CN114460187A - 一种多肽中聚合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生长抑素中聚合物的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，具体步骤如下：a、制备供试品溶液；b、制备对照溶液；c、制备分子量标准溶液；d、采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照溶液、分子量标准溶液进行检测。本发明方法检测可以将生长抑素与聚合物有效分离，准确测定生长抑素中聚合物含量，测定结果可靠，专属性强，灵敏度高，准确度，线性良好，可以有效控制生长抑素的产品质量。
Description
技术领域
本发明涉及多肽中聚合物的检测，具体涉及一种生长抑素中聚合物的检测方法，属于医药领域。
背景技术
生长抑素是一种典型的脑肠肽，是由下丘脑释放的，能够抑制垂体生长激素的释放。生长抑素的药物制剂临床常用于消化道出血，肝硬化，静脉曲张，胰腺炎。
生长抑素储存过程中会有聚合物产生，其是一类物质，非特定化合物。影响产品质量，如是共价键形成的聚合物，则可能存在较大免疫原性风险，给患者用药造成巨大隐患。目前，国内外生长抑素原料药的质量标准中均无聚合物检测项目。
发明内容
为了有效控制生长抑素的质量品质，本发明提供了一种生长抑素中聚合物的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，具体步骤如下：
a、取待测生长抑素，加流动相溶解，得供试品溶液；
b、取步骤a所得供试品溶液，用流动相稀释100～500倍，得对照溶液；
c、取生长抑素对照品，加流动相溶解，得分子量标准溶液；取流动相作为空白溶液；
d、采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照溶液、分子量标准溶液和空白溶液进行检测：
固定相：以分子量
的球状亲水改性硅胶为填充剂；
流动相：体积比0.04：23～27：77～73的三氟乙酸-乙腈-水；
流速：0.3～0.7ml/min；
波长：220nm。
进一步地，步骤a)所述待测生长抑素与流动相的质量体积比为5～15mg：20ml，优选10mg：20ml。
进一步地，步骤b)所述用流动相稀释200倍。
进一步地，步骤c)所述生长抑素对照品加0.8～5倍量流动相溶解，优选加1倍量流动相溶解；或：步骤c)所述生长抑素对照品，加2倍量流动相溶解，80℃水浴24h。
进一步地，所述的固定相为TSK-GEL G2000SWxl柱，色谱柱规格7.8mm×300mm，5μm。
进一步地，步骤d)所述色谱条件中流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样量10μl。
进一步地，步骤d)所述流动相为体积比0.05：25：75的三氟乙酸-乙腈-水。
进一步地，所述供试品溶液的色谱图中生长抑素色谱峰前，除溶剂峰，峰面积小于对照溶液色谱图中生长抑素色谱峰面积0.02倍的色谱峰外，其它色谱峰为聚合物色谱峰。
更进一步地，所述供试品溶液的色谱图中生长抑素色谱峰的理论板数不低于2000，生长抑素色谱峰与聚合物色谱峰的分离度不小于1.5，聚合物色谱峰面积总和不大于对照溶液色谱图中生长抑素色谱峰面积0.5％。
更进一步地，所述聚合物的含量按如下公式计算：
聚合物(％)＝A聚合物/(A对照×D)×100％
式中：A聚合物为供试品溶液中聚合物峰面积；A对照为对照溶液中生长抑素的峰面积；D为制备对照溶液时的稀释倍数。
本发明生长抑素中聚合物的检测方法，可以将生长抑素与聚合物有效分离，准确测定生长抑素中聚合物含量，测定结果可靠，专属性强，灵敏度高，准确度，线性良好，可以有效控制生长抑素的产品质量。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1系统适用性溶液图谱
图2高温破坏样品检测图谱
图3定量限溶液检测图谱
图4检测限溶液检测图谱
图5线性溶液检测图谱
图6准确度溶液检测图谱
图7重复性溶液检测图谱
图8中间精密度溶液检测图谱
图9溶液稳定性检测图谱
图10耐用性溶液检测图谱
图11 41190801样品检测图谱
图12 41190802样品检测图谱
图13 41190803样品检测图谱
具体实施方式
实施例1生长抑素中聚合物的检测
a、供试品溶液配制：取待测生长抑素，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每lml中含0.5mg的溶液，即得；
b、精密量取步骤a所得供试品溶液，用流动相稀释制成每1ml中含2.5μg的溶液，即得。
c、取生长抑素对照品，加流动相溶解，制成每1ml中含1mg生长抑素的标准溶液；
d、取流动相作为空白溶液；
e、采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照溶液、分子量标准溶液、空白溶液进行检测：
固定相：TSK-GEL G2000SWxl，7.8mm×300mm，5μm；
流动相：三氟乙酸-乙腈-水(0.05：25：75)；
流速：0.5ml/min；
检测波长为220nm；
柱温为30℃；
f、供试品溶液色谱图中生长抑素色谱峰保留时间前，除溶剂峰，峰面积小于对照溶液色谱图中生长抑素色谱峰面积0.02倍的色谱峰外，其它色谱峰为聚合物色谱峰；
g、供试品溶液中聚合物含量按如下公式计算：
聚合物(％)＝A聚合物/(A对照×D)×100％
式中：A聚合物为供试品溶液中聚合物峰面积；A对照为对照溶液中生长抑素的峰面积；D为制备对照溶液时的稀释倍数。
限度：供试品溶液色谱图中生长抑素主峰保留时间前如有聚合物峰，各聚合物峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积(0.5％)。
实施例2生长抑素中聚合物的检测
a、供试品溶液配制：取待测生长抑素，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每lml中含0.5mg的溶液，即得；
b、精密量取步骤a所得供试品溶液，用流动相稀释制成每1ml中含2.5μg的溶液，即得。
c、称取生长抑素对照品10mg，置于20ml容量瓶中，加流动相溶解，于80℃恒温水浴锅中放置24h后取出，放冷至室温，加入流动相稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；
d、取流动相作为空白溶液；
e、采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照溶液、标准溶液、空白溶液进行检测：
固定相：TSK-GEL G2000SWxl，7.8mm×300mm，5μm；
流动相：三氟乙酸-乙腈-水(0.05：25：75)；
流速：0.5ml/min；
检测波长为220nm；
柱温为30℃；
f、供试品溶液色谱图中生长抑素色谱峰保留时间前，除溶剂峰，峰面积小于对照溶液色谱图中生长抑素色谱峰面积0.02倍的色谱峰外，其它色谱峰为聚合物色谱峰；
g、供试品溶液中聚合物含量按如下公式计算：
聚合物(％)＝A聚合物/(A对照×D)×100％
式中：A聚合物为供试品溶液中聚合物峰面积；A对照为对照溶液中生长抑素的峰面积；D为制备对照溶液时的稀释倍数。
限度：供试品溶液色谱图中生长抑素主峰保留时间前如有聚合物峰，各聚合物峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积(0.5％)。
以下通过实验例进一步说明本发明的有益效果：
试验例1色谱条件筛选
在前期试验的基础上采取分子排阻色谱原理，根据生长抑素理化特性，进行的方法开发过程见表1。
表1色谱条件筛选过程
从筛选结果可见：采用分子排阻法色谱原理，以分子量标准品(即高温破坏杂质分子量相近的已知多肽为标准品)进行方法适用性开发研究，条件6方法用于监测生长抑素中聚合物时，聚合物峰与主成分峰可实现有效分离，可暂定该条件方法。鉴于猪胰岛素、胸腺法新等多肽标准品不易得，且以高温破坏杂质作为系统适用性溶液更为准确，故以样品高温破坏溶液作为系统适用性溶液。同时，为了提高方法的分离效能，将进样量调整为10μl。具体研究如下：
检测方法：照分子排阻色谱法(中国药典2020年版四部通则0514)测定色谱条件与系统适用性试验：用球状亲水改性硅胶(分子量适用范围为聚合物
)为填充剂(TSK-GEL G2000SWxl，7.8mm×300mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以三氟乙酸-乙腈-水(0.05：25：75)作为流动相；检测波长为220nm；以0.5ml/min的流速等度洗脱40min；柱温为30℃。
称取生长抑素对照品约10mg，置于20ml容量瓶中，加流动相适量溶解，于80℃恒温水浴锅中放置24h后取出，放冷至室温，加入流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录谱图。系统适用性图谱见图1，从图1可见理论板数按生长抑素峰计不低于2000，生长抑素峰与聚合物峰的分离度不小于1.5。
系统适用性研究结果表明，本发明色谱条件可用于生长抑素中聚合物检测。
最终确定的聚合物定量测定的方法如下：
供试品溶液配制：取待测生长抑素，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每lml中约含0.5mg的溶液，即得。
对照溶液配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相稀释制成每1ml中约含2.5μg的溶液，即得。
取生长抑素对照品，加流动相溶解，得浓度1mg/ml的标准溶液；
取体积比0.05：25：75的三氟乙酸-乙腈-水作为空白溶液；
按上述确定的色谱条件检测，获得的色谱图满足如下标准可进一步计算供试品中聚合物的含量：供试品溶液色谱图中生长抑素主峰保留时间前，除溶剂峰，峰面积小于对照溶液色谱图中生长抑素色谱峰面积0.02倍的色谱峰外，其它色谱峰为聚合物色谱峰，聚合物含量按照如下公式计算：
聚合物(％)＝A聚合物/(A对照×200)×100％
式中：A聚合物为供试品溶液中聚合物峰面积；A对照为对照溶液中生长抑素的峰面积；D为制备对照溶液时的稀释倍数。
将确定的聚合物定量测定方法应用于生长抑素质量控制，得到合格的生长抑素中聚合物限度为：各聚合物峰面积总和不大于对照溶液主峰面积(0.5％)。
实验例2方法学验证
1、仪器
表2验证用主要仪器
| 仪器 | 型号 | 厂商 |
| 高效液相色谱仪 | LC-20A | 日本岛津 |
| 高效液相色谱仪 | LC-20AD | 日本岛津 |
2、试剂
表3使用试剂、供试品及对照品目录
| 名称 | 级别 | 厂商 |
| 乙腈 | HPLC | 上海星可高纯溶剂有限公司 |
| 三氟乙酸 | HPLC | 阿拉丁 |
| 氢氧化钠 | AR | 福晨(天津)化学试剂有限公司 |
| 30％过氧化氢 | AR | 北京化工厂 |
| 盐酸 | AR | 北京化工厂 |
| 品名 | 批号 | 来源 |
| 生长抑素 | 41190801 | 成都天台山制药有限公司 |
| 生长抑素 | 41190802 | 成都天台山制药有限公司 |
| 生长抑素 | 41190804 | 成都天台山制药有限公司 |
| 名称 | 批号 | HPLC纯度(％) |
| 生长抑素工作对照品 | 20190918 | 86.91 |
3、聚合物分析方法验证
生长抑素聚合物分析方法为分子排阻色谱法，方法验证的内容包括：系统适用性、专属性(强制降解试验)、检测限和定量限、线性及范围、精密度(重复性和中间精密度)、准确度、溶液稳定性、方法耐用性。聚合物分析方法验证参数、条件及验证结果总结如下：
表4验证要求及结果
从验证结果可见：生长抑素聚合物分析方法系统适用性、专属性、线性及范围、准确度、精密度均符合规定；稳定性试验结果表明，供试品溶液及自身对照溶液室温条件下(20.2℃)24小时内稳定，因此供试品溶液及自身对照溶液配制好后应在室温条件下24h内使用；微调色谱条件，系统适用性理论板数、分离度、聚合物检出量等均符合要求，故本色谱条件适合生长抑素中聚合物的检测。
4、多批次检测结果
按照试验例1确定的方法检测三批生长抑素原料药聚合物，具体结果见表5，样品色谱图见图11-13。
表5聚合物检测结果表
| 杂质名称 | 41190801 | 41190802 | 41190804 |
| 聚合物 | 0.037％ | 0.036％ | 0.028％ |
根据上述检测结果，结合中国药典2020年版以及EP增补版中有关物质限度，确定合格的生长抑素中聚合物限度为不得过0.5％，通过本发明方法检测的3个批次生长抑素原料药中的聚合物符合该限度要求。
综上，本发明检测方法能将生长抑素与聚合物有效分离，准确测定生长抑素中聚合物含量，测定结果可靠，专属性强，灵敏度高，准确度，线性良好，可以有效控制生长抑素的产品质量。
Claims (10)
1.一种生长抑素中聚合物的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，具体步骤如下：
a、取待测生长抑素，加流动相溶解，得供试品溶液；
b、取步骤a所得供试品溶液，用流动相稀释100～500倍，得对照溶液；
c、取生长抑素对照品，加流动相溶解，得标准溶液；取流动相作为空白溶液；
d、采用如下色谱条件分别对供试品溶液、对照溶液、分子量标准溶液和空白溶液进行检测：
固定相：以分子量
的球状亲水改性硅胶为填充剂；
流动相：体积比0.04～0.05：23～27：77～73的三氟乙酸-乙腈-水；
流速：0.3～0.7ml/min；
波长：220nm。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a)所述待测生长抑素与流动相的质量体积比为5～15mg：20ml，优选10mg：20ml。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b)所述用流动相稀释200倍。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c)所述生长抑素对照品加0.8～5倍量流动相溶解，优选加1倍量流动相溶解；或：步骤c)所述生长抑素对照品，加2倍量流动相溶解，80℃水浴24h。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的固定相为TSK-GEL G2000SWxl柱，色谱柱规格7.8mm×300mm，5μm。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤d)所述色谱条件中流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样量10μl。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤d)所述流动相为体积比0.05：25：75的三氟乙酸-乙腈-水。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述供试品溶液的色谱图中生长抑素色谱峰前，除溶剂峰，峰面积小于对照溶液色谱图中生长抑素色谱峰面积0.02倍的色谱峰外，其它色谱峰为聚合物色谱峰。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征是：所述供试品溶液的色谱图中生长抑素色谱峰的理论板数不低于2000，生长抑素色谱峰与聚合物色谱峰的分离度不小于1.5，聚合物色谱峰面积总和不大于对照溶液色谱图中生长抑素色谱峰面积0.5％。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征是：所述聚合物的含量按如下公式计算：
聚合物(％)＝A聚合物/(A对照×D)×100％
式中：A聚合物为供试品溶液中聚合物峰面积；A对照为对照溶液中生长抑素的峰面积；D为制备对照溶液时的稀释倍数。
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