CN117969716A - 一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学药品检测技术领域，具体涉及一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法。本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、以磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相A、以乙腈为流动相B、检测波长215nm，采用梯度洗脱，通过外标法，对产品中6种杂质：杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]‑SOMA和杂质[β‑Asp5]‑SOMA，进行准确定量，解决了无法对生长抑素冻干粉针剂产品中各已知杂质准确定量的问题。本发明方法分离度好、准确度高，且能在同一色谱条件下，对生长抑素冻干粉针剂中6个杂质同时进行分离检测，大大提高了检测效率，降低了检验成本。
Description
技术领域
本发明属于化学药品检测技术领域，涉及一种化学药品中杂质的检测方法，具体涉及一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法。
背景技术
生长抑素(Somatostatin，SST)，即生长激素释放抑制因子，是一种能发挥抑制分泌作用的多肽类激素药物。主要存在于胃粘膜、胰岛、胃肠道神经、垂体后叶和中枢神经系统中，其制剂在临床可用于消化道出血、食管静脉曲张破裂出血、急性胰腺炎及胰腺术后并发症、胰、胆和肠瘘的治疗。
生长抑素冻干粉针剂作为注射剂产品，其杂质控制对产品质量保证至关重要。生长抑素冻干粉针剂产品中所含主要已知杂质，根据来源包括原料药合成过程产生的插入肽、缺失肽、差向肽等多种副产物，以及制剂在储存期内的降解产物。鉴于目前生长抑素原料药合成工艺除杂技术的成熟应用，以及制剂生产工艺的精细化控制，生长抑素冻干粉针剂产品中常见，且被列入质量标准中需要严格控制的杂质有如下几个：原料合成副产物杂质[Des-Thr10]-SOMA（杂质B）、降解杂质[Ala1(AC)]- SOMA（杂质C）、杂质[Lys4 (AC)]-SOMA（杂质D）、杂质[Lys9 (AC)]- SOMA（杂质E）、杂质[Asp5]-SOMA和杂质[β-Asp5]-SOMA。
注射用生长抑素进口注册标准（JX20140241）及CHP（2020版二部)注射用生长抑素质量标准（文献1）中采用高效液相色谱法对生长抑素冻干粉针剂中的杂质进行检测，其色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸溶液（取磷酸11 mL，加水800 mL，用三乙胺调节pH值至2.3，用水稀释至1000 mL）为流动相A，以乙腈为流动相B；流速1.5 mL；检测波长为215 nm；进样体积50 μl，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：
该分析方法无法对杂质[Des-Thr10]- SOMA（杂质B）及[Asp5]-SOMA杂质实现分离，这两个杂质峰与主成分峰基本重合；杂质D与相邻杂质峰分离度较差，无法准确定量。因该检测方法分离效果不理想，所以标准中最终只能通过自身对照法，仅对最大单个杂质及总杂进行限度控制，并将限度分别定为1.0%和2.0%。
欧洲药典9.0版（EP 9.0）中收载的生长抑素原料药质量标准（文献2）中采用高效液相色谱法对生长抑素原料药有关物质进行检测，色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以三氟乙酸：乙腈：水（0.1:20:80）为流动相A，以三氟乙酸：乙腈：水（0.1:45:55）为流动相B；流速1.5 mL；检测波长为220 nm；进样体积15μl，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：
该方法可以有效分离[Des-Thr10]- SOMA（杂质B），但对[Asp5]-SOMA分离效果较差，因其与主成分峰基本重合；另对于[AC-Ala1]- SOMA (杂质C)、[Lys(AC)4]- SOMA（杂质D）以及[Lys9 (AC)]- SOMA（杂质E）这三个降解杂质的分离度过低，无法满足检测要求。与CHP标准一样，因检测方法分离效果不理想，欧洲药典9.0版收载的生长抑素原料药质量标准标准中最终通过自身对照法，仅对最大单个杂质及总杂进行限度控制，并将限度分别定为1.0%和2.0%。
CN115716863A（文献3）公开了一种生长抑素杂质的控制方法，采用高效液相色谱法对生长抑素原料合成过程副产物进行检测，其色谱条件为：采用Shimsen Ankylo C18色谱柱，色谱柱规格4.6×150 mm。填料粒径3 μm；以磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠、高氯酸钠的混合溶液与乙腈（70:30）为流动相A，以磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠、高氯酸钠的混合溶液与乙腈（50:50）为流动相B；流速0.8-1.2 mL/min；检测波长为215-225 nm；柱温20-30℃；进样体积30-50 μl，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：
该方法只针对来源于丁基橡胶塞中的丙酮与生长抑素反应生成的丙酮加和物进行检测。无法对其他杂质进行检测及定量。
CN113702560A（文献4）公开了一种化学合成生长抑素中产生的副产物的检测方法，采用高效液相色谱法对生长抑素原料药合成过程副产物进行检测，其色谱条件为：采用Inertil ODS-3为色谱，色谱柱规格4.6×250 mm。填料粒径3 μm；以硫酸铵缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，A：B=758:242；流速0.4-0.6 mL/min；检测波长为208-212 nm；柱温28-32℃，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：
该方法最终通过自身对照法对生长抑素原料合成过程中副产物半胱氨酸消旋杂质（[D-Cys3]-SOMA）、甘氨酸和丙氨酸的错接肽杂质（[des+Ala1]-SOMA、[des+Gly2]-SOMA）和缺失肽杂质（[Des-Cly2]-SOMA、[Des-Ala1]-SOMA）和[Des-Thr10]-SOMA（杂质B）的含量进行检测，但该分析方法单次洗脱时间长达790 min，效率低、成本高，有机溶剂用量大。
综上可以看出，现有技术中存在的问题有：（1）文献1、文献2公开的现有技术中，杂质分离度差，无法实现杂质与主成分或杂质与杂质间有效分离；（2）文献3的技术方案中所控制的杂质仅为丙酮加和物，适用范围有限；（3）文献4公开的现有技术虽然适用于对生长抑素原料药合成副产物进行控制，但该分析方法单次洗脱时间长达790min，极大地增加了检验成本，检验效率低下，且长时间的洗脱，流动相中有机试剂用量较大，对环境污染风险较高。
因此，探寻一种高效的生长抑素冻干粉针剂杂质检测方法，对上述6个杂质进行准确定量控制，从而保证生长抑素冻干粉针剂产品质量就显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，解决现有技术中生长抑素冻干粉针剂产品中杂质检测方法存在的检测方法复杂、检测效率低下，且各杂质分离度差、不能准确定量的问题，本发明的目的是提供一种分离度好、准确度高，且能同时将生长抑素冻干粉针剂中存在的6种杂质进行分离检测的高效的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，采用高效液相色谱法进行，具体包括如下步骤：
S01. 供试品溶液的配制：取生长抑素冻干粉12.5 mg，加水溶解并定量稀释至25mL，混匀，制成每1 mL约含生长抑素0.5 mg的溶液；
S02. 对照品溶液的配制：精密称取生长抑素对照品、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀，作为各对照品贮备液；分别精密量取各杂质对照品溶液与生长抑素对照品溶液适量，置同一量瓶中，用水定量稀释制成每1 mL中含生长抑素、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA分别为5.0 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5 µg的混合对照品溶液。
S03. 系统适用性溶液的配制：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀；分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
S04. 检测：
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.02 mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液并用pH调节剂调节pH值至3.4-3.6作为流动相A；以乙腈为流动相B，色谱柱温度范围为50℃-60℃；流速范围为1.4-1.6 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；洗脱梯度如下：
测定法：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
系统适用性测试要求：系统适用性溶液色谱图中，生长抑素峰拖尾因子不得过3.5，理论板数按生长抑素峰计算不低于3000。
进一步，在步骤S02中，所述杂质B为杂质[Des-Thr10]-SOMA、杂质C为降解杂质[Ala1(AC)]- SOMA、杂质D为杂质[Lys4 (AC)]- SOMA、杂质E为杂质[Lys9 (AC)]- SOMA；所述6种杂质的分子式、结构式、分子量具体如下所示：
进一步，在步骤S04中，所述流动相A的pH调节剂为磷酸溶液，其浓度为10%。
进一步，在步骤S04中，所述流动相A的pH范围优选为3.5。
进一步，在步骤S04中，所述色谱柱温度优选为55℃。
进一步，在步骤S04中，所述流速优选为1.5 mL/min。
进一步，在步骤S04中，所述色谱柱，长度为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5µm。
进一步，在步骤S04中，所述系统适用性试验，所得色谱图中，出峰顺序依次为生长抑素峰、杂质B峰、杂质[Asp5]-SOMA峰、杂质[β-Asp5]-SOMA峰、杂质C峰、杂质D峰、杂质E峰。
进一步，在步骤S04中，采用外标法对杂质B、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA、杂质C、杂质D、杂质E进行定量计算。
进一步，杂质C不得过标示量的1.0%，杂质B、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA均不得过标示量的0.5%；其它单个杂质峰以对照品溶液色谱图中生长抑素峰面积计算，不得过标示量的0.5%；杂质总量不得过2.0%。
本发明与现有技术相比具有如下突出的实质性特点和显著进步。
(1) 本发明检测方法，首次实现了在同一色谱条件下，可对生长抑素冻干粉针剂中6个杂质同时进行检测、达到完全分离的目的，提高了检测效率，降低了检验成本。
(2) 本发明检测方法，首次实现了采用外标法对生长抑素冻干粉针剂产品中6种杂质准确定量，解决了无法对生长抑素冻干粉针剂产品中各已知杂质准确定量的问题。
(3) 用本发明检测方法得到的供试品溶液色谱图中，如有与对照品溶液色谱图中相应杂质保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，杂质C不得过标示量的1.0%，杂质B、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA均不得过标示量的0.5%；其它单个杂质峰以对照品溶液色谱图中生长抑素峰面积计算，不得过标示量的0.5%；杂质总量不得过2.0%。
附图说明
图1为由对照例1所得系统适用性试验色谱图。
图2为由对照例1所得杂质B定位色谱图。
图3为由对照例1所得杂质C定位色谱图。
图4为由对照例1所得杂质D定位色谱图。
图5为由对照例1所得杂质E定位色谱图。
图6为由对照例1所得杂质[Asp5]-SOMA定位色谱图。
图7 为由对照例1所得杂质[β-Asp5]-SOMA定位色谱图。
图8为对照例2所得系统适用性试验色谱图。
图9为由对照例2所得杂质B定位色谱图。
图10为由对照例2所得杂质C定位色谱图。
图11为由对照例2所得杂质D定位色谱图。
图12为由对照例2所得杂质E定位色谱图。
图13为由对照例2所得杂质[Asp5]-SOMA定位色谱图。
图14 为由对照例2所得杂质[β-Asp5]-SOMA定位色谱图。
图15为实施例1所得系统适用性试验色谱图。
图16为实施例2所得系统适用性试验色谱图。
图17为实施例3所得系统适用性试验色谱图。
图18为实施例4所得系统适用性试验色谱图。
图19为实施例5所得系统适用性试验色谱图。
图20为实施例6所得系统适用性试验色谱图。
图21为实施例7所得系统适用性试验色谱图。
图22为实施例8中专属性试验所得系统适用性试验色谱图。
图23为由对照例8中专属性试验所得杂质B定位色谱图。
图24为由对照例2中专属性试验所得杂质C定位色谱图。
图25为由对照例2中专属性试验所得杂质D定位色谱图。
图26为由对照例2中专属性试验所得杂质E定位色谱图。
图27为由对照例2中专属性试验所得杂质[Asp5]-SOMA定位色谱图。
图28 为由对照例2中专属性试验所得杂质[β-Asp5]-SOMA定位色谱图。
图29为由实施例9所得系统适用性试验色谱图。
图30为由实施例9所得对照品溶液色谱图。
图31为由实施例9所得供试品溶液色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
在实施例中，发明人团队按照本发明检测方法配制系统适用性溶液，分别通过采用CHP（2020年版）色谱条件进样检测、采用EP（9.0版）色谱条件进样检测，进行系统适用性对照实验；然后按照本发明检测方法及色谱条件，配制系统适用性溶液并进样检测，并通过调流动相的pH值、调整流动相的流速、调整色谱柱的柱温，以进一步证明本发明检测方法能够将生长抑素与其6个杂质有效分离且采用外标法可进行准确定量计算，并证明本发明检测方法稳定性良好、适用性强。
对照例1：
按本发明检测方法配制系统适用性溶液，采用EP（9.0版）色谱条件进样检测：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以三氟乙酸：乙腈：水（0.1:20:80）为流动相A，以三氟乙酸：乙腈：水（0.1:45:55）为流动相B；流速1.5 mL；检测波长为220nm；进样体积15 µL，按如下表1中的梯度洗脱程序进行洗脱：
由对照例1所得系统适用性试验色谱图见图1，杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA定位色谱图分别见图2、图3、图4、图5、图6、图7。
由对照例1所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
由图1-图7可知，采用EP（9.0版）方法，杂质[Asp5]-SOMA分离效果较差，其与主成分峰基本重合；[AC-Ala1]- somatostatin(杂质C)、[Lys(AC)4]- somatostatin（杂质D）以及[Lys9 (AC)]- somatostatin（杂质E）这三个降解杂质的分离度较低；同时杂质[β-Asp5]-SOMA无法分离检测。
对照例2：
按本发明检测方法配制系统适用性溶液，采用CHP（2020年版）色谱条件进样检测：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸溶液（取磷酸11 mL，加水800 mL，用三乙胺调节pH值至2.3，用水稀释至1000 mL）为流动相A，以乙腈为流动相B；流速1.5 mL；检测波长为215 nm；进样体积50 µL，按如下表2中梯度洗脱程序进行洗脱：
由对照例2所得系统适用性试验色谱图见图8，杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA定位色谱图分别见图9、图10、图11、图12、图13、图14。
由对照例2所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
由图8至图14可知，对照例2所采用的CHP（2020年版）分析方法无法实现对杂质[Des-Thr10]- SOMA（杂质B）及杂质[Asp5]-SOMA的分离，这两个杂质峰与主成分峰基本完全重合；杂质D与相邻杂质峰分离度较差，无法准确定量。
实施例
按本发明检测方法及色谱条件，配制系统适用性溶液并进样检测。
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为55℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH为3.5，流动相B为乙腈；流速为1.5 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度如表3：
由实施例1所得系统适用性试验色谱图见图15。
由实施例1所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
由图15和表4中由实施例1所得数据可知，实施例1采用本发明检测方法，可实现在同一色谱条件下一次进样即可对生长抑素冻干粉针剂产品中6种杂质进行完美分离，各峰间分离度良好，理论踏板数高。
实施例
在实施例1的基础上，调整流动相A的pH为3.4：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为55℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH为3.4，流动相B为乙腈；流速为1.5 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度如表3所示。
由实施例2所得系统适用性试验色谱图见图16。
由实施例2所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
由图16和表4中由实施例2所得数据可知，实施例2采用本发明检测方法，可实现在同一色谱条件下一次进样即可对生长抑素冻干粉针剂产品中6种杂质的进行完美分离，各峰间分离度良好，理论踏板数高。
实施例
在实施例1的基础上，调整流动相A的pH为3.6：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为55℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH值为3.6，流动相B为乙腈；流速为1.5 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度如表3所示。
由实施例3所得系统适用性试验色谱图见图17。
由实施例3所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
实施例
在实施例1的基础上，调整流速为1.4 mL/min：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为55℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为3.5，流动相B为乙腈；流速为1.4 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度如表3所示。
由实施例4所得系统适用性试验色谱图见图16。
由实施例4所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
实施例
在实施例1的基础上，调整流速为1.6 mL/min：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为55℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为3.5，流动相B为乙腈；流速为1.6 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度如表3所示。
由实施例5所得系统适用性试验色谱图见图17。
由实施例5所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
实施例
在实施例1的基础上，调整柱温为50℃：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为50℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH值为3.5，流动相B为乙腈；流速为1.6 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度如表3所示。
由实施例6所得系统适用性试验色谱图见图18。
由实施例6所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
实施例
在实施例1的基础上，调整柱温为60℃：
精密称取生长抑素及各杂质对照品适量，按如下方法配制系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为60℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH值为3.5，流动相B为乙腈；流速为1.6 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度如表3所示。
由实施例7所得系统适用性试验色谱图见图19。
由实施例7所得系统适用性试验检测结果见表4（各对照例、各实施例实验结果汇总表）。
由以上对照例1、2和实施例1-7所得色谱图和实验结果可以得出结论：
对照例1采用EP中的色谱条件、对照例2采用CHP中的色谱条件，所得色谱图中杂质B、与杂质[Asp5]-SOMA均不同程度与主峰重合，无法实现有效分离与定量。
实施例1采用本发明检测方法，完美实现了在同一色谱条件下将生长抑素与其6个杂质有效分离且采用外标法准确定量计算的目的。
实施例2-实施例7对本发明检测方法中的技术参数进行适当改变，通过调整流动相A的pH值、流速及柱温三个色谱条件，对本发明检测方法进行耐用性验证，结果证明本发明检测方法稳定性良好，适用性强。
实施例
发明人团队对本发明检测方法进行了方法学验证，具体验证内容及结果如下：
（1）系统适用性
生长抑素对照品贮备液及杂质对照品贮备液的配制：
精密称取生长抑素对照品12 mg置于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释到刻度，摇匀，即得生长抑素对照品贮备液。再精密称取生长抑素杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质[Asp5]-SOMA对照品、[β-Asp5]-SOMA杂质对照品各12 mg分别置于六个100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释到刻度，摇匀，即得6个杂质对照品贮备液。（所得生长抑素对照品贮备液含生长抑素1 mg/mL、各杂质对照品贮备液分别含杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质[Asp5]-SOMA对照品、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各100 µg/mL）。
灵敏度溶液的配制：
分别吸取生长抑素对照品贮备液0.5 mL，吸取杂质对照品贮备液5.0 mL置于同一100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释到刻度，摇匀，即得灵敏度储备溶液（该灵敏度储备溶液含生长抑素、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质[Asp5]-SOMA对照品、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各5.0 µg/mL）。
再精密吸取灵敏度储备溶液1.0 mL置20 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释到刻度，摇匀，即得灵敏度溶液（该灵敏度溶液含生长抑素、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、 杂质[Asp5]-SOMA对照品、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各0.25 µg/mL）。
系统适用性分离度考察溶液 精密量取生长抑素对照品贮备液1 mL，加100 μl生长抑素杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质[Asp5]-SOMA对照品、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品贮备液后，再加超纯水400 μl，摇匀，即得。
系统适用性溶液 同系统适用性分离度考察溶液
工作对照品溶液 同灵敏度储备溶液
供试品溶液 取生长抑素制剂1支，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液作为供试品储备液（1 mg/mL）；再精密量取供试品储备液1 mL，加超纯水1 mL，摇匀，即得供试品溶液（0.5 mg/mL）。
系统适用性要求
可接受标准：系统适用性溶液色谱图中，理论板数按生长抑素峰计算不得低于3000，生长抑素的拖尾因子不得过3.5，溶液中生长抑素与杂质B的分离度应不低于1.5；连续进样5针工作对照品溶液所得生长抑素峰面积RSD不得过2.0%。
测定方法：将5针工作对照品溶液连续注入液相色谱仪，按照实施例1色谱条件进行检测，记录色谱图。
系统适用性试验结果见表5。
试验结果表明：理论板数按生长抑素峰计算不低于3000，生长抑素的拖尾因子小于3.5，溶液中生长抑素与杂质B的分离度大于1.5。连续进样5针工作对照品溶液所得生长抑素峰面积RSD均小于2.0%，本方法系统适用性良好。
（2）专属性
已知杂质定位
分别制备含杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、 杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品溶液，具体操作如下：
生长抑素对照品储备液：精密称取生长抑素对照品0.01275g置于10 mL容量瓶。加纯水稀释至刻度，摇匀即得(1 mg/mL)。
杂质对照储备液：分别精密称取生长抑素杂质B对照品 0.01156g，杂质C对照品0.01151g，杂质D对照品 0.01190g，杂质E对照品 0.01287g，杂质对照[Asp5］-S0MA0.01285g，杂质［β-Asp5］-S0MA) 对照品0.01206g分别置于100 mL容量瓶中，纯水稀释至刻度，摇匀即得（杂质对照储备液含各生长抑素杂质对照各100 μg/mL）。
杂质定位溶液：吸取各杂质对照储备液1 mL分别置于20 mL容量瓶加超纯水定容，摇匀即得(5 μg/mL)。
系统适用性溶液：分别量取各杂质对照储备液0.1 mL与生长抑素对照品储备液1mL混合，再加超纯水400 μl，摇匀即得。
按照实施例1色谱条件，分别将系统适用性溶液和专属性检测用样品溶液（杂质定位溶液）注入液相色谱仪，记录色谱图。
由实施例8专属性检测所得系统适用性试验色谱图见图22、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA定位色谱图分别见图23、图24、图25、图26、图27、图28。
由实施例8专属性检测结果见表6。
试验结果表明：稀释用溶剂、各杂质对照品及辅料不干扰样品的测定。
（3）线性
分别配制杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA和杂质[β-Asp5]-SOMA以及主成分生长抑素的系列浓度溶液（不少于6个浓度），范围从0.1%～2.0 %，每个浓度的样品进3针，按照实施例1色谱条件检测，记录峰面积，计算回归曲线及相关系数。
线性检测结果见表7-1、表7-2、表7-3、表7-4、表7-5、表7-6、表7-7。
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结论：主成分及各已知杂质均满足系统适用性要求。在设定浓度范围内曲线的相关系数不低于0.99，6个响应因子数据的RSD在10.0%以内。由以上计算所得数据确定线性范围为（0.1%～2.0%），即浓度为0.5 μg/mL～10 μg/mL。
（4）检出限和定量限
在线性的系列溶液中，继续逐层稀释并进样，按照实施例1色谱条件洗脱。按信噪比3：1确定检测限，按信噪比10：1确定定量限。结果见表8。
结论：生长抑素定量限约为0.275 μg/mL；检测限约为0.138 μg/mL；杂质B定量限约为0.245 μg/mL，检测限约为0.122 μg/mL；杂质C定量限约为0.255 μg/mL，检测限约为0.128 μg/mL；杂质D定量限约为0.265 μg/mL，检测限约为0.132 μg/mL；杂质E定量限约为0.265 μg/mL，检测限约为0.132 μg/mL。杂质[Asp5]-SOMA定量限约为0.285 μg/mL，检测限约为0.142 μg/mL；杂质[β-Asp5]-SOMA定量限约为0.265 μg/mL，检测限约为0.132 μg/mL。
（5）准确度
分别制备2.0%有关样品溶液(0.01 mg/mL)、1 mg/mL生长抑素样品溶液、空白样品溶液，并按质量标准上限的50 %、100 %、150 %的浓度，加入相应杂质对照品的混合溶液，制备50%准确度溶液、100%准确度溶液、150%准确度溶液，每个限度制备3个平行样。具体操作如下：
2.0%有关样品溶液(0.01 mg/mL)：取生长抑素对照品储备液(1 mg/mL) 4mL置于20 mL容量瓶，稀释所得200%含量样品溶液，取200%含量样品1 mL于20 mL客量瓶，再加入杂质对照品储备液B、C、D、E、[Asp5]-S0MA、[β-Asp5]-S0MA各2 mL，加水定容得2.0%有关样品溶液(0.01 mg/mL)。
生长抑素样品溶液(1 mg/mL)：取注射用生长抑素10支，加水1.5 mL，混匀得2 mg/mL生长抑素样品溶液，再取2 mg/mL生长抑素样品溶液，等体积加水混匀，得1 mg/mL生长抑素样品溶液。
对照品溶液：分别吸取生长抑素对照品储备液0.5 mL，各杂质对照品储备液5 mL于同一100 mL容量瓶，用超纯水稀释至刻度，摇匀即得（含各对照品5 μg/mL）。
150%准确度溶液：取2 mg/mL生长抑素样品溶液0.5 mL，加1.5 mL 2.0%有关样品溶液，摇匀即得；同法制备三份。
100%准确度溶液：取1 mg/mL生长抑素样品溶液1 mL，加入1 mL 2.0%有关样品溶液，混匀即得；同法制备三份。
50%准确度溶液：取2.0%有关样品溶液l mL，加水1 mL混匀得1.0%有关样品溶液;取1 mg/mL生长抑素样品溶液0.5 mL，加入1.0%有关样品溶液0.5 mL，混匀即得；同法制备三份。
按照实施例1色谱条件进样检测。各溶液进样序列见表9-1：
按如下计算公式计算每个限度的回收率。
计算公式：
各杂质回收率检测结果，见表9-2、9-3、9-4、9-5、9-6、9-7。
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结论：供试品中每个特定杂质的回收率均在90.0～110.0 %范围内，9个回收率的RSD均不过10.0 %，表明生长抑素冻干粉针剂产品杂质检测方法准确度良好。
实施例9：
样品检测：对批号200529生长抑素冻干粉自制品中各杂质进行检测。
（1）供试品溶液的配制：取生长抑素冻干粉12.5 mg，加水溶解并定量稀释至25mL，混匀，制成每1 mL约含生长抑素0.5 mg的溶液；
（2）对照品溶液的配制：精密称取生长抑素对照品、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀，作为各对照品贮备液。分别精密量取各杂质对照品溶液与生长抑素对照品溶液适量，置同一量瓶中，用水定量稀释制成每1mL中含生长抑素及杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA分别为5.0 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5µg、2.5 µg、2.5 µg的混合对照品溶液。
（3）系统适用性溶液：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100µg的溶液，摇匀。分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀。
色谱条件：色谱柱温度范围为55℃；流动相A为0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，pH范围在3.5，流动性B为乙腈；流速范围为1.5 ml/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂为色谱柱（柱长为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm）。
洗脱梯度：如表3所示。
测定法：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
由实施例9所得系统适用性试验色谱图见图29、所得对照品溶液色谱图见30、所得供试品溶液色谱图见图31。
由实施例9所得检测结果见表10。
结合图29、图30和图31以及表10自制品检测结果可知，生长抑素冻干粉自制品（批号200529）中杂质C不超过1.0%，杂质B、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA均不超过0.5%；其它单个杂质峰以对照品溶液色谱图中生长抑素峰面积计算，不超过0.5%；杂质总量不超过2.0%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非用以限制本发明的权利范围。任何以本申请专利范围所涵盖的权利范围实施的技术方案，或者任何熟悉本领域的技术人员，利用上述揭示的方法内容做出许多可能的变动和修饰的方案，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：
采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、以磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相A、以乙腈为流动相B、检测波长215nm，采用梯度洗脱，通过外标法，对产品中6种杂质：杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA和杂质[β-Asp5]-SOMA，进行准确定量；
所述洗脱梯度如下：
。
2.如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S01. 供试品溶液的配制：取生长抑素冻干粉12.5 mg，加水溶解并定量稀释至25 mL，混匀，制成每1 mL约含生长抑素0.5 mg的溶液；
S02. 对照品溶液的配制：精密称取生长抑素对照品、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀，作为各对照品贮备液；分别精密量取各杂质对照品溶液与生长抑素对照品溶液适量，置同一量瓶中，用水定量稀释制成每1 mL中含生长抑素、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA分别为5.0 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5 µg、2.5µg、2.5 µg、2.5 µg的混合对照品溶液；
S03. 系统适用性溶液的配制：取生长抑素对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，摇匀；再称取杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA对照品各适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1 mL中含100 µg的溶液，摇匀；分别量取各杂质对照品溶液0.1 mL与生长抑素对照品溶液1 mL后，再加水400 µL，摇匀；
S04. 检测：
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.02 mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液并用pH调节剂调节pH值至3.4-3.6作为流动相A；以乙腈为流动相B，色谱柱温度范围为50℃-60℃；流速范围为1.4-1.6 mL/min；检测波长215 nm；进样体积50 µL；梯度洗脱；
测定法：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
3. 如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S02中，所述杂质B为杂质[Des-Thr10]-SOMA、杂质C为降解杂质[Ala1(AC)]- SOMA、杂质D为杂质[Lys
4 (AC)]- SOMA、杂质E为杂质[Lys9 (AC)]- SOMA；所述6种杂质的分子式、结构式、分子量具体如下所示：
4.如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S04中，所述流动相A的pH调节剂为磷酸溶液，其浓度为10%。
5.如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S04中，所述流动相A的pH范围为3.5。
6.如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S04中，所述色谱柱温度为55℃。
7. 如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S04中，所述流速为1.5 mL/min。
8. 如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S04中，所述色谱柱，长度为300 mm，内径为3.5 mm，填料粒径为3.5 µm。
9.如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S04中，所述系统适用性试验，所得色谱图中，出峰顺序依次为生长抑素峰、杂质B峰、杂质[Asp5]-SOMA峰、杂质[β-Asp5]-SOMA峰、杂质C峰、杂质D峰、杂质E峰。
10.如权利要求1所述的一种生长抑素冻干粉针剂中杂质的检测方法，其特征在于：在步骤S04中，采用外标法对杂质B、杂质[Asp5]-SOMA、杂质[β-Asp5]-SOMA、杂质C、杂质D、杂质E进行定量计算。
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