DE1937656C3

DE1937656C3 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE1937656C3
Application number: DE19691937656
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr. 6000 Frankfurt Geiger; Wolfgang Dr. 6239 Langenhain Koenig
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1969-07-24
Filing date: 1969-07-24
Publication date: 1974-10-17
Also published as: DE1937656A1; DE1937656B2

Description

Halogen, Trifluormethyl-, Nitro-, Sulfonsäureamid-, Carboxamid-, Cyano-, niedere Alkyl- und/ oder Methoxy- bzw. Äthoxygruppen sein kann und /i für die Zahlen 1 bis 4 steht, einsetzt.

Gegenstand des Hauptpatentes 1917 690 ist ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Umsetzung einer geschützten Aminosäure oder eines geschützten Peptids, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, mit einer geschützten Aminosäure- bzw. einem Peptidester oder deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel in Gegenwart eines Carbodiimids oder durch Umsetzung einer geschützten Aminosäure oder eines geschützten Peptids, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in Gegenwart eines Carbodiimids zu einem aktivierten Derivat und anschließender Umsetzung mit einer gegebenenfalls geschützten Aminosäure oder Peptid bzw. deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel, wobei nach beendeter Reaktion und üblicher Reinigung gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise abgespaltet werden, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man die Um- »etzung mit einem Zusatz von 1 bis 2 Äquivalenten I -Hydroxy-benzotriazol durchführt.

In weiterer Ausgestaltung dieses Verfahrens wurde Dun gefunden, daß man statt I-Hydroxybenzotriazol auch am Benzolkern substituierte Derivate des l-Hydroxybenzotriazols der allgemeinen Formel I verwenden kann, wobei R Halogen,

Trifluormethyl-, Nitro-, Sulfonsäureamid-, Carboxamid-, Cyano-, niedere Alkyl- und/oder Methoxy- bzw. Äthoxygruppen sein kann und π für die Zahlen 1 bis 4 steht. Wenn π > J ist, kann R auch für verschiedene Substitueiiten stehen. Beispielsweise können folgende 1-Hydroxybenzotriazole verwendet werden: 6-Chlorol-hydroxy-5-isopropyl-benzotriazoI oder 4-Chlorol-hydroxy-7-methyl-6-nitro-benzotriazol sowie die in den Beispielen erwähnten Verbindungen. Die im

ίο Hauptpatent beschriebenen Verfahrensbedingungen gelten in gleicher Weise für die Umsetzung mit den entsprechenden kernsubstituierten I-Hydroxybenzotriazolen. Wenn Peptide durch Reaktion der Carboxylkomponente mit der Aminokomponente mittels eines Carbodiimids unter Zusatz eines kernsubstituierten 1-Hydroxybenzotriazols der allgemeinen Formel 1 synthetisiert werden (»Eintopf-Methode«), wird zweckmäßig ein Zusatz von 2 Äquivalenten des entsprechenden kernsubstituierten 1-Hydroxybenzotriazols der allgemeinen Formel 1 angewendet.

Wie aus Tabelle 2 zu entnehmen, liegt bei der Peptidsynlhese mit DCC unter Zusatz der kernsubstituierten 1-Hydroxybenzotriazole die Racemisierung meist unter I %. Aus Tabelle 1 geht aus Schmelzpunkt und Ausbeute hervor, daß die kernsubstituierten I -Hydroxybenzotriazole dem bekannten Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (Versuche 23 bis 25) bei der Peptidsynthese mit DCC deutlich überlegen sind.

Zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten und in der Literatur noch nicht beschriebenen kernsubstituierten 1-Hydroxybenzotriazole wurden in an sich bekannter Weise o-Chlor-nitrobenzole der allgemeinen Formel 2, wobei R und π die obige Bedeutung hat, mit 3 Äquivalenten Hydrazinhydrat oder mit 1 Äquivalent Hydrazinhydrat + 2 Äquivalenten Triäthylamin in Alkohol erhitzt und das entstehende Hydrazin- bzw. Triäthylaminsalz des kernsubstituierten 1-Hydroxybenzotriazols in Wasser gelöst und angesäuert, wobei die kernsubstituierten 1-Hydroxybenzotriazole ausfallen.

45

NC-

50

Die Verfahrensprodukte können als Thcrapeutika Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer therapeutisch wertvoller Peptide, wie z. B. Oxytocin, Vasopressin, Glucagon, ACTH, Secrctin, Thyreocalcitonin oder Insulin eingesetzt werden.

In der Beschreibung und in den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Außerdem werden folgende Abkürzungen verwendet:

Z = Carbobenzoxy-.

Boc = tert.-Butyloxycarbonyl-.

(I) 65 OMe = Methylester.

OBu' = tert.-Butylester.

Mbh = 4,4'-Dimethoxybcnzhydryl-

DCC = Dicyclohexylcarbodiimid.

I 937 656

Beispiele Synthese von Z-VaI-VaI-OMe

A. »Eintopfmethode« (allgemeine Vorschrift): 2,5 g Z-VaI-OH (10 mMol), 1.7 g H-VaI-OMe ■ HCI (10 mMol), 1,28 ml N-Äthylmorpholin (10 mMoli und bis 20 mMol eines substituierten l-Hydroxybenzotriazols der Formel I werden in 20 nil abs. Tetrahydrofuran unter Rühren auf OC abgekühlt. Dazu gibt man eine auf 0°C abgekühlte Lösung von 2.2 g DCC in absolutem Tetrahydrofuran und läßt 1 Stunde bei 0"C und I Stunde bei Zimmertemperatur rühren. Der Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat ein geengt und der Rückstand in Essigester gelöst. Die Lösung wird mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung. 2n-Salzsäure, gesättigter Natriumbicarbonat lösung und Wasser cewaschen. mit Natriumsulfat getrocknet.

eingeengt und der Rückstand mit Petroläther verrieben. Die Ergebnisse an Dipeptidester bei Verwendung der verschiedenen l-Hydroxybenzotriazole als Zusatz sind in Tabelle I zusammengefaßt

B. Voraktivierung der Carboxylkomponente (allgemeine Vorschrift): 2,5 g Z-VaI-OH (10 mMol) und bis 20 mMol eines substituierten l-Hydroxybenzotriazolsder Formel 1 werden in 10 ml abs. Tetrahydrofuran gegeben und bei 0"C mit einer kalten Lösung

ίο von 2.2 g DCC in abs. Tetrahydrofuran versetzt. Man Hißt 1 Stunde bei 0"C und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, fügt 1,7 g H-VaI-OMe · HCl (iO mMol) und 1,28 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) zu und läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren. Auf-

arbeitung wie bei A. Die Ergebnisse an Dipeptidester bei Verwendung der verschiedenen 1-Hydroxybenzotriazole als Zusatz sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Ta helle 1

Herstelluni! von Z-VaI-VaI-OMe

Nr

M el hi nie

5 6 7 8

9 10 11 12

13 14 15 16 17 18
19
20

21

22

23

24
25

A B A B Λ B A B A B A A A A A A

A
A
B

2 Äquiv. 2 Äquiv. 2 Äquiv.

2 Äquiv.

1 Äquiv.

2 Äquiv.

1 Äquiv.

2 Aquiv.

1 Äquiv.

2 Äquiv

1 Äquiv.

2 Äquiv.

1 Äquiv.

2 Äquiv. 2 Äquiv. 2 Äquiv. 2 Äquiv. 2 Äquiv. 2 Äquiv.

2 Äquiv. 2 Äquiv.

ohne Zusatz 2 Äquiv. 2 Äquiv.

l-Hvdroxy-6-benzotriazol-sulfon-

süurediäthylamid
l-Hydroxy-o-benzotria/olsulfonsaure-

methylamid
I-Hydroxy-ft-benzotriazol-sulfon-

säureamid
l-Hydroxy-6-trifiuormethyl-benzo-

triazol

l-Hydroxy-6-mcthoxy-benzotriazol

desgl.
l-Hydroxy-5-metlioxv-benzotriazol

desgl.
l-Hydroxy-5.6-dimethyl-benzotria/.ol

desgl.
I-Hydroxy-4-mcth\l-benzotriazol

desgl.
l-Hydroxy-5-methyl-bcnzoinazol

desgl.

l-Hydroxy-6-nitro-benzotriazol
6-Chloro-1 -hydroxy-benzotriazo]
5-Chloro-l-hydroxy-benzotriazol
5,6-Dichloro-1 -hydroxy-benzotriazol
6-Bromo-l-hydroxy-benzotriazol
4-Chloro-1 -hydroxy-7-methyl-

6-nitro-benzotriazol 6-Chloro-1 -hydroxy-5-methyl-benzo-

triazol

I-Hydroxy-ö-methyl-S-benzotriazolcarbonitril

N-Hydroxysuccinimid
desgl.

Ausbeule

1%)

90.5 96,1 9(\5

90,5 65,9 79,0 80,0 83,5 98.8 93,3 82,4 68,6 79,6 71,5 90,6 96,0 90,6 93.3 90,5

80,0 91,0

66,0 70,0 68,7

72,8

Schmp. ((I C)

97 KX) 99

100

94

98 103 107

98

102

103 102

104 104

93 9:5

93 9}!

97 KW

93

100 KI2

96-99

95 -99

103-106 99,107 76—8;» 74—85

2, GasGhroroatographiscber Raeerrnsjerungstest

nach F. W e y g a n d et al (Vorschrift wie

im Hauptpatent)

Tabelle 2

RacemisJerungsuntersushungeri bei der DCC-Metbode mit verschiedenen Zusätzen

(Lösungsmittel: Dimethylformamid)

	Zusatz	D-Phe-L-Val
Aquiv.		in
		Boc-Leu-
	1 -Hydroxy-6-nitro-benzo-	Phe-Val-OBu¹
2	triazol
	desgl.	< 1.0
I	5-Chloro-1 -hydroxy-ben? o-	<l,0
2	triazol
	desgl.	1.7
I	6-Chloro-1 -hydroxy-benzQ-	<1.0
2	triazol
	desgl.	1.1
1	5,6-Dichloro-1 -hydroxy-	<1.0
2	benzotriazol*
	desgl.	1.3
I	6-Bromo-l-hydroxy-benzo-	<I.O
2	triazol
	desgl.	< 1.0
I	1 -Hydroxy-6-trifluormethy 1-	<1.0
2	benzotriazol
	1 -Hydroxy-6-benzotriazol-	< 1.0
2	sulfonamid
	desgl.	< 1.0
I	1 -Hydroxy-6-benzotriazol-	<1.0
I	sulfonsäurediäthylamid
	desgl.	< 1.5
2	1 -Hydroxy-6-berizotriazol-	<1.0
;	sulfonsäuremethylamid
	desgl.	< 1.0
2	1 -Hydroxy-6-beriZOtriazol-	< 1.0
2	carboxamid
	desgl.	< 1.0
I	I -Hydroxy-6-methy 1-benzo-	<1.0
2	triazol
	desgl.	< 1.0
I	1 -Hydroxy-5-methyl-benzo-	<1.0
2	triazol
	desgl.	< 1.0
I	i -Hydroxy-4-methy 1-benzo-	<l,0
2	triazol
	desgl.	< 1,0
I	I -Hydroxy-5,6-d imethyl-	<l,0
1	benzotriazol
	1 -Hydroxy-S.o-dimethyl-	< 1,0
2	ben?,otriazol
	I -Hydroxy-5-fnethoxy-	1.3
2	beriotriazol
	desgl.	< 1.0
1	< 1,0

	Zusatz	P-Phe-L-Val
Aquiv.		in
		Βος-Un-
	I -Hydroxy-6-methoxy-	Phe-Va!-OBu^l
2	benzotriazol
	desgl.	<l,0
1	1 -Hydroxy-6-methyl-	1,65
1	5-benzotriazo]-carbo-
	nitril
	desgl.	<1
2	4-Chloro-l-hydroxy-	<2
1	7-methyl-6-nitro-benzo-
	triazol
	desgl.	<I
2	1 -Hydroxy-4-methyl-	<\|
1	6-nitro-benzmriazoI
	desgl.	< ι
2	6-Chloro-1 -hydroxy-	<2
1	5-mcthyl-benzotriazol
	desgl.	< 1
2	6-Chloro-1-hydroxy-	< ι
1	5-isopropyl-benzotriazol
	desgl.	< !
2	4,5,6,7-Tetrachloro-1 -hy-	1.4
2	droxy-benzotriazol
	1.4

26. Z- Phe-( 1 -hydroxy-5-methyl-benzotriazoI (-ester

Zu einer auf 0⁰C abgekühlten Lösung von 15 g Z-Phenylalanin (5OmMoI) und 8,?5 g 1-Hydroxy-5-methylbenzotriazol (55 mMol) in 150 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man 11 g DCC, läßt 1 Stunde bei 0⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren.

saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein.

Der Rückstand wird aus Isopropanol umkristallisiert.

Ausb. 10,65 g (50% der Theorie). Schmp. 153 bis

155° C.

C₂₄H₂₂N₄O, (430,5):

Berechnet ... C 66,96, H 5,15, N 13.02;
gefunden ... C 67,2, H 5,0, N 13,1.

27. Z-A.sn(Mbh)-(l-hydroxy-6-trifluormethylbenzotriazoi;-ester

Zu einer auf 0⁰C abgekühlten Lösung von 4,6 g Z-Asn(Mbh)-OH (10 mMol) und 2.2 g IHydroxy-6-trifluormetriyl-benzotriazol (11 mMol) in 30 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man 2,2 g DCC, läßt 1 Stunde bei 0°C und I Stunde bei Raumtemperatur rühren, verdünnt mit etwas Dimethylformamid, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird mit Isopropanol aufgekocht, abgesaugt und mit Äther gewaschen.
Ausb. 2,75 g (41 % der Theorie), Schmp. 170 bis 173° C.

C₃₄H₃₀N₅F₃O₇ (677,65)

Berechnet ... C 60,27, H 4,46, N 10,34;
gefunden ... C 60,6, H 4,6, N 10,4.

Herstellung neuer kerhsubstituiertcr I-Hydroxybenzotriazolcdie als Zusatzstoffe verwendet werden

Allgemeine Vt>ischriften J

a) 0.1 Mol einer aromatischen o-Chlor-nitro-Verbindung wird in 50 ml Äthanol mit 15 g IOO%igem Hydrazinhydrat (0,3 Mol) 5 Stunden im Rückfluß gekocht.,Man kühlt ab und saugt den Niederschlag ab. Fällt nichts aus. wird die Mutterlauge eingeengt. Der Niederschlag bzw. der Rückstand wird in Wasser gelöst, eventuell ausgeäthert und die wäßrige Phase mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und der Nieder-

schlag abgesaugt. Die Ergebnisse sind in Ta belle 3 zusammengefaßt.

b) 0,1 Mol einer aromatischen o-Chlor-nitro-Ver bindung wird in 50 ml Alkohol mit 15 g lOOVoigem Hydrazinhydrat (0,3 Mol) 10 Stunder im Autoklav auf 110° C erhitzt. Aufarbeitung wie bei a). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

c) 0,1 Mol einer aromatischen o-Chlornitro-Ver· bindung wird in 50 ml Äthanol mit 27,2 ml Triethylamin (0,2 Mol) und 5 g 100%igem Hydrazinhydrat (0,1 Mol) 5 Stunden im Rückfluß gekocht. Anschließend wird eingeengt und der Rückstand wie bei a) aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle

Neue kernsubstituierte I-Hydroxybenzotriazole

Verbindung (umkristall. aus . ..)

l-Hydroxy-6-trifluormethyl-benzotriazol (Wasser)

l-Hydroxy-6-benzotriazol-sulfonsäuremelhylamid (Wasser)

l-Hydroxy-6-benzotriazol-sulfonsäurediäthylamid (Äthanol/Wasser)

l-Hydroxy-ö-benzotriazol-carboxamid (50%iger Alkohol)

I -Hydroxy-5-methoxy-benzotriazol (Äthanol)

1 -Hydroxy-fr-methoxybenzotriazol (Wasser)

I -Hydroxy-5-methyIbenzolriazol (Wasser) '

l-Hydroxy-4-methylbenzotriazoI (Äthanol)

l-Hydroxy-5,6-dimethyl-benzotriazol (Äthanol)

1 -Hydroxy-o-methyl-S-benzotriazolcarbonitril (Äthanol/Wasser)

a (90%)

a (79%)

(67%)

a (39%)

b (68%)

b (6%)

b (77%)

b (71%)

b (60%)

b (17%_f 148—149

214

159—160

241

215

172—173

188—189

151,5—

193—194

216—217

Analysen

C₇H₄F₃N₃O (203,1):

Berechnet ... C 41,39, H 1,98, N 20,69;

gefunden ... C 41,5, H 2,2, N 21,0.

C₇H₈N₄O₃S (228,2)

Berechnet:

C 36,85, H 3,53, N 24,55, S 14,05;

gefunden:

C 36,5, H 3,8, N 24,8, S 13,8.

C₁₀HmN₄O₃S (270,3)

Berechnet:

C 44,45, H 5,22, N 20,73, S 11,84;

gefunden:

C 44,7, H 5,1, N 20,8, S 11,7.

C₇H₆N₄O₂, IH₂O (196,1)

Berechnet:

C 42,80, H 4,11, N 28,58;

gefunden:

C 42,7, H 4,0, N 27,4/29,8.

C₇H₇N₃O₂ (165,1)

Berechnet... C 50,90, H 4,27, N 25,45;

gefunden ... C 50,9, H 4,2, N 25,7.

₇₇₃i (174,1)

Berechnet... C 4830, H 5,21, N 24,13;

gefunden ... C48,7, H 5,1, N25,3.

C₇H₇N₃O (149,1)

Berechnet... C 56,37, H 4,73, N 28,18;

gefunden ... C56,4, H4,7, N28,3-

C₇H₇N₃O (149,1)

Berechnet... C 56,37, H 4,73, N 28,18;

gefunden ... C56,4, H4,8, N28,0.

C₈H₉N₃O (163,2)

Berechnet... C 58,89, H 5,56, N 25,75;

gefunden ... C58,8, H 5,5, N25,4.

C₈H₆N₄O(H^

Berechnet... C 55,17, H 3,47, N 32,17;

gefunden ... C54,4, H3,6, N32J.

Vei bindung fumkristall. aus ...)

fi-Chloro-l-hydroxy-S-mclhylbenzolriazol (Äthanol/Wasser)

6-Chloro-1-hydroxy-5-isopropyl-benzotriazol (Äthanol/Wasser)

Fortsetzung

Methode

(37%)

(25%)

Schmp.

10

215

173—174

Analysen

C₇H₆CIN₁O (183,6)

Berechnet ... C 45,78, H 3,30, N 22,89:

gefunden ... C 45,7, H 3,3, N 23.0.

C₉H₁₀CIM₃O (211,7)

Berechnet ... C 51,05, H 4,76, N 19.87;

gefunden . . C 50,8, H 4,7, N 20,2.

Claims

1 937 666

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Peptiden nach Patent 1917 690,dadurchgekennzeichn e t, daß man an St?He des im Hauptpatent verwendeten l-Hydroxybenzotriazols ein kernsub- »tituiertes t-Hydroxybenzotriazol der allgemeinen Formel I, wobei R