CN115856149B

CN115856149B - 一种特利加压素中杂质的检测方法

Info

Publication number: CN115856149B
Application number: CN202211674730.0A
Authority: CN
Inventors: 苏宏健; 黄天一; 赵梓彤; 孙宝伟; 辜茂艳; 张凤莲; 钟伟良; 高巍巍; 汪莹莹; 张德方
Original assignee: Harbin Jixianglong Biological Technology Co ltd
Current assignee: Harbin Jixianglong Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2042-12-26
Also published as: CN115856149A

Abstract

本发明公开一种特利加压素中杂质的检测方法，属于杂质检测的技术领域。为了提供一种特利加压素高分子聚合物分析方法，可有效检出杂质T、杂质U及杂质W。本发明提供一种特利加压素中杂质的检测方法，所述检测方法的具体步骤如下：将特利加压素用流动相进行稀释作为检测的样品，将检测的样本稀释100倍后作为对照品，以三氟乙酸‑水‑乙腈作为流动相，获得检测的样品和对照样品的色谱图，获得杂质的产量。本发明能准确检测出特利加压素中杂质T、杂质U、杂质W等高分子聚合物的含量，可以有效控制产品中有高分子聚合物的含量，填补了现有检测方法对杂质W无法检测的不足。

Description

一种特利加压素中杂质的检测方法

技术领域

本发明属于杂质检测的技术领域，具体涉及一种特利加压素中杂质的检测方法。

背景技术

醋酸特利加压素化学名称为：三甘氨酰基赖氨酸加压素醋酸盐。是一种新型人工合成的血管加压素(VP)类似物。二十世纪八十年代初由瑞典辉凌公司生产上市，主要用于食管静脉曲张止血。目前德国Ferring GmbH公司原研产品已进入中国。制剂规格为1mg(相当于0.86mg特利加压素)，商品名称为其化学结构式为：Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly-NH₂，分子式：C₅₂H₇₄N₁₆O₁₅S₂；分子量：1227.37。

特利加压素的药理作用：特利加压素是人工合成的多肽，为垂体后叶分泌激素的类似物。注射给药后，它的三甘氨酰基会被体内酶切断而缓慢释放出活性物质如加压素，对平滑肌产生收缩作用，可持续10小时。加压素主要有两个方面的作用：一是明显的收缩血管作用，因而减少静脉血流流向肝门静脉系统，以致降低门静脉血压，具有止血作用；其二，能作用于肾脏上的某些受体，防止尿液中水分的过度流失，具有抗遗尿功能。很多动物及人体试验证明，特利加压素本身并没有如加压素一样的激素活性。适当剂量的特利加压素可降低门静脉血压，但并不会像加压素一样，对静脉血压产生明显的改变。同时，特利加压素也不会增加纤维蛋白的溶解作用。毒理作用：本品的致突变试验结果呈阴性。

特利加压素的高分子聚合物通常由原辅料引入的高分子聚合物、生产工艺过程产生高分子聚合物及存储过程中的降解产生高分子聚合物组成。这些高分子聚合物会降低分子状态特利加压素的占比，从而不仅会降低药效，还会增大药物的副作用，给患者带来安全隐患。因此对特利加压素中高分子聚合物的检测及控制成为药物制备过程不可忽视的方面。

目前，已公开的特利加压素高分子聚合物分析方法是专利文献CN110658297，该专利公开的一种特利加压素的高分子聚合物分析方法，其色谱条件是：色谱柱：TSKgelG2000SWXL，规格7.8mm×300mm，5μm；流动相：以0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液配制0.1mol/L硫酸钠溶液；检测波长：274nm；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；进样量：20μl；洗脱方式：等度洗脱。但上述已公开分析方法对特利加压素高分子聚合物的检测效能未经过充分研究，无法有效检出杂质W(Dimer特利加压素3)。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种特利加压素高分子聚合物分析方法，可有效检出杂质T(Dimer特利加压素1)、杂质U(Dimer特利加压素2)及杂质W(Dimer特利加压素3)。

本发明提供一种特利加压素中杂质的检测方法，所述检测方法的具体步骤如下：

将特利加压素用流动相进行稀释作为检测的样品，将检测的样本稀释倍100倍后作为对照品，以三氟乙酸-水-乙腈作为流动相，获得检测的样品和对照样品的色谱图，获得杂质的产量。

进一步地限定，所述杂质为Dimer特利加压素1、Dimer特利加压素2和Dimer特利加压素3。

进一步地限定，所述Dimer特利加压素1序列为

进一步地限定，所述Dimer特利加压素2序列为

进一步地限定，所述Dimer特利加压素3序列为Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly-NH₂。

进一步地限定，所述流动相是：三氟乙酸、水和乙腈的体积比为0.05：70：(27-33)。

进一步地限定，色谱条件是利用色谱柱，检测波长：208-212nm；流速：0.4-0.6ml/min；柱温：23-27℃，然后进行洗脱。

进一步地限定，所述洗脱方式为等度洗脱。

进一步地限定，色谱柱的规格是7.8mm×300mm，5μm。

进一步地限定，色谱柱的型号是TSKgel G2000SWXL。

有益效果：本发明利用溶剂(三氟乙酸-水-乙腈(0.05：70：30)溶解特利加压素检测样本，将检测样品稀释100倍后作为对照样品，以三氟乙酸-水-乙腈(0.05：70：30)作为流动相，获得检测样品色谱图和对照样品的色谱图，获得高分子聚合物的含量。本发明能准确检测出特利加压素中杂质T、杂质U、杂质W等高分子聚合物的含量，可以有效控制产品中有高分子聚合物的含量，填补了现有检测方法对杂质W(Dimer特利加压素3)无法检测的不足。

附图说明

图1空白溶剂色谱图(实施例1)；

图2系统适用性色谱图(实施例1)；

图3杂质U定位色谱图；

图4杂质T定位色谱图；

图5杂质W定位色谱图；

图6对照溶液色谱图；

图7供试品溶液色谱图；

图8空白溶剂色谱图；

图9系统适用性色谱图；

图10对照溶液(2020070120)色谱图；

图11供试品溶液(2020070120)色谱图；

图12对照溶液(2020070220)色谱图；

图13供试品溶液(2020070220)色谱图；

图14对照溶液(2020070320)色谱图；

图15供试品溶液(2020070320)色谱图；

具体实施方式

实施例1.

1.供试品溶液：取特利加压素(东曹株式会社(Tosoh Corporation)，货号0008540)用流动相(三氟乙酸-水-乙腈(0.05：70：30)配制成特利加压素浓度为0.2mg/ml的供试品定位溶液；

三氟乙酸-水-乙腈(0.05：70：30)的配制方法：量取水700ml，乙腈300ml，三氟乙酸0.5ml，混合均匀，即得。

2.对照溶液：预定量的供试品溶液，加流动相稀释至100倍，至特利加压素的浓度为2μg/ml作为对照定位溶液。

3.系统适用性溶液：取特利加压素对照品及杂质U、杂质W对照品各适量，加流动相溶解并稀释成每1ml中含特利加压素0.2mg和杂质各2μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

杂质的序列如表1所示。

表1杂质序列

3.色谱条件：色谱柱：TSKgel G2000SWXL，规格7.8mm×300mm，5μm；

流动相：三氟乙酸-水-乙腈(0.05：70：30)；

检测波长：210nm；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

进样量：20μl；

洗脱方式：等度洗脱。

4.系统适用性要求：在色谱图中，出峰顺序依次为杂质U峰(杂质T和U重合)、杂质W峰、特利加压素峰，特利加压素峰与杂质W峰分离度应不小于1.5，理论板数按特利加压素峰计算不低于2000。

5.测定法：S1：取特利加压素用流动相配制成特利加压素浓度为0.2mg/ml的供试品定位溶液；

S2：取预定量的供试品溶液，加流动相稀释至100倍，至特利加压素的浓度为2μg/ml作为对照定位溶液；

S3：计算高分子聚合物的峰面积，进而计算得出高分子聚合物的含量。所述的供试品溶液的色谱图中如有保留时间小于特利加压素峰的杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液峰面积的0.5倍(0.5％)；

S4：在上述检测方法之前还需进行色谱系统适用性试验，具体采用上述色谱条件，取特利加压素对照品及杂质U、杂质W对照品各适量，加流动相溶解并稀释成每1ml中约含特利加压素0.2mg和杂质各2μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。在色谱图中，出峰顺序依次为杂质U峰、杂质W峰、特利加压素峰，特利加压素峰与杂质W峰分离度应不小于1.5，理论板数按特利加压素峰计算不低于2000。

S5：取特利加压素约10mg，置于10ml量瓶中，取Dimer特利加压素1、2、3各约10mg，分别置于25ml量瓶中，用溶剂定容至刻度；再分别取1ml，分别置于5ml量瓶中，用溶剂定容至刻度，即为特利加压素、Dimer特利加压素1、2、3定位溶液。

S6：分别取系统适用性溶液、S1、S2、S5定位溶液20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性及各定位溶液保留时间如下表2所示：

表2

各杂质定位谱图如图1-图7所示：高分子聚合物的峰面积＝小于特利加压素峰的杂质峰面积的和；

计算公式：

由上述高分子聚合物含量计算公式计算得出特利加压素中高分子聚合物的含量为0.234％。

通过表2数据可知，杂质T、杂质U和杂质W均能与主成分有效分离，杂质T和杂质U保留时间相同，在同一位置出峰，在计算杂质量时合并计算，上述杂质在该方法中均能检出。

实施例2.

实施例2与实施例1色谱条件相同，系统适用性试验、空白试验也相同，对照溶液与供试品溶液批次(批号：2020070120，厂家：海南中玉药业有限公司)也相同，不同的是试验时间及试验仪器；其对照溶液色谱图和供试品溶液色谱图分别如图8-11所示，其峰表依次如下：

空白溶剂色谱图如图8所示，其峰表如下：

系统适用性色谱图如图9所示，其峰表如下：

对照溶液色谱图如图10所示，其峰表如下：

供试品溶液色谱图如图11所示，其峰表如下：

高分子聚合物的峰面积＝小于特利加压素峰的杂质峰面积的和；

计算公式：

由上述高分子聚合物含量计算公式计算得出特利加压素中高分子聚合物的含量为0.291％。说明在不同的试验时间及不同试验仪器，杂质仍能有效检出。

实施例3.

实施例3与实施例2色谱条件相同，系统适用性试验、空白试验也相同，不同的是对照溶液与供试品溶液批次不同(批号：2020070220，厂家：海南中玉药业有限公司)；其对照溶液色谱图和供试品溶液色谱图分别如图12-13所示，其峰表依次如下：

对照溶液色谱图如图12所示，其峰表如下：

供试品溶液色谱图如图13所示，其峰表如下：

由上述高分子聚合物含量计算公式计算得出特利加压素中高分子聚合物的含量为0.233％。说明采用不同批号的样品，杂质仍能有效检出。

实施例4.

实施例4与实施例2色谱条件相同，系统适用性试验、空白试验也相同，不同的是对照溶液与供试品溶液批次不同(批号：2020070320，厂家：海南中玉药业有限公司)，其对照溶液色谱图和供试品溶液色谱图分别如图14-15所示，其峰表依次如下：

对照溶液色谱图如图14所示，其峰表如下：

供试品溶液色谱图如图15所示，其峰表如下：

计算公式：

由上述高分子聚合物含量计算公式计算得出特利加压素中高分子聚合物的含量为0.221％，说明采用不同批号的样品，杂质仍能有效检出。

实施例5.

利用实施例1的特利加压素和方法，改变技术方案的参数范围，按照下表的条件修改。色谱柱的型号是TSKgel G2000SWXL(7.8mm×300mm，5μm)，003FA02712F和002C00929E是该型号的2根柱子的编号，用来区分同型号的2根色谱柱。

检测条件列表3所示：结果显示高分子聚合物杂质均能检测到。

表3

要求：各检测条件下应满足系统适用性要求，且各条件下杂质含量的RSD均应≤8.0％。

结果：各检测条件下系统适用性均满足要求；各检测条件下空白溶剂对杂质T、杂质U、杂质W高分子聚合物的检出无干扰，杂质W与特利加压素的分离度≥1.5，理论板数按特利加压素峰计不低于2000。通过改变波长(210±2nm)、流速(0.5±0.1ml/min)、柱温(25±2℃)、流动相乙腈比例(±3％)、同厂家不同批号色谱柱，各条件下测得杂质U+T含量的RSD(n＝10)为5.26％，各条件下测得杂质W含量的RSD(n＝10)为7.25％，均<8.0％，符合要求。

高分子聚合物方法学验证结果见下表4所示：

表4

Claims

1.一种特利加压素中杂质的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤如下：

将特利加压素用流动相进行稀释作为检测的样品，将检测的样本稀释倍100倍后作为对照品，以三氟乙酸-水-乙腈作为流动相，获得检测的样品和对照样品的色谱图，获得杂质的含量；所述杂质为Dimer特利加压素1、Dimer特利加压素2和Dimer特利加压素3；所述Dimer特利加压素1序列为

所述Dimer特利加压素2序列为

所述Dimer特利加压素3序列为Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cy s]-Pro-Lys-Gly-NH₂；

所述流动相是：三氟乙酸、水和乙腈的体积比为0.05：70：(27-33)；色谱条件是利用色谱柱，检测波长：208-212nm；流速：0.4-0.6ml/min；柱温：23-27℃，然后进行洗脱；所述洗脱方式为等度洗脱；色谱柱的规格是7.8mm×300mm，5μm；色谱柱的型号是TSKgel G2000SWXL。