CN111505163B - 一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法 - Google Patents

一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法；包括以下步骤：a、制备对照品溶液；b、制备供试品溶液；c、采用高效液相色谱方法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测；d、按外标法以峰面积计算得到样品中的杂质含量。本发明提供了一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的新检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以同时实现对待测物质A中杂质B的准确检测，为监控苯乙基甲磺酸酯类物质的含量提供了一种行之有效的检测方法。

Description

一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法
技术领域
本发明属于化学中的分析检测领域，具体涉及一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法。
背景技术
结构为(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)的化合物根据其化学性质可知结构不稳定，容易降解产生结构为(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)的物质，(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)在检测方法中保留较弱且容易产生溶剂效应，导致裂峰，影响准确检测，从而影响(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)化合物的产品质量。
为了对化合物(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)进行检测，同时，也为了更全面地监控化合物(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)的产品质量，需要研发一种新的检测方法。
现有专利文献CN109580825A公开了消旋卡多曲中对甲苯磺酸酯类物质的检测方法，该方法以德国默克LiChrospher RP 18为色谱柱，采用HPLC检测方法对消旋卡多曲中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯进行定性和定量分析。然而，该方法应用于对(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)中(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)的检测时，难以避免溶剂效应对待测物峰形的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法。使用该检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以实现对待测物质((R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯))中杂质((R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯))的准确检测。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，所述苯乙基甲磺酸酯类物质同时包括：(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)和(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)；所述方法包括如下步骤：
S1、取(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)，制备对照品溶液；
S2、取待检样品，制备待检品溶液；
S3、采用高效液相色谱方法分别对对照品溶液、待检品溶液进行检测，所述高效液相色谱方法的检测条件为：
色谱柱：固定相为苯基硅烷键合硅胶；
流动相I：磷酸缓冲盐-乙腈，磷酸缓冲盐与乙腈体积比为97％:3％～93％:7％；
流动相II：乙腈-甲醇，乙腈与甲醇体积比为90％:10％；
检测波长：208nm～212nm；
S4、按外标法以峰面积计算，得到待测样品中苯乙基甲磺酸酯类物质的含量。
进一步，步骤S1中，制备对照品溶液的溶剂为体积比为50:50:0.05的甲醇-水-磷酸。
进一步，步骤S2中，制备待检品溶液的溶剂为体积比为50:50的甲醇-水。
进一步，每1mL含对照品溶液含(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)0.2～50μg。优选含5μg。
进一步，每1mL待检品溶液含待检样品0.5mg。
进一步，步骤S3中，所述色谱柱为Inertsil ph-3；长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。
进一步，步骤S3中，所述色谱柱的柱温为20℃～30℃。
进一步，步骤S3中，磷酸缓冲盐-乙腈，磷酸缓冲盐与乙腈体积比为97％:3％～93％:7％，所述磷酸缓冲盐为18mmol/L～22mmol/L磷酸二氢钾；磷酸调pH为2.8～3.2。
优选磷酸缓冲盐为20mmol/L磷酸二氢钾；磷酸缓冲盐pH值为3.0。
进一步，步骤S3中，所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min。
优选流动相的流速为1.0ml/min。
进一步，步骤S3中，优选所述检测波长为210nm。
进一步，步骤S3中，进样体积为5μl～20μl。优选进样体积为10μl。
进一步，步骤S3中，进样器温度为5℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明通过调整稀释剂以优化待测物质的峰形，消除溶剂效应；
2)本发明提供了一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质杂质含量的新检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以实现对待测物质A((R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯))中杂质B((R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯))的准确检测；
3)本发明的检测方法操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为化合物(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)的含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了产品质量。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为发明检测条件下溶剂甲醇-水-磷酸(50:50:0.05)的HPLC图；
图2为本发明检测条件下杂质B对照品溶液的HPLC图；
图3为本发明检测条件下待测物质A供试品溶液的HPLC图；
图4为本发明检测条件下待测物质A和杂质B混合溶液的HPLC图；
图5为对比试验1色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图；
图6为对比试验1色谱条件下待测物质A和杂质B混合溶液的HPLC图；
图7为对比试验2色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图；
图8为对比试验2色谱条件下待测物质A和杂质B混合溶液的HPLC图；
图9为对比试验3色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图；
图10为对比试验3色谱条件下待测物质A和杂质B混合溶液的HPLC图；
图11为试验例1第1项下杂质B的紫外光谱图；
图12为试验例1第2项下杂质B对照品的标准曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明具体实施方式中使用的设备均为已知产品，通过购买市售产品获得；
待测物质A的名称为(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)。
杂质B的名称为(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)。
待测物质A
Figure BDA0002497085260000041
杂质B
Figure BDA0002497085260000042
MS105型精密电子天平可购自梅特勒公司；Waters ARC型高效液相色谱泵可购自沃特世公司，2489UV检测器可购沃特世公司，Inertsil ph-3(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱可购自岛津公司；
实施例1、本发明检测苯乙基甲磺酸酯类物质杂质的高效液相色谱方法
色谱柱：Inertsil ph-3，4.6mm×250mm，5μm；
流动相I：20mmo/L磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)-乙腈(95：5)
流动相II：乙腈-甲醇(90：10)
溶剂I：制备供试品溶液的溶剂为甲醇-水(50：50)。
溶剂II：制备对照品溶液的溶剂为甲醇-水-磷酸(50：50：0.05)；
柱温：25℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
进样体积：10μL。进样器温度5℃。
梯度洗脱条件如下表1：
表1
时间(min) A％ B％
0 95 5
5 95 5
20 30 70
21 95 5
30 95 5
检测步骤：
取杂质B对照品适量，用溶剂II溶解，配制成每1mL含杂质各5μg的对照品溶液。
取待测物A适量，用溶剂I溶解，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
取待测物A适量，用溶剂I溶解后，加入杂质B对照品溶液，用溶剂I稀释，配制成混合溶液(混合溶液中每1mL含杂质B 5μg，含待测物A 0.5mg)。
测定法：取上述溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图2～图4。
图2为杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间为9.548min。
图3为供试品溶液的HPLC图，待测物质A的保留时间为21.780min。
图4为供试品和杂质B混合溶液的HPLC图，待测物质A保留时间为21.783min，杂质B的保留时间为9.550min。待测物A与杂质B之间的分离度为49.7。
结果表明，本发明的色谱条件下，待测无A与杂质B之间的分离度高，可以实现苯乙基甲磺酸酯类物质杂质含量的准确检测。
对比试验1：
色谱柱：Waters Symmetry C18 4.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾-乙腈(95:5)
流动相B：乙腈
溶剂：乙腈
柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
梯度洗脱条件如下表2：
表2
时间(min) A％ B％
0 85 15
15 30 70
16 85 15
25 85 15
取杂质B适量，加溶剂配制成每1mL含杂质5μg的对照品溶液。
取待测物A适量，加溶剂配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
取待测物A和杂质B适量，加溶剂配制成每1mL约含待测物A为0.5mg，杂质B为5μg的混合溶液。
测定法：取上述溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图5～6所示。
图5为对比试验1色谱条件下对照品溶液的H P L C图，杂质B待测物A保留时间为1.693min。
图6为对比试验1色谱条件下混合溶液的H P L C图，待测物A的保留时间12.609min。
结果表明，杂质B保留时间较短，且产生裂峰，该方法完全不能进行杂质B的分离检测。
对比试验2：
色谱柱：Inertsil Ph-3 4.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：20mmo/L磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)-乙腈(95：5)
流动相B：乙腈
溶剂：甲醇
柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
梯度洗脱条件如下表3：
表3
时间(min) A％ B％
0 85 15
15 30 70
16 85 15
25 85 15
取待测物A适量，加溶剂配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
取杂质B适量，加溶剂配制成每1mL约含5μg的对照品溶液。
取待测物A和杂质B适量，加溶剂配制成每1mL约含待测物A为0.5mg，杂质B为5μg的混合溶液。
测定法：取上述溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图7～8所示。
图7为对比试验2色谱条件下对照品溶液的H P L C图，杂质B保留时间为5.109min。
图8为对比试验2色谱条件下混合溶液的H P L C图，供试品溶液保留时间为15.466min。
结果表明，杂质B有溶剂效应导致裂峰，该方法完全不能进行杂质B的分离检测。
对比试验3：
色谱柱：Inertsil Ph-3 4.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：20mmo/L磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)-乙腈(95：5)
流动相B：乙腈-甲醇(90：10)
溶剂：甲醇-水(50：50)
柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
梯度洗脱条件如下表4：
表4
时间(min) A％ B％
0 95 5
15 30 70
20 95 5
25 95 5
取待测物A适量，加溶剂配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
取杂质B适量，加溶剂配制成每1mL约含5μg的对照品溶液。
取待测物A和杂质B适量，加溶剂配制成每1mL约含待测物A为0.5mg，杂质B为5μg的混合溶液。
测定法：取上述溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图9～10所示。
图9为对比试验3色谱条件下对照品溶液的H P L C图，杂质B保留时间为7.204min。
图10为对比试验3色谱条件下混合溶液的H P L C图，待测物A保留时间为16.651min。
对照品溶液稳定性结果如下表5：
表5
杂质B峰面积
0 8872
2 5182
4 2671
6 1287
结果表明，对照品溶液中杂质B持续降解，该方法完全不能进行杂质B的分离检测。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。
试验例1、本发明检测方法的方法学研究
本试验例中各种试验均采用如下条件：
色谱柱：Inertsil Ph-3 4.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：20mmo/L磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)-乙腈(95：5)
流动相B：乙腈-甲醇(90：10)
溶剂I：制备供试品溶液的溶剂为甲醇-水(50：50)；
溶剂II：制备对照品溶液的溶剂为甲醇-水-磷酸(50：50：0.05)。
柱温：25℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
进样体积：10μL。进样器温度：5℃
梯度洗脱条件如下表6：
表6
时间(min) A％ B％
0 95 5
5 95 5
20 30 70
21 95 5
30 95 5
1、检测波长
取杂质B，用溶剂II溶解并稀释制成适宜浓度(10μg/ml)的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IVA)在200～400nm范围内进行光谱扫描，紫外光谱图如图11所示。
结果显示，杂质B在200～300nm均有吸收，因此选择在200～300nm范围内选择测定波长，而在210nm波长有最大吸收，因此，最终选择210nm作为杂质B检测的检测波长。
2、专属性试验
取待测物A适量，用溶剂I溶解后，稀释制成每1mL中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取杂质B适量，用溶剂II溶解并稀释制成每1mL中约含5μg的溶液，作为对照品溶液。取待测物A和杂质B适量，加溶剂I稀释制成每1mL中约含待测物A为0.5mg和杂质B为5μg的溶液，作为混合溶液，分别精密取上述混合溶液、供试品溶液、对照品溶液及溶剂I各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图1～4所示。
结果表明，在本发明检测方法的条件下，待测物A及其余杂质对杂质B的测定无干扰，证明本发明检测方法的专属性强。
3、标准曲线和线性范围
精密量取杂质B对照品适量，用溶剂II稀释制成一系列浓度的对照品溶液。分别精密取不同浓度的对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定峰面积，结果见表7。
表7、线性关系
Figure BDA0002497085260000091
以杂质对照品溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算杂质B的线性回归方程及相关系数r，标准曲线如图12所示。
结果表明，本发明检测方法中杂质B的浓度在0.2035μg/mL～50.8707μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：y＝12,756.2172x-35.6745，r＝1.0000；证明本发明方法线性范围广，准确度高。
此外，从标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。
4、精密度试验
取试验例1第3项下的对照品溶液，精密取10μL，注入高效液相色谱仪，
连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表8。
表8、精密度试验结果
Figure BDA0002497085260000092
计算得到杂质B峰面积的RSD为：0.34％，保留时间的RSD为：0.03％，证明本发明的检测方法精密度优异。
5、定量限
量取试验例第2项下对照品溶液适量，加溶剂II稀释，精密量取10μl，注入液相色谱仪，按照本发明的检测方法测定峰面积及基线噪音，结果见表9。
表9、定量限试验结果
Figure BDA0002497085260000093
Figure BDA0002497085260000101
杂质B的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质B的定量限为2.0348ng，证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足杂质定量测定的要求。
6、重复性试验
精密称取待测物A 6份，各约10mg，分别置20mL量瓶中，加溶剂I溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。精密量取上述6份供试品溶液各10μL，按照本发明的检测方法进行检测，按外标法以峰面积计算杂质B的含量，结果见表10。
表10、重复性试验结果
序号 杂质B
1 0.02
2 0.03
3 0.03
4 0.02
5 0.02
6 0.02
由上述结果可知，本发明检测方法的重复性良好。
7、溶液稳定性试验
精密称取待测物A10mg，置20mL量瓶中，加溶剂I溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。分别于配制后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、、16h、20h、24h、48h进样10μL，记录色谱图，考察其供试品溶液中杂质B的稳定性情况，结果见表11。
表11、供试品溶液稳定性试验结果表
时间 杂质B
0 11680
2 11621
4 11662
6 11557
8 11611
10 11576
12 11669
16 11612
20 11648
24 11755
48 12097
由上述结果可知，在配制后48小时内供试品溶液中杂质B检出结果无明显变化，证明本发明检测方法供试品溶液稳定。
8、回收率试验
精密称取待测物A15份，各约10mg，分别置20mL量瓶中，加入试验例第2项下各杂质B浓度约为100μg/mL的对照品溶液0.5mL、1.0mL、1.5ml、3.0mL、5.0ml各3份，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为回收率供试品溶液。分别精密取15份回收率供试品溶液及试验例第2项下的对照品溶液和供试品溶液各10μL进样测定，记录色谱图，计算杂质B的已有量、测得量、对照品加入量及回收率，结果见表12。
计算公式：
Figure BDA0002497085260000111
式中：a为供试品中所含杂质B的量(μg/ml)；
b为杂质B对照品加入量(μg/ml)；
c为杂质B的测得量(μg/ml)。
表12、杂质B回收率试验结果
Figure BDA0002497085260000112
结果表明，本发明检测方法测定待测物中的杂质B，回收率在101.01％～108.55％之间，相对标准偏差为1.17％，证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。
综上所述，本发明提供了一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质含量的新检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以实现对杂质B的准确检测，而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵
敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控苯乙基甲磺酸酯类物质中杂质的含量提供了一种行之有效的检测方法。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一种检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、取(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)，制备对照品溶液；
S2、取待检样品(R)-2-((叔丁氧羰基氨基)-2-苯乙基甲磺酸酯)，制备待检品溶液；
S3、采用高效液相色谱方法分别对对照品溶液、待检品溶液进行检测，所述高效液相色谱方法的检测条件为：
色谱柱：固定相为苯基硅烷键合硅胶；
流动相
Figure DEST_PATH_IMAGE001
：20mmo/L磷酸二氢钾，磷酸调pH至3.0-乙腈，体积比为95：5；
流动相
Figure 230932DEST_PATH_IMAGE002
：乙腈-甲醇，体积比为90：10；
检测波长：208nm～212nm；
梯度洗脱条件如下：
时间min
Figure 891720DEST_PATH_IMAGE001
%
Figure 971672DEST_PATH_IMAGE002
% 0 95 5 5 95 5 20 30 70 21 95 5 30 95 5
；
S4、按外标法以峰面积计算，得到待检样品中(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯)的含量。
2.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，步骤S1中，制备对照品溶液的溶剂为体积比为50:50:0.05的甲醇-水-磷酸。
3.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，步骤S2中，制备待检品溶液的溶剂为体积比为50:50的甲醇-水。
4.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，每1mL对照品溶液含(R)-2-(氨基-2-苯乙基甲磺酸酯) 0.2～50μg；每1mL待检品溶液含待检样品0.5mg。
5.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述色谱柱为Inertsil ph-3；长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。
6.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述色谱柱的柱温为20℃～30℃。
7.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min。
8.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，步骤S3中，进样体积为5μl～20μl。
9.根据权利要求1所述的检测苯乙基甲磺酸酯类物质的方法，其特征在于，步骤S3中，进样器温度为5℃。
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