，研究发现烷基酚是抗雄激素活性的主要来源，但定性出来的物质对总毒性的毒性贡献率不足一半。该方法相对于以前的方法进步不少，可以同时提取水中的有机物并做到雄激素活性鉴定及毒物追踪，但该方法使用单一的正己烷作为固相萃取柱的洗脱溶剂使得实验对于极性物质的回收率低，且其运用C18作为填料对于极性物质的富集性能差，特别是该方法利用高效液相色谱将提取液分为31个组分，所需水量大，耗时久，只能用于高污染水体的分析，无法应用于人们日益关注的低污染水体中有机物的提取及毒物的快速鉴别，且鉴别出的物质对于总毒性贡献较小，不是主要致毒物质。
通过检索发现国内外文献没有结合毒性测试与化学分析，利用雄激素干扰物质量平衡数据库进行内分泌干扰毒物鉴别的方法报道。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有环境水体中关键雄激素干扰物鉴别困难、成本高的问题，本发明提供一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，可用于环境水样中内分泌干扰毒物鉴定与毒性来源分析。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，其步骤为：
（1）取待测水样，水样通过滤膜过滤后，通过固相萃取柱进行富集，萃取完毕后，萃取柱负压真空干燥；
（2）使用有机溶剂洗脱步骤（1）中的萃取柱，将洗脱液浓缩，然后用有机溶剂定容，取其中一部分洗脱液，将其中的溶剂替换为二甲基亚砜用于拟/抗雄激素活性总毒性测试，建立公式（1）：
TEQ即环境样品毒性当量计算法计算的总毒性当量，对于有毒性效应的点位即与对照毒性效应具有显著性差异的点位（p<0.01），另取一部分富集液用于后续的关键毒物鉴别，其中EC50为半最大效应浓度；
（3）整理公开资料中的常见拟雄激素活性物质与常见抗雄激素活性物质，建立的标准物质毒性当量计算公式（2）：
化合物的REP表示对应的毒性当量，计算各雄激素毒物毒性当量；利用GC-MSMS逐一测定其特征离子，建立质谱特征数据库；结合化合物的毒性当量与质谱特征数据库，建立毒物质量平衡数据库；
（4）将毒物质量平衡数据库信息输入GC-MSMS的SRM快速扫描模式，建立目标污染物特征离子定性扫描方法对有毒样品进行化学分析，基于定性分析与定量分析的结果，计算有毒样品中各拟雄激素活性毒物的浓度，将浓度与质量平衡数据库中对应的毒性当量相乘得到基于化学分析的毒性当量，化学分析的毒性当量占总毒性当量的比例为毒性贡献率，进而确定主要致毒物质。
优选地，所述的步骤（1）中采用HLB串联柱作为固相萃取柱；测试水样采用2-5L，水样通过固相萃取柱的速度为3～5mL/min，固相萃取柱的参数为500mg，6mL；1L待测水样/柱。
所述的步骤（2）中的有机溶剂为正己烷、二氯甲烷、丙酮及甲醇，均为农残级。步骤（2）中采用的正己烷的体积为富集水样体积的0.002到0.006倍，甲醇和二氯甲烷共同使用时，其混合溶液的比例为2-4:1，甲醇和二氯甲烷总体积为富集水样体积的0.004到0.008倍，丙酮的体积为富集水样体积的0.002到0.004倍，这个范围内最佳。
优选地，所述的步骤（2）得到的有机提取物可先用旋转蒸发仪浓缩至1mL左右，再用N2缓缓吹扫溶剂，最后二甲基亚砜定容用于毒性鉴定，或用二氯甲烷定容后用于进一步的定性及定量化学分析；毒性当量计算法选择双氢睾酮（Dihydrotestosterone）与氟他胺(Flutamide)分别做为拟雄激素与抗雄激素活性的标准物质。浓缩是将洗脱液分别浓缩至1～2mL，定容是二氯甲烷定容至2mL，其中1mL溶剂替换为二甲基亚砜用于拟/抗雄激素活性总毒性测试。
优选地，所述的步骤（3）中数据库相关信息包括21种常见拟雄激素活性物质与124种常见抗雄激素活性物质的化合物名称、CAS NO，毒性当量与质谱检测特征离子/离子对。
优选地，所述的步骤（4）中基于GC-MSMS的SRM模式定性扫描21种拟雄激素活性物质与124种抗雄激素活性物质，以对具有毒性效应的样品进行定性与定量分析。
本方案的原理：由于环境水样中雄激素干扰物浓度相对较低，必须进行必要的提取浓缩，而且要结合化学分析与毒性测试利用尽量少量的样品进行毒物鉴别。本方法采用固相萃取进行水样中有机物的富集，选用固相萃取柱串联富集，用少量不同极性有机溶剂将分析物从固定相柱上洗脱下来，其中一半进行内分泌干扰效应测定，另一半进行关键毒物鉴别；同时建立已有报道的雄激素干扰物质量平衡数据库，包括基于质谱检测的特征离子等相关信息，并基于GC-MSMS建立目标污染物SRM模式定性快速分析方法，结合拟/抗雄激素化合物毒性当量，对有毒性效应的样品进行化学定性分析与定量分析，基于毒性加和原理计算毒性当量与毒性贡献，以达到关键毒物鉴别的目的。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
（1）本发明提供了一种水中关键雄激素干扰毒物鉴别方法，试剂消耗少，成本低，步骤少却能较好识别不同污染水平水体中的关键雄激素干扰物，可针对不同极性的有机污染物进行富集；
（2）本发明针对典型雄激素干扰物（酞酸酯类、烷基酚类、农药类等）回收率在76%以上，并对拟雄激素活性和抗雄激素活性两种不同活性效应检测，致毒物质鉴定中同一批次分别定性鉴定21种典型拟雄激素活性物质与124种典型抗雄激素活性物质，定性检测限可以达到50ppb；
（3）本发明毒物定量鉴定后直接进行毒性当量计算，识别主要致毒物质，该技术可以不必进行大量样品采集与分级分离，仅通过质量平衡数据库将毒性测试与化学分析结合起来，发现致毒组分，缩小仪器分析追踪有机污染物的范围，能够较快地找出关键毒物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
选择具有代表性的不同性质的典型雄激素干扰物，准确配制含有2种酞酸酯（Di-n-butylphthalate,Di-2-ethylhexyl phthalate，浓度均为100ng/L）、10种农药(α-BHC,β-BHC,γ-BHC,δ-BHC,o,p'-DDE,p,p'-DDE,o,p'-DDD,o,p'-DDD,o,p'-DDT,p,p'-DDT,浓度均为50ng/L)、3种烷基酚（壬基酚,辛基酚和双酚A，浓度均为200ng/L）的水样5L，萃取柱使用前依次用10mL正己烷、5mL二氯甲烷、5mL丙酮和10mL蒸馏水活化，负压真空干燥。以4mL/min的速度通过串联的HLB固相萃取柱富集。随后用16mL体积比为1:1正己烷和二氯甲烷进行洗脱，控制流速为2mL/min，每2mL收集洗脱液，分别在轻柔氮气流中吹至0.1mL，使用GC-MSMS进行测定。分析条件如下：
程序升温：起始温度80℃，以20℃/min的速率升温到165℃，再以2℃/min的速率升温到220℃，以4℃/min的速率升温到280℃，保持6min；
进样口温度：280℃，不分流进样，1.0mL/min；色谱柱：DB-5,30m×250μm×0.25μm；
进样量：1μL；不分流进样；
离子源温度：250℃；灯丝电流：50μA；Q2碰撞气：Ar（1.2mTorr）；离子化模式：EI（Closed EI）；传输线：280℃；
观察发现，正己烷体积为10mL时农药的回收率范围为81％以上，当溶剂体积再增加时回收率无显著提高。
实施例2
采用实施例1中的方法配置水样，过滤后以4mL/min的速度通过HLB固相萃取柱富集，柱负压真空干燥后用氮气吹干。随后使用10mL体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷混合溶液进行洗脱，接着用8mL体积比为1:1的二氯甲烷和丙酮的混合液洗脱，控制流速为2mL/min，每2mL收集洗脱液，分别在轻柔氮气流中吹至0.1mL，分别使用GC-MSMS进行酞酸酯类物质测定，烷基酚化合物用HPLC分析：
极性化合物类HPLC(DVD/FLD)
流动相：0-5min，80％甲醇&20%水；5-11min，100％甲醇；流量：1ml/min；柱温：30℃。
检测器：TBBPA:UVD检测器，检测波长λ＝210nm；
BPA:FLD检测器，0-5min，λEx＝228nm，λEm＝315nm；
OP,NP:FLD检测器，7-11min，λEx＝226nm，λEm＝314nm。
分析结果显示，二氯甲烷：丙酮（体积比1：1）8mL时便可将酞酸酯和烷基酚洗脱下来。
查阅文献，对已有报道的具有拟雄激素活性与抗雄激素活性的物质进行总结，共有21种常见拟雄激素活性物质与124种常见抗雄激素活性物质。整理其拟雄激素与抗雄激素活性效应并利用如下方法计算活性当量：
评价拟雄激素活性时的标准物质采用双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT），抗雄激素活性的标准物质选用氟他胺(Flutamide)。化合物的相对影响因子计算公式如下：
评估环境样品毒性大小时计算环境样品的毒性当量（TEQ），表示为标准物质的EC50除以环境样品能引起与标准物质EC50相同毒性效应的浓缩倍数。其公式如下：
环境中检测到的化合物的相对影响因子为环境中化合物的浓度乘以化合物的相对影响因子，所有化合物的总相对影响因子计算公式如下：
总相对因子ΣREP=∑[（化合物i浓度）×（REPi）]
化合物的相对拟雄激素活性表示为针对DHT的毒性当量，以EC50计算出的毒性当量表示为DHT-REP（EC50）；化合物的相对抗雄激素活性表示为针对氟他胺的毒性当量，以EC20和EC50计算出的毒性当量表示为氟他胺-REP（EC20）和氟他胺-REP（EC50）。
评估环境样品毒性的主要贡献者时，需比较环境样品的TEQ和化合物的相对影响因子，当TEQ=ΣREP时，说明所测化合物能完全解释毒性的来源，是毒性的主要贡献者。当TEQ>ΣREP时，说明所检测到的化合物不能完全解释毒性的来源，还有未检测到的化合物对环境样品的毒性有贡献或者检测到的化合物之间存在协同作用。当TEQ<ΣREP时，说明通过计算得到的化合物的毒性当量比实测的环境样品的毒性当量大，说明测得的各化合物之间可能存在拮抗作用。所得到的化合物毒性当量如表1和表2所示。
针对已筛选的具有拟雄激素活性与抗雄激素活性的物质进行GC-MSMS分析，确定特征离子（对），完善雄激素干扰物质量平衡数据库。同实施例1，所不同的GC-MSMS分析方法如下：
程序升温：起始温度80℃，升温速率20℃/min到165℃，再以2℃/min升温到220℃，以4℃/min升温到280℃，保持6min；
进样口温度：280℃，不分流进样，1.0mL/min；色谱柱：DB-5,30m×250μm×0.25μm；
进样量：1μL；不分流进样；
离子源温度：250℃；灯丝电流：50μA；Q2碰撞气：Ar（1.2mTorr）；离子化模式：EI（Closed EI）；传输线：280℃；
雄激素干扰物质量平衡数据库如表1和表2：
表1拟雄激素干扰物质量平衡数据库
表2抗雄激素干扰物质量平衡数据库
在离子（对）数据库基础上建立GC-MSMS的SRM模式特征离子（对）定性扫描方法。分别将目标化合物作为2次扫描，将目标化合物作为4次扫描，将目标化合物作为6次扫描，采用以下模式：
程序升温：起始温度80℃，以20℃/min的速率升温到165℃，再以2℃/min的速率升温到220℃，以4℃/min的速率升温到280℃，保持6min；
进样口温度：280℃，不分流进样，1.0mL/min；色谱柱：DB-5,30m×250μm×0.25μm；
进样量：1μL；不分流进样；
离子源温度：250℃；灯丝电流：50μA；Q2碰撞气：Ar（1.2mTorr）；离子化模式：EI（Closed EI）；传输线：280℃；
将目标化合物作为2次扫描，有55%化合物检出，检出限为100ppb到2ppm；将目标化合物作为4次扫描，有100%化合物检出，检出限有明显增加，为50ppb到500ppb；将目标化合物作为6次扫描，，有100%化合物检出，检测限没有明显改变。因此，将化合物作为四次扫描，既可检出典型目标物又可以得到较好的检测限。
实施例3
以已知目标污染物准确配制含有2种酞酸酯（Di-n-butyl phthalate,Di-2-ethylhexylphthalate，浓度均为100ng/L）、10种农药(α-BHC,β-BHC,γ-BHC,δ-BHC,o,p'-DDE,p,p'-DDE,o,p'-DDD,o,p'-DDD,o,p'-DDT,p,p'-DDT,浓度均为50ng/L)、3种烷基酚（壬基酚，辛基酚和双酚A，浓度均为200ng/L）的水样5L，以5mL/min的速度通过串联的HLB固相萃取柱富集。萃取柱使用前分别用5mL正己烷、5mL二氯甲烷、5mL甲醇、5mL丙酮和10mL蒸馏水活化。富集后萃取柱负压真空干燥，以脱去大部分水分，接着用氮气吹干。随后用10mL体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷进行洗脱，再以8mL的提交比为1:1的二氯甲烷和丙酮洗脱，控制流速为2mL/min，收集洗脱液并混合，在轻柔氮气流中吹至2mL。取1mL将溶剂替换为DMSO进行受体报告基因拟雄激素活性与抗雄激素活性测试，计算毒性当量。其余1mL利用GC-MSMS进行定性扫描，并对扫描出的污染物进行定量分析，基于定量分析结果进行毒性当量计算。比较得到化学分析得到的毒性当量为毒性测试得到的毒性当量的95%。
实施例4
在镇江化学工业园污水处理厂采集出水2L，以3mL/min的速度通过串联的HLB固相萃取柱进行现场富集，带回实验室。萃取柱使用前分别用5mL正己烷、5mL二氯甲烷、5mL丙酮和10ml蒸馏水活化。富集后萃取柱负压真空干燥，以脱去大部分水分，接着用氮气吹干，冷冻保存。采用实施例3中的方法进行有机物富集，随后用10mL体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷进行洗脱，再以8mL甲醇和4mL二氯甲烷共二氯甲烷混合溶液洗脱，控制流速为2mL/min，收集洗脱液并混合，在轻柔氮气流中吹至2mL。将富集后的有机溶剂等体积分为两份，分别用于总毒性测试（A组）与化学分析（B组）。对A组利用报告基因试验进行毒性测试，发现出水有机提取物具有强的抗雄激素活性达到108.5ng/L当量浓度的氟他胺。为了对毒性进行追踪，对B组提取物进行化学分析，采用实施例6中的方法，分4组定性测定目标污染物。发现23种污染物可以定性测出，包括Di-n-butyl phthalate、壬基酚和辛基酚等，进而对其进行定量分析，结合质量平衡运算的结果表明壬基酚和辛基酚的毒性贡献率分别为53%和42%，为毒性的主要来源。即污水处理厂出水中主要雄激素干扰毒物为壬基酚和辛基酚。
实施例5
在南京城南自来水厂采集进水5L，采用实施例4中的方法进行水样的富集及分析等。通过总毒性的测试发现水样有机提取物具有弱的抗雄激素活性。利用建立的SRM模式进行定性分析，并进而进行定量分析，利用建立的质量平衡数据库进行毒性当量计算，发现Di-n-propylphthalate的贡献率达到87.5%，即Di-n-propyl phthalate为主要致毒物质。
Claims (6)
1.一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，其步骤为：
（1）取待测水样，水样通过滤膜过滤后，通过固相萃取柱进行富集，萃取柱使用前分别用正己烷、二氯甲烷、丙酮、甲醇和蒸馏水活化，萃取完毕后，萃取柱负压真空干燥；
（2）使用有机溶剂洗脱步骤（1）中的萃取柱，将洗脱液浓缩，然后用有机溶剂定容，取其中一部分洗脱液，将其中的溶剂替换为二甲基亚砜用于拟/抗雄激素活性总毒性测试，建立公式（1）：
TEQ即环境样品毒性当量计算法计算的总毒性当量，对于有毒性效应的点位即与对照毒性效应具有显著性差异的点位，另取一部分富集液用于后续的关键毒物鉴别；
（3）整理公开资料中的常见拟雄激素活性物质与常见抗雄激素活性物质，建立的标准物质毒性当量计算公式（2）：
化合物的REP表示对应的毒性当量，计算各雄激素毒物毒性当量；利用GC-MSMS逐一测定其特征离子，建立质谱特征数据库；结合化合物的毒性当量与质谱特征数据库，建立毒物质量平衡数据库；
（4）将毒物质量平衡数据库信息输入GC-MSMS的SRM快速扫描模式，建立目标污染物特征离子定性扫描方法对有毒样品进行化学分析，基于定性分析与定量分析的结果，计算有毒样品中各拟雄激素活性毒物的浓度，将浓度与质量平衡数据库中对应的毒性当量相乘得到基于化学分析的毒性当量，化学分析的毒性当量占总毒性当量的比例为毒性贡献率，进而确定主要致毒物质。
2.根据权利要求1所述的一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，其特征在于：所述的步骤（1）中采用HLB串联柱作为固相萃取柱。
3.根据权利要求1所述的一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，其特征在于：所述的步骤（2）得到的有机提取物可先用旋转蒸发仪浓缩至1mL左右，再用N2缓缓吹扫溶剂，最后加入二甲基亚砜定容用于毒性鉴定或用二氯甲烷定容后用于进一步的定性及定量化学分析；毒性当量计算法选择双氢睾酮与氟他胺分别做为拟雄激素与抗雄激素活性的标准物质。
4.根据权利要求1所述的一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，其特征在于：所述的步骤（2）中的有机溶剂为正己烷、二氯甲烷、丙酮及甲醇，均为农残级。
5.根据权利要求1所述的一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，其特征在于：所述的步骤（3）中数据库相关信息包括21种常见拟雄激素活性物质与124种常见抗雄激素活性物质的化合物名称、CAS NO、毒性当量与质谱检测特征离子/离子对。
6.根据权利要求1所述的一种水样中关键拟/抗雄激素干扰毒物快速鉴别方法，其特征在于：所述的步骤（4）中基于GC-MSMS的SRM模式定性扫描21种拟雄激素活性物质与124种抗雄激素活性物质，以对具有毒性效应的样品进行定性与定量分析。
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