CN107793467A - 过量碳二亚胺在升高的温度下肽合成中的使用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及过量碳二亚胺在升高的温度下肽合成中的使用。本发明公开了将氨基酸偶联成肽或拟肽的改进的方法，其中活化和偶联在同一容器中、在相比于所述氨基酸大于1当量的量的碳二亚胺的存在下、在活化剂添加剂的存在下、和在大于30℃的温度下进行。

Description

过量碳二亚胺在升高的温度下肽合成中的使用
技术领域
本发明涉及肽合成，并特别涉及固相肽合成(solid phase peptide synthesis,SPPS)。
背景技术
贯穿说明书和权利要求，使用了一些首字母缩略词。它们通常是技术人员所熟悉的。如本文所使用，它们具有以下含义：
EtOH：乙醇
HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐。
HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐。
HCTU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐。
PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷鏻六氟磷酸盐。
PyAOP：7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷鏻六氟磷酸盐。
DIEA：二异丙基乙胺。
NMM：N-甲基吗啉。
Cys(Trt)：半胱氨酸(三苯甲基)。
DMAP：4-二甲基氨基吡啶。
NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮。
TIS：三异丙基硅烷。
DODt：3,6-二氧杂-1,8-辛烷-二硫醇。
MBHA：(4-甲基二苯甲基胺)。
或许最常使用和研究的肽合成活化方法基于碳二亚胺的使用。它们在肽合成中的使用追溯到1955年，其中N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)用于促进酰胺键形成。碳二亚胺包含两个弱碱性氮原子，其将与氨基酸衍生物的羧酸反应形成如图1所示的高度反应性的O-酰基异脲化合物。然后形成的O-酰基异脲可与胺立即反应形成肽键或转化为其它反应性物质。
O-酰基异脲的高反应性也促进几个其他不期望的途径，其也如图1所示可能导致或可能不会导致肽键形成。向非反应性N-酰基脲的转化防止偶联，而通过噁唑酮形成可发生活化的手性氨基酸的差向异构化。通过使用相比于碳二亚胺过量的氨基酸可形成高度反应性的对称酸酐。然而，该方法不期望地消耗额外的氨基酸当量。
随着在碳二亚胺活化期间1-羟基苯并三唑(HOBt)作为添加剂的掺入，出现了碳二亚胺活化方法的重大改进。HOBt迅速地将O-酰基异脲转化为高度反应性OBt酯，和避免不期望的N-酰基异脲和噁唑酮形成。随后表明1-羟基 -7-氮杂苯并三唑(HOAt)由于7-位氮的邻基效应而是HOBt的有利替代物 [161]。许多其它添加剂可用于代替HOBt和HOAt，列举若干常见实例，例如， 6-氯代-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBt)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma，OxymaPure，ECHA)和1-羟基-2,5-吡咯烷二酮(NHS)。
典型地，相比于氨基酸和碳二亚胺加入1当量的添加剂。然而，最近的研究揭示，添加剂降至低于1当量可能是有用的。(S.Nozaki,"Delay of coupling caused by excessadditives,"J.Pept.Sci.,vol.12,pp.147-153,2006)。作者发现通过胺和添加剂之间的盐形成可妨碍酰化反应。然而，作者还发现，添加剂降至低于1当量减慢了活化速率并略微增加片段偶联中的差向异构化。
N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)作为优选的用于肽活化的碳二亚胺已很大程度上代替了DCC。DCC不期望地产生仅在TFA中可溶的脲，使其难以用于 Fmoc化学。另外，DCC为难以处理并且已报道引起变态反应(allergic reaction) 的蜡质固体。可选地，DIC由于其生成的脲在有机溶剂中溶解度的提高、报道的变态反应发生率更低以及与DCC相似的低成本而是有利的。目前仍使用的最流行的偶联方法之一基于DIC/HOBt，这是因为其低成本和低副反应同时常规地提供有效偶联。
最近对基于苯并三唑的添加剂，例如HOBt、HOAt和6-Cl-HOBt的分析，已导致它们重分类为1类爆炸物。苯并三唑添加剂的该不期望的特点，已增加了开发苯并三唑添加剂的合适替代物的兴趣。一个这样的替代物是Oxyma (2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯)，首次报道于1973年(参见，M.Itoh, "Peptides.IV.Racemization Suppression by the Use ofEthyl-2-Hydroximino-2-cyanoacetate and Its Amide,"Bull.Chem.Soc.Jpn.,vol. 46,pp.2219-2221,1973)。更近期地，用差示扫描量热法(DSC)和加速量热法 (ARC)试验了Oxyma的爆炸性质，Oxyma具有相比于HOBt更有利的结果。(R. -Funosas,"Oxyma:AnEfficient Additive for Peptide Synthesis to Replace the Benzotriazole-BasedHOBt and HOAt with a Lower Risk of Explosion,"Chemistry,vol.15,pp.9394-9403,2009)。
然而，在室温合成条件下使用基于碳二亚胺的活化方法，可导致由于相对慢的活化过程和更酸性的偶联环境所造成的高水平缺失(deletion)。这已导致更快速的基于鎓盐的活化方法更近期的发展。然而，基于鎓盐的活化要求使用碱性物质首先使羧酸去质子化，由此生成与鎓盐活化剂反应的羧酸根阴离子。很多鎓盐(其中，HBTU、HATU、PyBOP、PyAOP、HCTU)已表明相比于室温条件下基于碳二亚胺的活化的改进的偶联。
21世纪初期开始，在SPPS时广泛应用加热，作为改进氨基酸偶联的方法。在肽合成中加热可通过微波照射或其他已知的常规加热方法实现，且已与标准碳二亚胺和鎓盐偶联过程一起使用。然而，在偶联步骤时使用升高的温度表现出对肽合成的一些挑战。使用基于鎓盐的活化方法，半胱氨酸衍生物的差向异构化在升高的温度下基于碱性物质(通常为DIEA、NMM)的存在下实质上增加。此外，已观察到活化时精氨酸的δ-内酰胺形成增加，并导致某些序列中主要的精氨酸缺失。
最近，Collins等人表明通过没有任何碱性物质的90℃下的基于原位碳二亚胺的偶联，可进行非常快速有效的偶联。(J.Collins,K.Porter,S.Singh和G. Vanier,"High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis(HE-SPPS),"Org.Lett., vol.16,pp.940-943,2014)。这表明微波照射能加速缓慢的活化过程和随后的酰化步骤二者；例如在90℃下2分钟内。在Collins等人的偶联过程中碱性物质不存在有利避免了Carpino等人和Beyermann等人描述的受阻的活化，并提供了防止差向异构化的更安全的偶联环境。事实上Collins等人表明，相比于室温法，Fmoc-Cys(Trt)-OH可在90℃下偶联，没有差向异构化的增加。(L. Carpino,"The Diisopropylcarbodiimide/1-Hydroxy-7-azabenzotriazoleSystem: Segment Coupling and Stepwise Peptide Assembly,"Tetrahedron,vol.55,pp. 6813-6830,1999；M.Beyermann,"Effect of tertiary amine on the carbodiimide-mediated peptide synthesis,"Int.J.Peptide Protein Res.,vol.37, pp.252-256,1991)。
然而，在更高温度下驱使(相比于鎓盐)反应性较低的碳二亚胺活化所需的更酸性的环境，倾向于导致附着于高酸敏感性连接子(例如2-氯三苯甲基 (2-chlorotrityl))的肽的过早裂解。这可导致肽从树脂完全丢失(loss)，并显著地限制可与这类连接子应用的温度。高酸敏感性连接子的使用在某些肽合成中是非常重要的，因为它们允许肽片段缩合而使得可构建更大的肽序列。高酸连接子对于避免例如二酮哌嗪形成等副反应、在树脂装载时避免DMAP、和避免连接至酸连接子的c-端半胱氨酸残基的β-消去也是重要的。
因此，当在利用基于碳二亚胺或鎓盐的活化方法的肽合成中对偶联步骤施加升高的温度，肽化学家面对限制。
已表明，过量的碳二亚胺与氨基基团反应，并且对于肽键形成是不期望的，这导致避免使用过量的碳二亚胺。然而，在少数情况下，已探索了使用过量的碳二亚胺。在一份报告中，使用了相对于氨基酸过量的DIC/HOBt，通过观察N-酰基脲肽形成报道了过量碳二亚胺对氨基基团的不期望的封端 (capping)。(B.J.Egner,G.J.Langley和M.Bradley,J.Org.Chem.,vol.60,no.9, pp.2652-2653,1995)。
由于偶联后形成的酰基脲的难溶剂化特性，也已经认为使用过量的碳二亚胺是不期望的。对于脲在很多溶剂中不溶的DCC，这是一个特别的挑战，由此需要使用二氯甲烷(DCM)。该因素在很大程度上导致DCC由脲在DMF 中更可溶的DIC替代。
最近，在US 14/969,004中提出了用于SPPS的改进的偶联方法，其显示了在升高的温度下优于标准的基于碳二亚胺和鎓盐的方法的偶联改进。该方法是改进的碳二亚胺活化策略，其特征在于使用碱性物质。已发现，以相比于氨基酸小于1当量添加的强碱性物质、碳二亚胺和活化剂添加剂可在整个活化和偶联过程中存在，同时促进整体的偶联反应和避免潜在的副反应。通过使用有限量的碱性物质，仅观察到差向异构化稍微增加。
因此，需要在可引入升高温度的优点的同时避免这些各种缺点的肽合成方案。
发明内容
本发明公开了将氨基酸偶联成肽或拟肽(peptidomimetics)的改进的方法，其中活化和偶联在同一容器中、在相比于所述氨基酸大于1当量的量的碳二亚胺的存在下、在活化剂添加剂的存在下、和在大于30℃的温度下进行。
在一些实施方案中，所述碳二亚胺以相比于所述氨基酸大于1.5当量的量存在。
在一些实施方案中，所述方法限于小于10分钟的总偶联时间。
在一些实施方案中，所述碳二亚胺以相比于所述氨基酸大于1.5当量的量存在。
在一些实施方案中，所述方法限于小于10分钟的总偶联时间，和在大于 30℃的温度下进行。
在一些实施方案中，所述方法包括将存在的碳二亚胺的量限制在相比于所述氨基酸为约1.5和4当量之间。
在一些实施方案中，所述方法限于小于10分钟的总偶联时间，和在大于 70℃的温度下进行。
在一些实施方案中，所述方法是固相肽合成(SPPS)方法。
在一些实施方案中，至少一种加入的酸最初是Fmoc-保护的。
发明的前述和其它目标和优点，以及其完成方式，将基于以下详细描述而变得更清楚。
附图说明
图1表示的是基于碳二亚胺的活化。
图2表示的是基于鎓盐的活化。
具体实施方式
本发明提供了改进的在升高的温度下的碳二亚胺偶联方法，其避免使用强碱性物质，而同时提高偶联效率。该方法基于来自使用相对于氨基酸的增加量的碳二亚胺(大于1当量)的预料不到的偶联改进。已发现与碳二亚胺偶联使用碱性物质相比，该组合通过O-酰基异脲中间体更快速形成、避免预期的 N-酰基脲肽形成和/或末端氨基的封端、以及差向异构化的减少，独特地提高了偶联效率。该方法的效率通过如表1-3所示在不同条件下合成三个困难的肽序列来验证。
本发明还适用于合成拟肽；即设计以模拟肽的小的蛋白质样链。因为本文所述的偶联反应在肽和拟肽之间大部分是相同的，本发明将从肽方面进行描述。当然，技术人员对此将完全理解。
以相似的方式，技术人员将理解术语“氨基酸”在本文中以其最宽泛意义使用，意指含有胺和羧酸官能团两者、通常也有支链的有机化合物。技术人员熟知和熟悉天然地结合到多肽中的，并且称为蛋白原性(proteinogenic)或天然氨基酸的22种氨基酸。再者，因为基本偶联反应不限于这些特定分子，技术人员将认识到本发明的优点也适用于非蛋白原性的氨基酸(也称"非天然氨基酸")，其中40种已使用已建立的合成步骤加入蛋白质中。本文所述的结果对合成的肽中的氨基酸使用完善建立的单字母名称。
从Merrifield的先驱工作开始，固相肽化学的基础已完善建立。(R.B.Merrifield(1963)"Solid Phase Peptide Synthesis I,The Synthesis of aTetrapeptide,"J.Am.Chem.Soc.85(14),2149–2154)。经常使用的Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)保护基团的方法在技术人员容易获得的参考中充分描述；例如，Chan和White,"Fmocsolid phase peptide synthesis,a practical approach, Oxford University Press(2000).
实验中所称的LIBERTY BLUETM仪器可从北卡罗来纳州Matthews的 CEMCorporation获得。涉及在升高的温度下和使用微波照射的固相肽合成的主题的相关US专利包括但并不必要限于以下：7393920；7550560；7563865； 7939628；7902488；7582728；8153761；8058393；8426560；8846862；9211522。这些的内容在此全部引用以作参考。
表1用不同量的碳二亚胺的胸腺素合成
实验条件：
肽序列(胸腺素)＝SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-NH2
合成规模＝0.1mmol
树脂＝Rink Amide MBHA聚苯乙烯树脂(0.38mmol/g)
仪器＝Liberty Blue微波肽合成仪(CEM Corp.,Matthews,NC)
脱保护＝EtOH:NMP(1:9)中的10％(w/v)哌嗪，3mL
微波脱保护法＝90℃下1min
洗涤＝脱保护后(2mL,2mL,3mL–DMF)；偶联后＝无
偶联＝4mL溶液中，5-倍过量的AA/DIC/Oxyma
裂解＝在Accent MW裂解系统(CEM Corp.,Matthews,NC)中，5mL的 TFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)，38℃下30min
分析＝在有3100Single Quad MS的Waters UPLC ACQUITY H-Class上，在C18柱(1.7mm,2.1x 100mm)上用含0.1％TFA的乙腈/水作为溶剂系统对肽进行分析
表2用不同量的碳二亚胺的GRP合成
实验条件：
肽序列(GRP)＝VPLPAGGGTVLTKMYPRGNHWAVGHLM-NH2
合成规模＝0.1mmol
树脂＝Rink Amide MBHA聚苯乙烯树脂(0.35mmol/g)
仪器＝Liberty Blue微波肽合成仪(CEM Corp.,Matthews,NC)
脱保护＝EtOH:NMP(1:9)中的10％(w/v)哌嗪，3mL
微波脱保护法＝90℃下1min
洗涤＝脱保护后(2mL,2mL,3mL–DMF)；偶联后＝无
偶联＝4mL溶液中，5-倍过量的AA/DIC/Oxyma
裂解＝在Accent MW裂解系统(CEM Corp.,Matthews,NC)中，5mL的TFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)，38℃下30min
分析＝在有3100Single Quad MS的Waters UPLC ACQUITY H-Class上，在C18柱(1.7mm,2.1x 100mm)上用含0.1％TFA的乙腈/水作为溶剂系统对肽进行分析.
表3用不同量的碳二亚胺的泛素合成
实验条件：
肽序列(泛素)＝ MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG-NH2
合成规模＝0.1mmol
树脂＝Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(0.20mmol/g)
仪器＝Liberty Blue微波肽合成仪(CEM Corp.,Matthews,NC)
脱保护＝EtOH:NMP(1:9)中的10％(w/v)哌嗪+0.1M HOBt，4mL
微波脱保护法＝90℃下1min
洗涤＝脱保护后(4x 4mL DMF)；偶联后＝无
偶联＝4mL溶液中，5-倍过量的AA/DIC/Oxyma
裂解＝在Accent MW裂解系统(CEM Corp.,Matthews,NC)中，5mL的 TFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)，38℃下30min
分析＝在有3100Single Quad MS的Waters UPLC ACQUITY H-Class上，在C18柱(1.7mm,2.1x 100mm)上用含0.1％TFA的乙腈/水作为溶剂系统对肽进行分析
如表1所示，通过增加相对于氨基酸的碳二亚胺过量，观察到纯度显著增加(75％对63％)。如表2和3所示，从合成的其他肽观察到类似的改善。总之，这些结果显示，不仅偶联效率提高，而且避免了来自碳二亚胺的潜在封端。这推测来自有关封端的酰化的动力学增加，由此避免了该潜在的副反应。另外，偶联反应的升高的温度也有助于确保由碳二亚胺形成的脲在随后的排放(draining)和洗涤步骤中完全溶解并除去。因此，升高的温度提供保护以免受来自通过使用大于1当量的碳二亚胺而产生的更大量脲的潜在溶解度问题。
然后通过水解、随后的衍生、和通过气相色谱法(CAT GmbH)分析来研究各个氨基酸的差向异构化。我们用过量的碳二亚胺法观察到极低水平的差向异构化。这推测是因为偶联反应完成最快(活性物质的寿命短)，和没有外部碱性物质存在。因此，该方法比迄今为止所描述的用于在升高的温度下偶联的任何先前方法都具有优点。
表4用2当量的碳二亚胺的胸腺素合成的差向异构化分析
在偶联过程中使用碱性物质是不理想的，因为它们可导致不期望的副反应。Collins等人[7]表明，在没有任何碱性物质存在的基于碳二亚胺的偶联方法中半胱氨酸差向异构化如何在90℃下是最小的。Palasek等人[13]已显示，在存在DIEA和NMM以2当量存在的鎓盐活化方法中，显著的半胱氨酸差向异构化可如何发生。还已知Fmoc保护基缓慢地对DIEA不稳定。这可以在更高温度下增加，并导致难以分离的不期望的插入序列。
表5对于升高的温度下的肽偶联，碳二亚胺和鎓盐活化策略的比较
表6对于升高的温度下的肽偶联，碳二亚胺活化策略的比较
在说明书中已举出了本发明优选的实施方案，并且虽然已使用了具体的术语，它们仅以一般性的和描述性的意思使用，并且没有限制的目的，本发明的范围在权利要求中定义。

Claims (19)

1.一种将氨基酸偶联成肽或拟肽的方法，其改进包括：
活化和偶联在同一容器中进行；
以相比于所述氨基酸大于1当量的量掺入碳二亚胺；
在活化剂添加剂的存在下进行；和
在大于30℃的温度下进行。
2.根据权利要求1所述的固相肽合成(SPPS)方法。
3.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种加入的酸最初是Fmoc-保护的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳二亚胺以相比于所述氨基酸为1.5和4当量之间的量存在。
5.根据权利要求1所述的方法，其在大于70℃的温度下进行。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其限于小于10分钟的总偶联时间。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其限于小于15分钟的总偶联时间。
8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述活化剂添加剂以相比于所述氨基酸为1和1.5当量之间的量存在。
9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中：
所述活化剂添加剂以相比于所述氨基酸为1和1.5当量之间的量存在；和
偶联步骤限于小于10分钟。
10.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中：
所述活化剂添加剂以相比于所述氨基酸为1和1.5当量之间的量存在；和
偶联步骤限于小于15分钟。
11.一种用于将氨基酸偶联成肽或拟肽的组合物，所述组合物包括：
氨基酸；
有机溶剂；
相比于所述氨基酸大于1当量的量的碳二亚胺；和
活化剂添加剂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物进一步包括1和1.5当量之间的所述活化剂添加剂。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物进一步包括1.5和4当量之间的所述碳二亚胺。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述氨基酸是Fmoc-保护的氨基酸。
15.根据权利要求11所述的组合物，其进一步包括所述氨基酸和所述碳二亚胺的O-酰基异脲中间体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包括DIC或Oxyma活化剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其进一步包括所述氨基酸和所述碳二亚胺的所述O-酰基异脲的酯。
18.根据权利要求11所述的组合物，其包括连接至固相树脂的至少一个氨基酸。
19.根据权利要求11所述的组合物，其进一步包括连接至固相肽合成树脂的肽链。
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