CN115248269A - 一种保护赖氨酸有关物质的检测方法 - Google Patents

一种保护赖氨酸有关物质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种保护赖氨酸有关物质的检测方法。采用高效液相色谱柱分离，以紫外检测器检测，以三氟乙酸水溶液为流动相A，三氟乙酸乙腈溶液为流动相B。本发明的检测方法，能够快速有效检测保护赖氨酸有关物质且主峰与各杂质间分离度较佳，线性关系良好，精密度高，准确度良好，重复性好。

Description

一种保护赖氨酸有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种保护赖氨酸有关物质的检测方法。
背景技术
多肽类药物相对于小分子药物来说稳定性较差，在体内易降解，半衰期短，这些特殊性使得该类药物的主要临床应用剂型为注射剂。而且多肽类药物常用于治疗慢性疾病，需频繁注射，给患者带来了很大的痛苦。对多肽进行化学修饰，改善其在体内稳定性，延长其在体内半衰期以减少给药次数是一种有效的解决途径，引起学术界广泛关注。多肽起始物料为保护氨基酸，保护赖氨酸进行化学修饰的位点大多选择赖氨酸上的ε-氨基，Lys中的ε-氨基碱性很强，同时具有亲核作用。Fmoc策略中，Boc基团是比较好的保护基团，对碱的稳定性好，可以有效抑制副反应的发生。保护赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)的结构式如下：
Figure BDA0003601428500000011
目前保护赖氨酸的合成及其在多肽类药物的应用多篇文献已经报道，但是保护赖氨酸有关物质的检测方法却鲜有报道，尤其是其中含有的杂质I Fmoc-Lys-OH·HCl、杂质II Fmoc-β-Ala-OH、杂质III Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH和杂质IV Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH；各杂质具体结构如下所示:
Figure BDA0003601428500000012
Figure BDA0003601428500000021
作为合成多肽药物的重要原料之一，保护赖氨酸的质量也是影响多肽类药物质量的关键因素。尤其是杂质的存在，是影响临床用药安全的重要因素，对于起始物料中的杂质引入更应该尽量避免或减少。因此很有必要提供一种可以便捷、快速检测保护赖氨酸有关物质的方法，以尽可能的控制好保护赖氨酸作为原料在多肽药物中的应用。
发明内容
保护赖氨酸中含有杂质峰，现有技术在检测保护赖氨酸时杂质与主峰不能有效的分离。本发明的目的在于提供一种保护赖氨酸有关物质的检测方法，使保护赖氨酸中各组分的峰能够有效分离，快速定位并完成检测。
本发明的技术方案如下：
一种保护赖氨酸有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法分离检测，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，三氟乙酸水溶液为流动相A，三氟乙酸乙腈溶液为流动相B，以紫外检测器检测。
优选地，所述方法中，所述的色谱柱为Sino Chrom ODS-BP、Ultimate SX-C18、Agilent ZORBAX SB-C18或Thermo BDS HYPERSIL C18。
优选地，所述方法中，所述的色谱柱规格为4.6mm×250mm。
优选地，所述方法中，待测样品的进样体积为5μL～20μL；优选为10μL。
优选地，所述方法中，所述流动相的流速为0.8～1.5ml/min；优选为1.0ml/min。
优选地，所述方法中，柱温为20℃～35℃；优选为30℃。
优选地，所述方法中，检测波长为220～265nm；优选为265nm。
进一步优选地，所述的流动相A的三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的浓度为0.08％～0.12％；流动相B的三氟乙酸乙腈溶液中三氟乙酸的浓度为0.08％～0.12％。
更一步优选地，所述方法中的流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液。
优选地，所述方法中的洗脱方式为以60～100％的B流动相梯度洗脱。
优选地，所述方法中梯度洗脱的条件如下：
Figure BDA0003601428500000031
进一步优选地，所述方法中梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0003601428500000032
在一个优选的试验方案中，该检测方法包括如下步骤：
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
精密称取Fmoc-Lys-OH·HCl对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为杂质Ⅰ定位溶液。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
精密称取Fmoc-β-Ala-OH对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为杂质Ⅱ定位溶液。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
精密称取Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为杂质Ⅲ定位溶液。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
精密称取Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为杂质Ⅳ定位溶液。
(5)保护赖氨酸定位溶液
精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为保护赖氨酸定位溶液。
2.供试品溶液的配制
精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液。
3.混合溶液的配制
精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH适量，加溶剂溶解，再分别精密量取加入步骤(1)、(2)、(3)、(4)各杂质储备液，稀释制成每1ml中含1mgFmoc-Lys(Boc)-OH、含杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各5μg的溶液作为混合溶液。
采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特-SinoChrom ODS-BP，5μm,4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；紫外检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A的三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的浓度0.08％～0.12％；流动相B的三氟乙酸乙腈溶液中三氟乙酸的浓度为0.08％～0.12％；采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000041
优选地，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特-Sino Chrom ODS-BP，5μm,4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；紫外检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A的三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的浓度0.1％；流动相B的三氟乙酸乙腈溶液中三氟乙酸的浓度为0.1％；梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0003601428500000051
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，以面积归一化法计算各杂质的含量。
优选地，所述方法中，配制溶液使用的溶剂为20％甲醇水溶液。
本发明的检测方法，能够快速有效检测保护赖氨酸有关物质且各杂质间分离度较佳，系统适用性良好，线性关系良好，精密度高，准确度良好，重复性好，使用本发明提供的洗脱梯度，混合溶液主峰与各杂质之间分离度大于1.5，供试品溶液中各杂质间分离度大于1.5。本品经强制破坏后，主峰与各杂质峰仍能够有效分离，且主峰峰纯度符合规定。整个操作非常简单，有效的将主峰与各杂质峰分离，提供了高效、可行的保护氨基酸中有关物质测定方法。
附图说明
图1：实施例1混合溶液的HPLC色谱图。
图2：实施例2供试品溶液的HPLC谱图。
图3：对比实施例1供试品溶液的HPLC谱图。
图4：杂质Ⅰ线性与范围工作曲线。
图5：杂质II线性与范围工作曲线。
图6：杂质III线性与范围工作曲线。
图7：杂质IV线性与范围工作曲线。
图8：保护赖氨酸线性与范围工作曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述，应当理解的是以下实施例仅用于例证的目的，并不用来限制本发明，一些本领域中显而易见的替换也在本发明保护范围之内。
本发明不限制保护赖氨酸的来源，可以市售所得也可以是自行制备所得。以下实施例所用的保护赖氨酸纯品是由吉尔生化(上海)有限公司提供，含有部分杂质。检测过程中所用的超纯水是临用现制，是新制的电阻率不小于18.2MΩ·cm的超纯水。其他原料如无特殊说明均可通过商业途径获得。
实施例1
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.降解试验
精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH经氧化破坏(5％过氧化氢)、高温破坏(105℃)、碱破坏(0.1M氢氧化钠)、酸破坏(0.1M盐酸)得各溶液。
分别取未破坏及上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000061
由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。各已知杂质最大吸收波长均为265.2nm，因此选定保护赖氨酸有关物质的测定波长为265nm，通过图1可以看出，选定检测波长下，混合液中各组分的分离度较好。图中峰1为Fmoc-Lys-OH-HCI；峰2为Fmoc-β-Ala-OH；峰3为Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH；峰4为保护赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)；峰5为Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。
实施例2
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000071
Figure BDA0003601428500000081
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。供试品溶液的色谱图如图2所示，Fmoc-Lys-OH-HCI的保留时间为3.805min；Fmoc-β-Ala-OH的保留时间为7.304min；Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH的保留时间为8.489min；保护赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)的保留时间为11.128min；Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH保留时间为12.829min。各组分的分离度较好。
实施例3
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为5μL，柱温：35℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速0.8ml/min，流动相A为0.12％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.12％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000082
Figure BDA0003601428500000091
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。供试品溶液的色谱图与图2相似，各组分的分离度较好。
实施例4
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为20μL，柱温：20℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.5ml/min，流动相A为0.08％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.08％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000092
Figure BDA0003601428500000101
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。供试品溶液的色谱图与图2相似，各组分的分离度较好。
实施例5
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000102
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。供试品溶液的色谱图与图2相似，各组分的分离度较好。
实施例6
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A为0.15％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.15％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000111
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。结果显示，该检测条件下，各组分间的分离度不够理想。
实施例7
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相：0.1％三氟乙酸水溶液-0.1％三氟乙酸乙腈溶液(35％：65％)。
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。结果显示，该检测条件下，杂质I～IV的分离度较差，无法有效分离开各杂质。
实施例8
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000131
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。结果显示，该检测条件下，各组分间的分离度不如图2所示的分离度好。
实施例9
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000141
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。结果显示，该检测条件下，各组分间的分离度不如图2所示的分离度好。
实施例10
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，采用如下梯度洗脱：
Figure BDA0003601428500000151
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。结果显示，该检测条件下，杂质I～IV的分离度较差，无法有效分离开各杂质。
对比实施例1
1.对照品溶液配制
(1)杂质Ⅰ定位溶液
配制过程同实施例1。
(2)杂质Ⅱ定位溶液
配制过程同实施例1。
(3)杂质Ⅲ定位溶液
配制过程同实施例1。
(4)杂质Ⅳ定位溶液
配制过程同实施例1。
(5)保护赖氨酸定位溶液
配制过程同实施例1。
2.供试品溶液的配制
配制过程同实施例1。
3.混合溶液的配制
配制过程同实施例1。
4.检测
分别取未破坏及上述各溶液，采用高效液相色谱仪分析制得的待测样品，其色谱条件为：色谱柱：依利特，Sino Chrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm；进样量为10μL，柱温：30℃；PDA检测器检测，检测波长为265nm，流速1.0ml/min，流动相：0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈溶液(40％：60％)。
记录色谱图，由对照品溶液中各杂质及保护赖氨酸保留时间定性，查看峰面积及分离度。供试品溶液的检测结果显示，该检测条件下，杂质I～IV的分离度较差，无法有效分离开各杂质，详见图3。
验证实施例
1、系统适用性试验
取混合溶液作为系统适用性溶液，连续测定6次，按照实施例2的色谱条件进行测定，记录色谱图，分别计算6次进样保护赖氨酸主峰保留时间和峰面积的平均值、相对标准偏差。测定结果见表1。
表1.系统适用性试验结果
Figure BDA0003601428500000161
由表1可知，保护赖氨酸主峰保留时间平均值为11.082min，RSD为0.03％，峰面积平均值为19695779.167，RSD为0.87％，符合要求，仪器系统适用性良好，体现该分析方法的高重复精度。
2、检测限与定量限
精密量取杂质Ⅰ～Ⅳ储备溶液及保护赖氨酸储备溶液，加溶剂采用逐步稀释法，得不同浓度的混合溶液；以信噪比S/N≈10时的浓度作为定量限浓度，以信噪比S/N≈3时的浓度作为检测限浓度。
定量限重复性试验：1份定量限溶液，按照实施例3的色谱条件进行测定，连续进样6次，记录色谱图，计算各杂质及保护赖氨酸保留时间及峰面积的相对标准偏差。
检测限重复性试验：1份检测限溶液，按照实施例3的色谱条件进行测定，连续进样3次，记录色谱图，各杂质及保护赖氨酸保留时间及峰面积的相对标准偏差。
通过计算可知，定量限重复性项下各杂质及保护赖氨酸的定量限与检测限均符合测定要求，具体如下表2：
表2各组分保留时间和封面及RSD
保留时间 峰面积RSD
杂质I 0.07 1.84
杂质II 0.05 4.02
杂质III 0.09 5.21
杂质IV 0.08 3.37
保护赖氨酸 0.08 3.53
3、线性与检测范围测定
按照“定量限与检测限”试验项下定量限溶液配制方法，分别精密量取“定量限与检测限”试验项下杂质Ⅰ～Ⅳ储备溶液及保护赖氨酸储备溶液，逐级稀释，作为线性溶液1。
分别精密量取“定量限与检测限”试验项下杂质Ⅰ～Ⅳ储备溶液及保护赖氨酸储备溶液各2.5ml，置同一25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性混合储备液。精密量取线性混合储备液0.4ml，置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为40％线性溶液2。同法分别配制80％、100％、120％、140％、160％、200％浓度的溶液，取线性溶液1～线性溶液8，按照实施例3的色谱条件进行测定，记录色谱图，以浓度(X，μg/ml)为横坐标，峰面积(Y，AU)为纵坐标，绘制标准曲线，详见图4～8。
杂质Ⅰ线性方程为：Y＝26275.5803X-1959.0075(R2＝0.9995)；
杂质Ⅱ线性方程为：Y＝35163.2522X-1530.4212(R2＝0.9996)；
杂质Ⅲ线性方程为：Y＝17723.5802X-338.5508(R2＝0.9971)；
杂质Ⅳ线性方程为：Y＝15245.3971X-502.9761(R2＝0.9988)；
保护赖氨酸线性方程为：Y＝23280.0996X-873.5247(R2＝0.9992)。
通过试验结果可知：
杂质Ⅰ在0.05～9.76μg/ml浓度范围内呈线性关系，相关系数r＝0.9997，线性关系良好；
杂质Ⅱ在0.04～9.96μg/ml浓度范围内呈线性关系，相关系数r＝0.9998，线性关系良好；
杂质Ⅲ在0.09～9.89μg/ml浓度范围内呈线性关系，相关系数r＝0.9985，线性关系良好；
杂质Ⅳ在0.10～9.81μg/ml浓度范围内呈线性关系，相关系数r＝0.9994，线性关系良好；
保护赖氨酸在0.06～10.02μg/ml浓度范围内呈线性关系，相关系数r＝0.9996，线性关系良好。
4、准确度试验
(1)对照溶液1：精密量取“定量限与检测限”试验项下杂质Ⅰ～杂质Ⅳ储备溶液各500μl，置同一50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
(2)对照溶液2：精密量取“定量限与检测限”试验项下杂质Ⅰ～杂质Ⅳ储备溶液各500μl，置同一50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)供试品溶液：精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 10.21mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(4)准确度溶液：精密称取Fmoc-Lys(Boc)-OH，置于50ml量瓶中，精密量取各杂质储备液0.25ml，加水稀释至刻度，摇匀，作为50％加标回收率溶液。同法分别配制100％、150％浓度的溶液，每个浓度平行配制3份。
分别精密量取上述各对照溶液、供试品溶液及各准确度溶液10μl，按照实施例2的色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算各准确度溶液中各杂质的回收率及相对标准偏差。
由结果知，各杂质回收率均在90％～108％之间，且9个回收率数据的RSD均小于2％，本法准确度较高。
5、重复性试验
取“准确度”试验项下对照溶液1，连续进样2次，作为对照溶液-1，对照溶液-2。
取保护赖氨酸(批号GLS180807-36802)50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加适量溶剂溶解，分别加入500μl各杂质储备溶液，溶剂稀释至刻度，摇匀，作为重复性溶液，平行配制6份，按照实施例2的色谱条件进行测定，记录色谱图。外标法计算各杂质含量、平均值及相对标准偏差，结果见表3。
表3重复性试验结果
Figure BDA0003601428500000181
Figure BDA0003601428500000191
由结果知，6份重复性溶液各杂质含量的RSD均小于2％，本法重复性较好。

Claims (10)

1.一种保护赖氨酸有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法分离检测，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，三氟乙酸水溶液为流动相A，三氟乙酸乙腈溶液为流动相B，以紫外检测器检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的色谱柱为Sino Chrom ODS-BP、Ultimate SX-C18、Agilent ZORBAX SB-C18或Thermo BDS HYPERSIL C18。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱规格为4.6mm×250mm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待测样品的进样体积为5μL～20μL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8～1.5ml/min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述柱温为20℃～35℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测波长为220～265nm。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相A的三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的浓度为0.08％～0.12％；流动相B的三氟乙酸乙腈溶液中三氟乙酸的浓度为0.08％～0.12％。
9.根据权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于，以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，0.1％三氟乙酸乙腈溶液为流动相B。
10.根据权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于，检测中进行梯度洗脱，按照下表的洗脱条件进行：
Figure FDA0003601428490000011
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117213385A (zh) * 2023-10-10 2023-12-12 江苏神力特生物科技股份有限公司 一种检测和定量牛樟芝固态发酵物中的安卓奎诺尔的方法

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