CN113092646A - 一种多肽中测定n,n-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种多肽中测定N,N二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法。本发明的分析方法具有灵敏度高、稳定性好等特点。该方法包括以下步骤：1)取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，用有机溶剂制备待测样品；2)取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，再加入用有机溶剂和混合溶剂溶解后的N,N二异丙基碳二亚胺对照品贮备液，以制备待测对照品溶液；3)采用气相色谱法对上述溶液进行检测，4)按标准加入法计算被测样品中N,N二异丙基碳二亚胺的含量。

Description

一种多肽中测定N,N-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种多肽中测定N,N-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法。

背景技术

胸腺法新是适用于治疗慢性乙型肝炎，可作为免疫损害病者的疫苗免疫应答增强剂，为化学合成的由二十八个氨基酸组成的多肽，为N-乙酰基-L-丝氨酰-L-α-天冬氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-L-α天冬氨酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-丝氨酰-L-α谷氨酰-L-异亮氨酰-L-苏氨酰-L-苏氨酰-L-赖氨酰-L-α-天冬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酰-L-α-谷氨酰-L-赖氨酰-L-赖氨酰-L-α-谷氨酰-L-缬氨酰-L-缬氨酰-L-α-谷氨酰-L-α-谷氨酰-L-丙氨酿-L-α-谷氨酰-L-天冬酰胺，注射用胸腺法新通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素、干扰素以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平，还可通过对CD4细胞的激活，增强异体和自体的人类混合淋巴细胞反应。

多肽在合成过程中经常使用到N,N-二异丙基碳二亚胺作为缩合剂。如胸腺法新合成中就使用到了N,N-二异丙基碳二亚胺。此外在生长抑素、加压素等多肽的合成中同样使用了N,N-二异丙基碳二亚胺。上述药品中使用了N,N-二异丙基碳二亚胺的，均有残留的可能，且N,N-二异丙基碳二亚胺在欧洲药典给出的基因毒性杂质之警示结构一文中明确指出了N,N-二异丙基碳二亚胺具有基因毒性杂质警示结构，是一个潜在的基因毒性杂质，在药品中是要严格控制其残留量。所以建立一种检测N,N-二异丙基碳二亚胺的方法，完善多肽的质量控制，对于提升胸腺法新等多肽质量，减少患者用药风险，是非常有必要的。

目前各国药典均未收载N,N-二异丙基碳二亚胺的有效测定方法，相关文献记载了N,N-二异丙基碳二亚胺的检测方法，如深圳翰宇药业股份有限公司、一种测定N,N-二异丙基碳二亚胺的方法(专利号CN201510148254.2)，马庆华等人、多糖蛋白结合疫苗中残余碳二亚胺(EDAC)的检测方法的建立(第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会)，但是上述方法采用了液质联用的方式进行测定，该方法需要购买价格高昂的质谱，对于大多数企业而言，操作繁琐、实用性不强。

因此，建立一套操作简单，定量准确并且实用的定量分析方法、以测定多肽产品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量，特别是胸腺法新产品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量是非常有必要的，这有助于提高用药的安全性。

发明内容

针对以上技术情况，本发明提供一种测定N,N-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法，特别是胸腺法新中N,N-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法。本发明方法包括以下步骤：

一种多肽中测定N,N-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法，包括以下步骤：

1)取N,N-二异丙基碳二酰亚胺适量，用有机溶剂和混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品贮备液；取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，再加入适量对照品贮备液，混匀并用混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品溶液；

2)取待测多肽样品适量，加入碱性溶剂使其溶解后，再用混合溶剂进行稀释，作为供试品溶液；

3)采用气相色谱法对上述溶液进行检测，其中气相色谱条件为：

色谱柱：以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的色谱柱或性质相同、相似的其他色谱柱；

色谱柱升温程序：起始柱温为30℃～60℃；保持时间为0分钟～20分钟；升温速率为2℃～20℃/min，升至60℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至80℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至100℃～240℃，保持0分钟～15分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至240℃～260℃，保持10分钟～25分钟；

4)按标准加入法计算被测样品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量。

优选的，色谱柱升温程序：起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟；

N,N-二异丙基碳二亚胺其中，所述步骤1)和2)中的多肽样品为胸腺法新。

作为本发明实施方案之一，所述步骤1)和2)中的碱性溶剂选自水配制的氢氧化钠溶液，作为进一步实施方案之一，本发明所述碱性溶剂的浓度为0.5％～1.0％(w/w)；作为更进一步实施方案之一、本发明所述碱性溶剂的浓度为1.0％的氢氧化钠溶液(w/w)；

作为本发明实施方案之一，所述步骤1)和2)中的多肽样品溶解后的pH值应不低于8，是为了保证多肽样品溶液呈现碱性环境，避免待测成分N,N-二异丙基碳二亚胺在酸性条件下结合成盐导致沸点升高，无法有效汽化而影响方法灵敏度；

作为本发明实施方案之一，所述步骤1)中的有机溶剂可以是本领域的可溶解N,N-二异丙基碳二亚胺的有机溶剂，所述有机溶剂包括但不限于除甲醇、乙醇外的醇类、或它们的任意组合；作为进一步实施方案之一，本发明所述有机溶剂为甲醇、乙醇或它们任意混合的溶液。

作为本发明实施方案之一，所述步骤2)中的混合溶剂可以是本领域的水与甲醇、水与乙醇或水与甲醇和乙醇它们任意混合的溶液；作为进一步实施方案之一，本发明所述混合溶剂为90％甲醇水溶液。

作为本发明实施方案之一，所述步骤1)和2)中使用的水为纯化水和超纯水；作为进一步实施方案之一，本发明所述水为电导率小于等于2μS/cm的纯化水；

作为本发明实施方案之一，所述步骤2)中的色谱柱包括以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的色谱柱；本领域技术人员可以结合本发明及本领域常识来选择可以实现本发明目的与本发明所述色谱柱的性质相同或相似的其他色谱柱、以用于本发明。

作为实施方案之一，本发明所述色谱柱为以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱；本领域技术人员可以结合本发明及本领域常识来选择可以实现本发明目的与本发明所述色谱柱的性质相同或相似的其他色谱柱、以用于本发明。作为进一步实施方案之一，所述步骤3)中色谱柱的规格为：30m～60m长度；0.1μm～5μm膜厚、0.25mm～0.53mm内径；作为更进一步实施方案之一、所述色谱柱为30m×0.53mm×5μm的色谱柱。

本发明方法中、本领域技术人员可以结合本发明所使用溶剂特性及常识来确定所述步骤3)中的色谱柱升温程序，本领域技术人员知道，色谱柱需采用升温程序洗脱不同的溶剂，因不同溶剂的沸点不同，故升温是为了实现不同溶剂的洗脱；但保持适当的升温速率以实现本发明是非常必要的、而升温速率过快会使色谱图的基线升高过大过尖，不够美观，升温速率过慢则会增加时间成本。

本发明方法中对于梯度温度及维持时间也可以由本领域技术人员根据本发明内容及结合本领域常识进行确定，其中梯度温度及维持时间合适，可保证N,N-二异丙基碳二亚胺在短时间内洗脱，改变梯度温度，尤其是降低起始温度，则N,N-二异丙基碳二亚胺可能不会在短时间内洗脱，这时若想保证N,N-二异丙基碳二亚胺洗脱，则需要增加维持时间，增加了检验成本。反之，升高温度并降低维持时间，可减少检验成本。

为了更好实现本发明目的、作为实施方案之一、本发明所述升温程序优选为：起始柱温为30℃～60℃；保持时间为0分钟～20分钟；升温速率为2℃～20℃/min，升至60℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至80℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至100℃～240℃，保持0分钟～15分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至240℃～260℃，保持10分钟～25分钟；作为进一步实施方案之一、所述步骤2)中的升温程序为：起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟。

本发明方法中，所述步骤2)中气相色谱条件还进一步包括进样体积。本领域技术人员可以根据本发明结合本领域常识进行确定本方法中的进样体积，作为实施方案之一，所述步骤3)中的进样体积为1μl～10μl；优选为1μl。

本发明方法中，所述步骤2)中气相色谱条件还进一步包括柱流量。

本领域技术人员可以根据本发明结合本领域常识进行确定本方法中的柱流量，作为实施方案之一，所述步骤3)中的柱流量为1ml/min～10ml/min；优选为1ml/min。

本发明中所述载气为本领域常用的高纯度氮气或氦气，进一步优选为高纯度氮气；其中所述的高纯度是指纯度范围≥99.99％。

本发明方法中对于进样、既可以分流进样、也可以不分流进样。本领域技术人员可以结合本发明针对不同检查对象的不同的限度要求进行选择，只要能满足响应灵敏度的要求即可。本发明方法中当采用分流进样式时、本领域技术人员可以根据本发明并结合本领域常识来确定分流比、作为实施方案之一、所述步骤2)中的分流进样的分流比为1∶1～15∶1，优选分流比为5∶1。本文所述的分流比为本领域的常规技术术语，即分流比的气流即为载气，作为示例性的说明、当分流比为1∶1时，系指将1份进样量分成2份，取一份进行测定，另一份随尾气排放出去；同理、当分流比为15∶1，即将1份进样量分为16份，取一份进行测定，其他15份随尾气排放出去。本发明方法中当分流比为15∶1时，只需调整样品浓度，以胸腺法新为例、可将供试品浓度提高至20mg/ml、即可满足本发明检测0.002mg/ml浓度的N,N-二异丙基碳二亚胺。

本发明方法中，所述步骤2)中色谱条件进还包括进样口温度和检测器温度。所述进样口温度的设定一般根据所用溶剂的沸点而定，通常需高于所用溶剂的沸点20℃以上，并不得低于150℃，且最好不要高于色谱柱所能耐受的最高温度，以保证溶剂能在瞬间完全汽化以及延长色谱柱的使用寿命；检测器温度的一般要求是大于或等于程序升温的最高温度，且并不得低于150℃，以阻止水汽凝结，防止氢火焰熄灭。为了更好实现本发明目的，本发明方法中优选进样口温度的范围为150℃～300℃，检测器温度的范围为150℃～350；作为实施方案之一、进一步优选所述色谱仪的进样口温度为250℃；检测器温度为250℃。

本发明方法可以用于可溶于本发明所述碱性溶剂、有机溶剂和混合溶剂的任何多肽产品中的N,N-二异丙基碳二亚胺的定量分析，所述被测产品包括但不限于以胸腺法新或其他可溶解于本发明所述溶剂的药品；对于待测溶液中被测产品的浓度，可以由本领域技术人员结合本发明及本领域常识进行确定。

作为实施方案之一，本发明方法中所述步骤1)中待测样品优选为胸腺法新。作为更进一步实施方案之一，优选待测样品溶液中的浓度为10mg/ml～300mg/ml，优选所述胸腺法新的浓度为20mg/ml。作为本发明实施方案之一，所述步骤1)中所述N,N-二异丙基碳二亚胺的来源不受任何限制，可以是来自市售、也可以本领域技术人员进行制备、为了更好地实现本发明、可以采用市售的试剂级别的N,N-二异丙基碳二亚胺；作为本发明实施方案之一，所述步骤2)中N,N-二异丙基碳二亚胺对照品贮备液的浓度为10μg/ml～1500μg/ml；作为更进一步实施方案之一、优选所述N,N-二异丙基碳二亚胺对照品贮备液浓度为20μg/ml。

优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：

1)、精密称取N,N-二异丙基碳二酰亚胺约200mg，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加90％甲醇稀释至刻度，作为对照品贮备液，精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，再加对照品贮备液2ml，混匀，用90％甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液；

2)、精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，用90％甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；

3)、采用气相色谱法对上述溶液进行检测，其中气相色谱条件为：

色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷毛细管柱DB-1(30m×0.53mm×5μm)；流速：1ml/min，分流比：5:1，进样体积：1μl；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃，

色谱柱升温程序，起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟；

4)按标准加入法计算被测样品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量。

本发明相对于现有的检测方法，主要在以下方面进行改进：

1)、检验和维护成本低，操作简便，无需配备价格高昂和维护成本较高的质谱仪；

2)、使用常规试剂氢氧化钠、甲醇、乙醇即可完成检验，无需使用盐酸等管制试剂。

3)、本发明还可同步测定多肽合成过程中用到其他残留溶剂如六氢哌啶和三异丙基硅烷，实用性优异。

本方法专属性强，N,N-二异丙基碳二亚胺具有良好的相关性，灵敏度高，重复性良好，能够准确快速待测样品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量。特别是用于胸腺法新中的N,N-二异丙基碳二亚胺含量的定量分析时，本发明方法可以使胸腺法新的回收率达到95％以上，准确度较高，保证了胸腺法新的用药的安全。

经方法学验证，本发明方法线性相关系数可达0.9990，远高于气相色谱法0.990的线性相关系数要求。

本发明方法中对于N,N-二异丙基碳二亚胺的检测灵敏度可达0.002mg/ml，远低于胸腺法新中N,N-二异丙基碳二亚胺的基因毒性杂质限度0.02mg/ml的要求。

本发明方法中对于胸腺法新中N,N-二异丙基碳二亚胺的基因毒性杂质限度0.02mg/ml的计算方式为根据ICH M7毒性阈值1.5μg/day并结合胸腺法新最大日剂量1.6mg以及待测样品浓度20mg/ml计算而得。

本发明经方法学验证，平行测定6次样品的加样回收率的RSD为1.67％，低于药典该项验证不高于3％的规定值，因而重复性良好。

附图说明

图1：实施例1中N,N-二异丙基碳二亚胺定位溶液GC图；

图2：实施例4中空白溶剂GC图。

图3：实施例4中供试品溶液GC图

图4：实施例6中线性关系图

具体实施方式

本发明通过以下实施例和实验例进一步阐述本发明，但本发明并不受限于此。

为了进一步理解本发明，下面结合实施实例对本发明进行详细说明。其中，电子天平购自OHAUS，CP214型和CP3102型；以及赛多利斯，APC225D型；气相色谱仪购自安捷伦公司，Agilent8890型；甲醇购自美国天地公司，HPLC级；氢氧化钠购自成都市科隆化学品有限公司，AR级；N,N-二异丙基碳二酰亚胺购自苏州昊帆生物科技有限公司，AR级；色谱柱购自安捷伦公司，DB-1(30m*0.53mm*5μm)；胸腺法新来源海南中和药业股份有限公司。

实施例1：溶液的配制

溶剂(90％甲醇)：取甲醇约900ml，加水稀释至1000ml。

1.0％氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠约1g，置于100ml量瓶中，加水溶解，放冷至室温后，用水稀释至刻度。

N,N-二异丙基碳二酰亚胺定位溶液：精密称取N,N-二异丙基碳二酰亚胺约200mg，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密量取1ml，置20ml量瓶中，加90％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品贮备液：分别精密称取N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)约200mg，置同一100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加90％甲醇稀释至刻度。

对照品溶液：精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，再加对照品贮备液2ml，混匀，用90％甲醇稀释至刻度。(临用新配)

供试品溶液：精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，用90％甲醇稀释至刻度。(临用新配)

检测限溶液：精密称取胸腺法新200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，再加对照品贮备液0.2ml，混匀，用90％甲醇稀释至刻度。(临用新配)

定量限溶液：精密称取胸腺法新200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，再加对照品贮备液0.4ml，混匀，用90％甲醇稀释至刻度。(平行配制6份，临用新配)

20％线性：精密称取胸腺法新201.22mg，置10ml量瓶中，加入2ml 1.0％氢氧化钠溶液溶解，再加入0.4ml对照品贮备液，用溶剂稀释至刻度。(临用新配)

50％线性：精密称取胸腺法新200.72mg，置10ml量瓶中，加入2ml 1.0％氢氧化钠溶液溶解，再加入1.0ml对照品贮备液，用溶剂稀释至刻度。(临用新配)

75％线性：精密称取胸腺法新200.80mg，置10ml量瓶中，加入2ml 1.0％氢氧化钠溶液溶解，再加入1.5ml对照品贮备液，用溶剂稀释至刻度。(临用新配)

100％线性：精密称取胸腺法新200.84mg，置10ml量瓶中，加入2ml 1.0％氢氧化钠溶液溶解，再加入2.0ml对照品贮备液，用溶剂稀释至刻度。(临用新配)

125％线性：精密称取胸腺法新201.26mg，置10ml量瓶中，加入2ml 1.0％氢氧化钠溶液溶解，再加入2.5ml对照品贮备液，用溶剂稀释至刻度。(临用新配)

150％线性：精密称取胸腺法新201.04mg，置10ml量瓶中，加入2ml 1.0％氢氧化钠溶液溶解，再加入3.0ml对照品贮备液，用溶剂稀释至刻度。(临用新配)

50％回收率溶液：精密称取胸腺法新原料药200.71mg，置10ml量瓶中，加1.0％氢氧化钠溶液2ml溶解，加入对照品贮备液1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。(平行配制3份，临用新配)

100％回收率溶液：精密称取胸腺法新原料药200.59mg，置10ml量瓶中，加1.0％氢氧化钠溶液2ml溶解，加入对照品贮备液2ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。(平行配制3份，临用新配)

150％回收率溶液：精密称取胸腺法新原料药200.57mg，置10ml量瓶中，加1.0％氢氧化钠溶液2ml溶解，加入对照品贮备液3ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。(平行配制3份，临用新配)

重复性试验溶液：配制同100％回收率溶液，平行配制6份，临用新配。

实例2、检测条件

气相条件如下：

实例3、系统适用性

对照品溶液连续进样6针，N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰面积的相对标准偏差(RSD)应不高于10.0％，保留时间的相对标准偏差(RSD)应不高于1.0％，理论塔板数均应不低于5000。

表1 6针对照品进样结果

由表1可知，6针对照品溶液中N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰面积的相对标准偏差(RSD)小于3％，保留时间的相对标准偏差(RSD)小于0.1％，理论塔板数均大于500000，系统适用性良好。

实例4、专属性

取溶剂、N,N-二异丙基碳二酰亚胺定位溶液，供试品溶液各进样1针，空白溶剂和供试品溶液不干扰N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰的测定。

表2 专属性试验结果

溶液名称	保留时间(min)	分离度
			溶剂	/	/
供试品溶液	/	/
			N,N-二异丙基碳二酰亚胺定位溶液	30.988	/

由表2可知，供试品溶液和溶剂均不干扰N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰的测定，专属性良好。

实例4、检测限

取检测限溶液连续测定6次，N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰信噪比S/N不低于3，重复进样6次结果峰面积RSD不大于20％。

表3 检测限试验结果

由表3可知，N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰信噪比S/N不低于3，重复进样6次结果峰面积RSD不大于10％，检测限浓度为0.002mg/ml，相当于供试品浓度的0.01％。

实例5、定量限

取6份定量限溶液各进样1针，N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰信噪比S/N不低于10，重复进样6次结果峰面积RSD不大于10％。

表4 定量限试验结果

由表4可知，N,N-二异丙基碳二酰亚胺峰信噪比S/N不低于10，重复进样6次结果峰面积RSD不大于5％，定量限浓度为0.004mg/ml，相当于供试品浓度的0.02％。

实例6、线性

取各线性溶液各进样1针，N,N-二异丙基碳二酰亚胺相关系数应不低于0.990，y轴截距/100％浓度响应值应不高于25％。

表5 线性试验结果

由表5可知，N,N-二异丙基碳二酰亚胺在限度浓度20％～150％(浓度：0.0041mg/ml～0.0304mg/ml)范围内，浓度和响应值呈良好线性，回归方程为y＝1115.9447x+0.6995，相关系数为0.9990，y轴截距/100％浓度响应值为3.02％，线性良好。

实例7、回收率试验

取对照品溶液、供试品溶液、各浓度回收率溶液各进样1针，回收率应在80％～120％范围内，全部样品回收率RSD≤10％。

表6 回收率试验结果

由表6可知，每个浓度下N,N-二异丙基碳二酰亚胺回收率均在101.70％～114.43％范围内，回收率RSD不高于2.66％，符合要求，准确度高。

实例8、重复性试验

取对照品溶液1份、100％回收率溶液6份各进样1针，N,N-二异丙基碳二酰亚胺的含量RSD应不高于10％。

表7 回收率试验结果

由表7可知，重复性6份供试品溶液中各残留溶剂含量RSD不高于2％，重复性良好。

实例8、耐用性试验

调整条件如下：

取对照品溶液1份、100％回收率溶液2份各进样1针，全部条件下各残留溶剂含量RSD≤20％。

表9 耐用性试验结果

由表9可知，全部条件下，N,N-二异丙基碳二酰亚胺的含量RSD均不高于4％，耐用性良好。

实施例9、本发明的检测方法

1)、精密称取N,N-二异丙基碳二酰亚胺约200mg，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加90％甲醇稀释至刻度，作为对照品贮备液，精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，再加对照品贮备液2ml，混匀，用90％甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液；

2)、精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，用90％甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；

3)、采用气相色谱法对上述溶液进行检测，其中气相色谱条件为：

色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷毛细管柱DB-1(30m×0.53mm×5μm)；流速：1ml/min，分流比：5:1，进样体积：1μl；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃，

色谱柱升温程序，起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟；

4)按标准加入法计算被测样品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量。

试验例1、本发明的筛选过程1

本品为多肽类药物，采用有机相溶解不利于API的溶解，故选择一定含有一定比例有机相的水溶液作为溶剂进行初步开发。

1)以50％DMSO或50％DMF为溶剂，配制胸腺法新浓度10mg/ml，结果样品溶液浑浊。

2)将溶剂更换为50％甲醇，称取胸腺法新约100mg，置10ml量瓶中，加入0.1％NaOH溶液2.0ml溶解，再用50％甲醇稀释至刻度(澄清)。

3)、取胸腺法新约100mg，置10ml量瓶中，加入0.1％NaOH溶液2.0ml溶解，再加入含N,N-二异丙基碳二酰亚胺约为1mg/ml的贮备液0.5ml，再以50％甲醇稀释至刻度，结果溶液发生浑浊。

4)、取胸腺法新约100mg，置10ml量瓶中，加入0.1％NaOH溶液2.0ml溶解，再加入含N,N-二异丙基碳二酰亚胺约为1mg/ml的贮备液1ml，平行配制3份，再分别以50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇稀释至刻度，结果以50％甲醇溶液和70％甲醇溶液的样品发生浑浊，90％甲醇为溶剂的样品澄清。

5)、0.1％氢氧化钠溶液和90％甲醇为混合溶剂配制对照品溶液和供试品溶液进行试验，其中供试品溶液为取胸腺法新100mg，置10ml量瓶中，加入0.1％氢氧化钠溶液2.0ml溶解后，再加入含N,N-二异丙基碳二酰亚胺约为1mg/ml的溶液1ml，用90％甲醇溶液稀释至刻度；对照品溶液为用甲醇制备含N,N-二异丙基碳二酰亚胺约为1mg/ml的溶液，再取1ml，置10ml量瓶中，用90％甲醇稀释至刻度；色谱条件为色谱柱升温程序，起始柱温为40℃；保持时间为10分钟；以20℃/min的升温速率升至240℃，维持10分钟；色谱柱为100％二甲基聚硅氧烷毛细管柱DB-1(30m×0.53mm×5μm)；流速：3ml/min，分流比：10:1，进样体积：1μl；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃。结果N,N-二异丙基碳二酰亚胺回收率为57％。

试验例2、本发明的筛选过程2

以1.0％氢氧化钠溶液和90％甲醇为混合溶剂配制对照品溶液和供试品溶液进行试验，其中供试品溶液为取胸腺法新100mg，置10ml量瓶中，加入0.1％氢氧化钠溶液2.0ml溶解后，再加入含N,N-二异丙基碳二酰亚胺约为1mg/ml的溶液1ml，用90％甲醇溶液稀释至刻度；对照品溶液为用甲醇制备含N,N-二异丙基碳二酰亚胺约为1mg/ml的溶液，再取1ml，置10ml量瓶中，用90％甲醇稀释至刻度；色谱条件为色谱柱升温程序，起始柱温为40℃；保持时间为10分钟；以20℃/min的升温速率升至240℃，维持10分钟；色谱柱为100％二甲基聚硅氧烷毛细管柱DB-1(30m×0.53mm×5μm)；流速：3ml/min，分流比：10:1，进样体积：1μl；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃。结果N,N-二异丙基碳二酰亚胺回收率为97％，但该方法下N,N-二异丙基碳二酰亚胺附近容易产生干扰，需对升温程序进行优化，且灵敏度略有不足，需进一步提高灵敏度。

试验例3、本发明的筛选过程3

1)、对照品贮备液：取N,N-二异丙基碳二酰亚胺约600mg→100ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，量取1ml，置20ml量瓶中，用90％甲醇稀释至刻度。

2)、对照品溶液：取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用90％甲醇稀释至刻度。进2针。

3)、回收率溶液

4)、50％回收率溶液：取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加1.0％NaOH溶液2ml溶解，再加对照品贮备液0.5ml，用90％甲醇稀释至刻度。进2针。

5)、100％回收率溶液：取胸腺法新约300mg，置10ml量瓶中，加1.0％NaOH溶液2ml溶解，再加对照品贮备液1ml，用90％甲醇稀释至刻度。进2针。

6)、150％回收率溶液：取胸腺法新约300mg，置10ml量瓶中，加1.0％NaOH溶液2ml溶解，再加对照品贮备液1.5ml，用90％甲醇稀释至刻度。进2针。

7)、色谱柱升温程序，起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟。

8)、其他气相色谱条件，色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷毛细管柱DB-1(30m×0.53mm×5μm)；流速：1ml/min，分流比：5:1，进样体积：1μl；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃。

9)、表10本发明的筛选过程3结果

根据上面结果可发现，50％回收率、100％回收率和150％回收率峰面积呈线性关系，但回收率仅有82～87％，推测有基质效应。

试验例3、本发明的筛选过程4

1)、对照品贮备液：取六氢哌啶、三异丙基硅烷和N,N-二异丙基碳二酰亚胺各约200mg→100ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，量取5ml，置100ml量瓶中，用90％甲醇稀释至刻度。

2)、对照品溶液：取胸腺法新200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，加入对照品贮备液2ml，用90％甲醇稀释至刻度。进5针。

3)、回收率溶液

4)、50％回收率溶液：取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加1.0％NaOH溶液2ml溶解，再加对照品贮备液1ml，用90％甲醇稀释至刻度。平行配制2份。

5)、100％回收率溶液：取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加1.0％NaOH溶液2ml溶解，再加对照品贮备液2ml，用90％甲醇稀释至刻度。平行配制2份。

6)、150％回收率溶液：取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加1.0％NaOH溶液3ml溶解，再加对照品贮备液1.5ml，用90％甲醇稀释至刻度。平行配制2份。

7)、色谱柱升温程序，起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟。

8)、其他气相色谱条件，色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷毛细管柱DB-1(30m×0.53mm×5μm)；流速：1ml/min，分流比：5:1，进样体积：1μl；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃。

9)、表11 本发明的筛选过程4结果

结果表明：N,N-二异丙基碳二酰亚胺回收率均大于100％，说明基质效应消除。

Claims (10)

1.一种多肽中测定N,N-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取N,N-二异丙基碳二酰亚胺适量，用有机溶剂和混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品贮备液；取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，再加入适量对照品贮备液，混匀并用混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品溶液；

2)取待测多肽样品适量，加入碱性溶剂使其溶解后，再用混合溶剂进行稀释，作为供试品溶液；

3)采用气相色谱法对上述溶液进行检测，其中气相色谱条件为：

色谱柱：以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的色谱柱或性质相同、相似的其他色谱柱；

色谱柱升温程序：起始柱温为30℃～60℃；保持时间为0分钟～20分钟；升温速率为2℃～20℃/min，升至60℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至80℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至100℃～240℃，保持0分钟～15分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至240℃～260℃，保持10分钟～25分钟；

4)按标准加入法计算被测样品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤1)和2)中的多肽样品为胸腺法新；

所述步骤1)和2)中的碱性溶剂选自水配制的氢氧化钠溶液，优选的碱性溶剂的浓度为0.5％～1.0％(w/w)；

所述步骤1)和2)中的多肽样品溶解后的pH值应不低于8；

所述步骤1)和2)中的有机溶剂选自甲醇、乙醇或它们任意混合的溶液，

所述步骤2)中的混合溶剂选自水与甲醇、水与乙醇或水与甲醇和乙醇它们任意混合的溶液；

所述步骤1)和2)中使用的水为纯化水和超纯水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)和2)中的碱性溶剂的浓度为1.0％的氢氧化钠溶液(w/w)，

所述步骤2)中的混合溶剂为90％甲醇水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的色谱柱为以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱的色谱柱，优选的色谱柱为：30m～60m长度；0.1μm～5μm膜厚、0.25mm～0.53mm内径，进一步优选的色谱柱为30m×0.53mm×5μm的色谱柱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的气相色谱条件还包括：柱流量为1ml/min～10ml/min，优选的柱流量为1ml/min；

所述步骤3)中所述载气为高纯度氮气或氦气；

所述步骤3)中的气相色谱条件还包括：分流进样或不分流进样，其中，分流进样的分流比为1∶1～15∶1，

优选的，分流进样的分流比为5∶1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的气相色谱条件还包括：色谱仪的进样口温度为150℃～300℃；检测器温度为150℃～350℃，优选的，色谱仪的进样口温度为250℃；检测器温度为250℃；

所述步骤3)中的气相色谱条件还包括：进样体积1μl～10μl，优选的，色谱仪的进样体积为1μl。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的待测样品溶液中胸腺法新的浓度为10mg/ml～300mg/ml，优选的，待测样品溶液中胸腺法新的浓度为20mg/ml。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中N,N-二异丙基碳二亚胺对照品贮备液浓度为10μg/ml～1500μg/ml，优选的N,N-二异丙基碳二亚胺对照品贮备液浓度为20μg/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱柱升温程序：起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、精密称取N,N-二异丙基碳二酰亚胺约200mg，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加90％甲醇稀释至刻度，作为对照品贮备液，精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，再加对照品贮备液2ml，混匀，用90％甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液；

2)、精密称取胸腺法新约200mg，置10ml量瓶中，加入1％氢氧化钠溶液2ml溶解，用90％甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；

3)、采用气相色谱法对上述溶液进行检测，其中气相色谱条件为：

色谱柱：100％二甲基聚硅氧烷毛细管柱DB-1，型号30m×0.53mm×5μm；流速：1ml/min，分流比：5:1，进样体积：1μl；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；

色谱柱升温程序，起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟；

4)按标准加入法计算被测样品中N,N-二异丙基碳二亚胺的含量。

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