CN115754027A - 一种沙芬酰胺有关物质的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种沙芬酰胺有关物质的分析方法，该方法采用反相高效液相色谱法，分离测定了沙芬酰胺和其位置异构体的含量。本方法分离度良好，溶剂不干扰检测，方法专属性良好，且该检测方法简便﹑快速﹑准确﹑灵敏度高﹑重复性好以及准确度好，可以快速准确地进行沙芬酰胺有关物质的含量测定，保证本品质量的可控性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种沙芬酰胺有关物质的分析方法。
背景技术
沙芬酰胺甲磺酸盐(Safinamide mesilate)，化学名为(S)-2-[4-(3-氟苄氧基)苄胺基]丙酰胺甲磺酸盐，结构如式I所示，是由Newron制药公司研发的抗帕金森病药。本品具有多种作用机制，不仅可高选择性及可逆性抑制单胺氧化酶B(MAO-B)，还可以抑制多巴胺再摄取，阻断电压依赖的钠通道、调节钙通道，从而抑制谷氨酸释放。沙芬酰胺的中枢神经系统生物利用度高，临床显示可以提高帕金森病患者的运动和认知功能，防止患者出现运动障碍，且具有良好的耐受性。
在其生产过程中，由于起始物料间氟氯苄中含有少量的对氟氯苄传导至成品，产生位置异构体杂质2(S)-[4-(4-氟苄氧基)苄氨基]丙酰胺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沙芬酰胺有关物质的分析方法。其中沙芬酰胺有关物质为式Ⅱ所示化合物或其药学上可接受的盐：
在一些实施方案中，所述的沙芬酰胺有关物质为式II的甲磺酸盐。
在一些实施方案中，所述沙芬酰胺有关物质为II-1化合物：
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种沙芬酰胺有关物质的分析方法，其特征在于，所述方法是高效液相色谱法，该方法采用十八烷基硅烷-五氟苯基键合硅胶为固定相的色谱柱。
在一些实施方案中，所述的方法采用磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱:
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.008mol/L～0.012mol/L；在一些更为典型的实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01mol/L。
在一些典型的实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液为磷酸二氢钾水溶液。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为6.6～7.0；在一些更为典型的实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为6.8。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH由磷酸调节。
在一些实施方案中，所述洗脱液的流速为0.75～0.85mL/min；在一些更为典型的实施方案中，所述洗脱液的流速为0.8mL/min。
在一些实施方案中，所述色谱柱为ACE Excel3 C18-PFP，其规格为4.6mm×150mm，3μm。
在一些实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器或紫外检测器；在一些更为典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外检测器，且其检测波长为190nm～400nm；优选为226nm。
在一些实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为30～40℃；在一些更为典型的实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为35℃。
另一方面，本发明提供了一种沙芬酰胺有关物质的分析方法，其特征在于：
所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；其采用十八烷基硅烷-五氟苯基键合硅胶作为固定相的色谱柱；
所述分析方法采用紫外检测器，检测波长是226nm；
所述分析方法柱温为35℃；
所述分析方法以流动相A和流动相B作为洗脱液，其中流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，流动相B是甲醇，所述磷酸二氢钾缓冲液为0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液；
按以下程序梯度洗脱：
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；
洗脱液流速为0.8mL/min；
分别注入供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液；
通过主成分自身对照法计算供试品中有关物质的含量。
在一些特定的实施方案中，本发明提供了一种沙芬酰胺有关物质的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：取供试品适量，精密称定，加甲醇-水(50:50)溶解并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用甲醇-水(50:50)并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(3)系统适用性溶液的配制：取甲磺酸沙芬酰胺对照品与位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(4)供试品测定：采用ACE Excel3 C18-PFP(4.6mm×150mm，3μm)色谱柱；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱液流速为每分钟0.8ml；柱温为35℃；采用紫外检测器作为检测器，检测波长为226nm；进样体积为10μl；分别量取供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，分别注入液相色谱仪，并按下表进行梯度洗脱；
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；记录各色谱图；
(5)含量计算：
式中：At表示供试品溶液色谱图中位置异构体杂质峰面积；
AR表示对照溶液色谱图中甲磺酸沙芬酰胺平均峰面积。
本领域技术人员容易理解，在实施本发明过程中，本领域技术人员可以根据实际需求适当调整上述步骤的顺序且不影响测定方法的实施，例如供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液的配置顺序。
本发明中，除非另有说明，用以“供试品配制”的式I化合物包括但不限于新制备或经储存的式I化合物或包含式I化合物的药物组合物，优选新制备或经储存的式I化合物。
本发明中，位置异构体杂质指2(S)-[4-(4-氟苄氧基)苄氨基]丙酰胺甲磺酸盐。
本发明中，适量是指在根据实验目的，各化合物的量均在其高效液相色谱仪的检测限或定量限范围内。
本发明中，限度指杂质占主成分的比例为0.1％，例如：主成分浓度是0.5mg/ml，按限度0.1％就计算，杂质的限度浓度就是0.5μg/ml。
本发明中，“mL”是指毫升；“mg”是指毫克；“μg”是指微克；“min”是指分钟。
本发明要解决的技术问题是提供一种能准确测定甲磺酸沙芬酰胺中位置异构体杂质含量的高效液相色谱分析方法。
本发明的有益效果：采用本发明提供的方法可以准确测定式I化合物供试品中位置异构体杂质含量，且主峰与位置异构体杂质的分离度≥1.5，溶剂不干扰杂质检测，方法专属性良好，且该检测方法简便﹑快速﹑准确﹑灵敏度高﹑重复性好以及准确度好，可以快速准确地进行供试品中位置异构体杂质含量的定性及定量分析，保证本品质量的可控性。
附图说明
图1空白溶液的色谱图
图2位置异构体杂质定位溶液的色谱图
图3沙芬酰胺对照溶液的色谱图
图4系统适用性溶液的色谱图
图5供试品溶液色谱图
图6对比例1色谱条件下测出的系统适用性溶液色谱图
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的本领域技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
本发明所用试剂：位置异构体杂质对照品由南京正大天晴制药有限公司自制；甲磺酸沙芬酰胺样品由精华制药集团南通分公司和南京正大天晴制药有限公司合作研制。甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为超纯水。
实施例1样品测定
供试品溶液：取供试品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5mg的溶液，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液适量，用甲醇-水(50:50)稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5μg的溶液，作为对照溶液。
0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液：取磷酸氢二钾1.74g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至6.8。
色谱条件：以ACE Excel3 C18-PFP(4.6mm×150mm，3μm)为色谱柱；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱液流速为每分钟0.8ml；柱温为35℃；采用紫外检测器作为检测器，检测波长为226nm；进样体积为10μl；
测定法：分别取各溶液10μl，照上述色谱条件测定，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有位置异构体峰，按主成分自身对照法计算。
计算过程：
式中：At表示供试品溶液色谱图中位置异构体杂质峰面积；
AR表示对照溶液色谱图中甲磺酸沙芬酰胺平均峰面积。
检测结果见表1，由表可知，多批甲磺酸沙芬酰胺中的位置异构体杂质含量均符合规定，均小于限度0.1％。
表1供试品中位置异构体杂质的含量
实施例2专属性试验
供试品溶液和对照溶液的配制同实施例1。
系统适用性溶液：取甲磺酸沙芬酰胺对照品与位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5mg、位置异构体杂质2.5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
位置异构体杂质定位溶液：取位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含位置异构体杂质50μg的溶液，作为位置异构体杂质定位溶液。
试验过程：取空白溶剂、位置异构体杂质定位溶液、沙芬酰胺对照溶液、系统适用性溶液和供试品溶液及分别进样，按实施例1的色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1～图5。
结果表明：空白无干扰，杂质主峰分离度大于1.5，专属性良好。
实施例3检测限和定量限
溶液配制：取位置异构体杂质对照品适量，精密称定，加甲醇-水(50:50)溶解并逐级稀释成一系列溶液，在实施例1所述的色谱条件下进样分析，并将定量限溶液平行配制6份分别测试，考察保留时间的RSD和峰面积的RSD。采用信噪比(S/N)法分别确定本品的检测限(LOD)和定量限(LOQ)：以信噪比S/N≥3:1计算，对应供试品浓度为检测限；信噪比(S/N)法分别确定本品的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，以信噪比S/N≥10:1计算，对应供试品浓度为定量限。
试验过程：取空白溶剂及上述溶液进样，按实施例1的色谱条件测定，记录色谱图。
表2定量限结果
表3检测限结果
结果表明：位置异构体杂质峰面积RSD≤10.0％，保留时间RSD≤1.0％，LOQ与LOD均小于供试品浓度的0.05％检测灵敏度满足要求，位置异构体杂质的定量限为0.109μg/ml，检测限为0.040μg/ml。
实施例4线性和范围
溶液配制：精密称取位置异构体杂质对照品适量，用加甲醇-水(50:50)溶解制备成浓度约为限度(0.5μg/ml)浓度50％、80％、100％、150％和200％的溶液，即配样浓度依次为0.25、0.4、0.5、0.75、1.0μg/ml的溶液。
试验方法：分别精密量取上述溶液，按实施例1的色谱条件测定。以峰面积(X)为横坐标，浓度(Y，μg/ml)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为y＝4.7764×10-5x-5.0061×10-2(相关系数r＝0.9951)。结果表明，位置异构体杂质检测质量浓度在0.27～1.09μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。
实施例5溶液稳定性
取实施例2中的供试品溶液、对照溶液，于室温条件下放置，分别在放置0、16、19、21、24、42、48h后按实施例1的色谱条件测定。结果表明，对照溶液于室温下放置48h，位置异构体杂质峰相对0h峰面积百分比在90.0％～110.0％之间，对照溶液于室温条件下放置48h稳定；供试品溶液于室温下放置48h，位置异构体杂质相对0h含量变化绝对值小于0.05％，供试品溶液于室温条件下放置48h稳定。
实施例6准确度实验
供试品溶液：取本品约适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5mg的溶液，作为供试品溶液。
准确度溶液：分别取供试品与位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5mg、位置异构体杂质0.25μg、0.5μg和0.75μg的混合溶液，作为准确度溶液。各浓度水平溶液均平行配制3份。
对照溶液：精密量取上述各供试品溶液适量，用甲醇-水(50:50)稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5μg的溶液，作为对照溶液。
试验方法：取供试品溶液、准确度溶液及对照溶液分别进样，注入液相色谱仪，按实施例1的色谱条件测定，记录色谱图，按主成分自身对照法计算其回收率。结果见表4。
表4位置异构体杂质回收率结果
结果表明：位置异构体杂质的回收率在80％～120％之间，RSD值≤10.0％，该方法的准确度良好。
实施例7精密度实验
7.1进样精密度
溶液配制：取实施例4中100％限度浓度线性溶液。
试验方法：连续进样6针，按实施例1的色谱条件测定，记录色谱图，计算6针位置异构体杂质峰峰面积及保留时间的RSD。结果表明：位置异构体杂质峰的峰面积的RSD≤5.0％，保留时间RSD≤1.0％，仪器进样精密度良好。
表5进样精密度实验结果
7.2重复性
供试品溶液：分别取供试品与位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5mg、位置异构体杂质0.5μg的混合溶液，作为重复性溶液。平行配制6份。
对照溶液：精密量取上述各供试品溶液适量，用甲醇-水(50:50)稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5μg的溶液，作为对照溶液。
试验方法：精密量取供试品溶液及对照溶液各10μl，按实施例1的色谱条件测定，注入液相色谱仪，记录色谱图，按主成分自身对照法计算位置异构体杂质的含量。
表6重复性实验结果
结果表明：6份供试品中位置异构体杂质含量的RSD不大于10.0％，本方法的重复性良好。
7.3中间精密度
供试品溶液：分别取供试品与位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5mg、位置异构体杂质0.5μg的混合溶液，作为重复性溶液。平行配制6份。
对照溶液：精密量取上述各供试品溶液适量，用甲醇-水(50:50)稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5μg的溶液，作为对照溶液。
试验方法：由不同的分析人员在不同天，按实施例1的色谱条件，进行中间精密度试验。
表7中间精密度实验结果
可以看出，不同仪器不同人员的12次检测结果，位置异构体杂质含量的RSD≤10.0％，本方法的中间精密度良好。
实施例8耐用性
对照溶液及供试品溶液的配制同实施例1。
考察单一变量影响，分别通过改变流速、柱温、磷酸二氢钾缓冲液的pH和盐浓度，其余条件保持与实施例1色谱条件一致，取空白溶剂、对照溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。考察供试品溶液中杂质的检出情况，试验结果见下表。
结果表明：在系统参数变动的条件下，沙芬酰胺与位置异构体杂质之间分离度均大于1.5，分离良好；供试品溶液中主峰理论板数无明显变化，主峰的理论板数均不低于20000，供试品溶液中有关物质检测结果基本一致，该测定方法的耐用性良好。
对比实施例1
系统适用性溶液：取甲磺酸沙芬酰胺对照品与位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并稀释制成每1ml中约含沙芬酰胺0.5mg、位置异构体杂质2.5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
色谱条件：以Welch Xtimate C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱：0.01mol/L磷酸氢二钾(pH6.8)为流动相A，乙腈为流动相B；洗脱液流速为每分钟1ml；柱温为30℃；采用紫外检测器作为检测器，检测波长为210nm；进样体积为20μl；
按以下梯度程序洗脱：
精密量取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图
结果如图6所示，在该色谱条件下，位置异构体杂质峰与主峰重合，无法得到有效分离。
Claims (10)
1.一种沙芬酰胺有关物质的分析方法，其特征在于，所述方法是高效液相色谱法，该方法采用十八烷基硅烷-五氟苯基键合硅胶为固定相的色谱柱，其中沙芬酰胺有关物质为式Ⅱ所示化合物或其药学上可接受的盐：
优选地，所述的沙芬酰胺有关物质为式II的甲磺酸盐。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述的方法采用磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱:
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度0.008mol/L～0.012mol/L；优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01mol/L；优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液为磷酸二氢钾水溶液。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为6.6～7.0；优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH为6.8；优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液的pH由磷酸调节。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述洗脱液的流速为0.75～0.85mL/min；优选地，所述洗脱液的流速为0.8mL/min。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述色谱柱为ACE Excel3 C18-PFP，其规格为4.6mm×150mm，3μm。
7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器或紫外检测器；优选地，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外检测器，且其检测波长为190nm～400nm；优选地，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外检测器，且其检测波长为226nm。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述反相色谱柱的柱温为30～40℃；优选地，所述反相色谱柱的柱温为35℃。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的，其采用十八烷基硅烷-五氟苯基键合硅胶作为固定相的色谱柱；
所述分析方法采用紫外检测器，检测波长是226nm；
所述分析方法柱温为35℃；
所述分析方法以流动相A和流动相B作为洗脱液，其中流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，流动相B是甲醇，所述磷酸二氢钾缓冲液为0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液；
按以下程序梯度洗脱：
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；
洗脱液流速为0.8mL/min；
分别注入供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液；
通过主成分自身对照法计算供试品中有关物质的含量。
10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：取供试品适量，精密称定，加甲醇-水(50:50)溶解并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用甲醇-水(50:50)并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(3)系统适用性溶液的配制：取甲磺酸沙芬酰胺对照品与位置异构体杂质对照品适量，加甲醇-水(50:50)溶解并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(4)供试品测定：采用ACE Excel3 C18-PFP(4.6mm×150mm，3μm)色谱柱；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱液流速为每分钟0.8ml；柱温为35℃；采用紫外检测器作为检测器，检测波长为226nm；进样体积为10μl；分别量取供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，分别注入液相色谱仪，并按下表进行梯度洗脱；
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；记录各色谱图；
(5)主成分自身对照法计算供试品中有关物质的含量。
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