TW201811814A - 過量碳二亞胺在高溫下用於肽合成的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示將胺基酸偶合成肽或擬肽之經改良方法，其中活化及偶合係在同一容器中、在與該胺基酸相比大於1當量之量之碳二亞胺存在下、在活化劑添加劑存在下及在大於30℃之溫度下實施。

Description

過量碳二亞胺在高溫下用於肽合成的用途
本發明係關於肽合成，且具體而言係關於固相肽合成(SPPS)。 在本說明書通篇及申請專利範圍中使用多個首字母縮略詞。其通常為熟習此項技術者所熟悉。如本文所用，其具有以下含義： EtOH：乙醇 HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽. HATU：1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓鹽3-氧化物六氟磷酸鹽. HCTU：1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽. PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽. PyAOP：7-氮雜苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽. DIEA：二異丙基乙胺. NMM：N-甲基嗎啉. Cys(Trt)：半胱胺酸(三苯甲基). DMAP：4-二甲基胺基吡啶. NMP：N-甲基-2-吡咯啶酮. TIS：三異丙基矽烷. DODt：3,6-二氧雜-1,8-辛烷-二硫醇. MBHA：(4-甲基二苯甲基胺). 可能地，肽合成之最常用及研究之活化方法係基於使用碳二亞胺。其於肽合成中之用途追溯到1955年，其中使用N,N’-二環己基碳二亞胺(DCC)來促進醯胺鍵形成。碳二亞胺含有兩個微鹼性氮原子，其將與胺基酸衍生物之羧酸反應以形成高反應性O-醯基異脲化合物，如圖1中所顯示。所形成O-醯基異脲隨後可立即與胺反應以形成肽鍵或轉化成其他反應性物質。 O-醯基異脲之高反應性亦促進可或可不引起肽鍵形成之若干其他不期望路徑，亦如圖1中所顯示。轉化成非反應性N-醯基脲防止偶合，同時可經由噁唑啉酮形成發生活化手性胺基酸之差向異構。高反應性對稱酸酐可藉由使用與碳二亞胺相比過量之胺基酸形成。然而，此方法不期望地消耗另一當量胺基酸。 藉由在碳二亞胺活化期間納入1-羥基苯并三唑(HOBt)作為添加劑可顯著改良碳二亞胺活化方法。HOBt使O-醯基異脲快速轉化成OBt酯，其具有高反應性且避免不期望的N-醯基異脲及噁唑啉酮形成。後期展示，1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)因7位氮之鄰基效應而成為HOBt之有利替代[161]。可使用許多其他添加劑來替代HOBt及HOAt (例如6-氯-1-羥基苯并三唑(6-Cl-HOBt)、2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸乙酯(Oxyma, OxymaPure, ECHA)及1-羥基-2,5-吡咯啶二酮(NHS))以列示若干常用實例。 通常，與胺基酸及碳二亞胺相比，添加1當量添加劑。然而，最新研究表明，將添加劑減少至小於1當量可係有用的。(S. Nozaki, 「Delay of coupling caused by excess additives」,J. Pept. Sci., 第12卷，第147-153頁，2006。)。作者發現，醯化反應可因在胺與添加劑之間形成鹽而受阻。然而作者亦發現，將添加劑減少至小於1當量會減緩活化速率且稍微增加區段偶合之差向異構。圖1 基於碳二亞胺之活化. N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)已極大地替代DCC作為較佳碳二亞胺用於肽活化。DCC不期望地產生僅溶於TFA中之脲，此使其用途不同於Fmoc化學法。另外，DCC係可難以處理且已報導引起過敏反應之蠟質固體。或者，DIC因其產生之脲在有機溶劑中改良之溶解度、所報導過敏反應之較低發生率及與DCC同樣低之成本而有利。現今仍使用之最流行偶合方法之一係基於DIC/HOBt，此乃因其低成本及副反應，同時通常提供有效偶合。 基於苯并三唑之添加劑(例如HOBt、HOAt及6-Cl-HOBt)之最新分析已將其重新分類為第1類爆炸物。苯并三唑添加劑之此不期望特徵已增加研發苯并三唑添加劑之適宜替代物之興趣。一種該替代物係首次報導於1973年之Oxyma (2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸乙酯)。(參見M. Itoh, 「Peptides. IV. Racemization Suppression by the Use of Ethyl-2-Hydroximino-2-cyanoacetate and Its Amide」,Bull. Chem. Soc. Jpn., 第46卷，第2219-2221頁，1973。)。最近，藉由差示掃描量熱(DSC)以及加速量熱(ARC)測試Oxyma之爆炸性質，且具有與HOBt相比有利的結果。(R. Subirὀs-Funosas, 「Oxyma: An Efficient Additive for Peptide Synthesis to Replace the Benzotriazole-Based HOBt and HOAt with a Lower Risk of Explosion」,Chemistry, 第15卷，第9394-9403頁，2009。)。 然而，在室溫合成條件下使用基於碳二亞胺之活化方法可因相對較緩慢之活化過程及更具酸性之偶合環境二者而引起大量缺失。此已引起更快速之基於鎓鹽之活化方法之最新發展。然而，基於鎓鹽之活化需要使用鹼，其首先使羧酸去質子化，由此產生與鎓鹽活化劑反應之羧酸根陰離子。已展示利用許多鎓鹽(尤其HBTU、HATU、PyBOP、PyAOP、HCTU)與在室溫條件下基於碳二亞胺之活化相比經改良之偶合。圖2 基於鎓鹽之活化 在2000年代早期開始，在SPPS期間利用加熱已廣泛地應用為改良胺基酸偶合之方法。肽合成中之加熱可藉由微波輻照或其他已知習用加熱方法來達成，且與標準碳二亞胺及鎓鹽偶合過程二者一起使用。然而，偶合步驟期間之高溫呈現肽合成之若干挑戰。使用基於鎓鹽之活化方法，在高溫下基於鹼(通常DIEA、NMM)之存在半胱胺酸衍生物之差向異構實質上增加。另外，已觀察到在活化期間精胺酸之δ-內醯胺形成增加且在某些序列中產生大量精胺酸缺失。 最近，Collins等人顯示，可藉由在90℃下在任一鹼不存在下基於碳二亞胺之原位偶合實施極快速且有效之偶合。(J. Collins、K. Porter、S. Singh及G. Vanier, 「High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS)」,Org. Lett., 第16卷，第940-943頁，2014。) 此展示微波輻照能夠加速緩慢活化過程及後續醯化步驟二者；例如，在2分鐘內在90℃下。在Collins等人偶合過程期間不存在鹼有利地避免Carpino等人及Beyermann等人所述之受阻活化，且提供較安全之來自差向異構之偶合環境。實際上，Collins等人顯示，Fmoc-Cys(Trt)-OH可在90℃下偶合且與室溫方法相比不增加差向異構。(L. Carpino, 「The Diisopropylcarbodiimide/1-Hydroxy-7-azabenzotriazole System: Segment Coupling and Stepwise Peptide Assembly」,Tetrahedron, 第55卷，第6813-6830頁，1999；M. Beyermann, 「Effect of tertiary amine on the carbodiimide-mediated peptide synthesis」,Int. J. Peptide Protein Res., 第37卷，第252-256頁，1991。) 然而，驅動較少反應性碳二亞胺活化(與鎓鹽相比)所需之較高溫度下之更具酸性環境將導致附接至高酸敏感性連接體(例如2-氯三苯甲基)之肽過早裂解。此可導致來自樹脂之肽完全損失且顯著限制可利用此類連接體施加之溫度。使用高酸敏感性連接體在某些肽合成中至關重要之原因在於，其容許肽片段縮合，從而容許構築較大肽序列。高酸連接體對於避免諸如二酮六氫吡嗪形成等副反應、避免樹脂裝載期間之DMAP及避免連接至酸連接體之c末端半胱胺酸殘基之β-消除亦至關重要。 因此，肽化學家在利用基於碳二亞胺或鎓鹽之活化方法將高溫施加至肽合成中之偶合步驟時面臨限制。 已表明，過量碳二亞胺與胺基反應且不期望用於肽鍵形成，此導致避免使用過量碳二亞胺。然而，在少數情形下，已探究過量碳二亞胺之用途。在一報導中，使用相對於胺基酸過量之DIC/HOBt，其具有經由觀察N-醯基脲肽形成報導之過量碳二亞胺之不期望胺基封端。(B. J. Egner、G. J. Langley及M. Bradley,J. Org. Chem., 第60卷，第9期，第2652-2653頁，1995。)。 使用過量碳二亞胺亦因所形成醯基脲在偶合後難以溶劑化之性質而視為不合意。此對於脲不溶於許多溶劑、由此需要使用二氯甲烷(DCM)之DCC而言尤其具有挑戰。此因素很大程度上使得其經脲更溶於DMF之DIC替代。 最近，SPPS之經改良之偶合方法呈現於US 14/969,004中，其展示相對於在高溫下基於碳二亞胺及鎓鹽之標準方法二者之偶合改良。此方法係改進的碳二亞胺活化策略，其特徵在於使用鹼。發現，添加與胺基酸、碳二亞胺及活化劑添加劑相比小於1當量之強鹼可存在於整個活化及偶合過程期間，同時增強總體偶合反應且避免潛在副反應。經由使用有限量之鹼觀察到差向異構僅稍微增加。 因此，業內需要可納入高溫之優點、同時避免該等各個缺點之肽合成方案。
本發明揭示將胺基酸偶合成肽或擬肽之經改良方法，其中活化及偶合係在同一容器中、在與胺基酸相比大於1當量之量之碳二亞胺存在下、在活化劑添加劑存在下及在大於30℃之溫度下實施。 在一些實施例中，碳二亞胺係以與胺基酸相比大於1.5當量之量存在。 在一些實施例中，該方法限於短於10分鐘之總偶合時間。 在一些實施例中，碳二亞胺係以與胺基酸相比大於1.5當量之量存在。 在一些實施例中，該方法限於短於10分鐘之總偶合時間且係在大於30℃之溫度下實施。 在一些實施例中，該方法包括將所存在碳二亞胺之量限於與胺基酸相比約1.5當量與4當量之間。 在一些實施例中，該方法限於短於10分鐘之總偶合時間且係在大於70℃之溫度下實施。 在一些實施例中，該方法係固相肽合成(SPPS)方法。 在一些實施例中，初始對所添加酸中之至少一者進行Fmoc保護。 基於以下詳細描述，本發明之前述及其他目標及優點以及實現其之方式將變得更清楚。
本發明呈現在高溫下經改良之碳二亞胺偶合方法，其避免使用強鹼，同時增加偶合效率。此方法係基於來自使用相對於胺基酸增加量之碳二亞胺(大於1當量)之意外的偶合改良。發現，與使用鹼及碳二亞胺偶合相比，此組合經由較快速形成鄰-醯基異脲中間體、避免預期N-醯基脲肽形成及/或末端胺基封端以及減少差向異構獨特地改良偶合效率。藉由在多個條件下合成三個困難肽序列來驗證此方法之效率，如表1-3中所顯示。 本發明亦適用於合成擬肽；即經設計以模擬肽之小蛋白樣鏈。由於本文所述之偶合反應對於肽與擬肽而言大致相同，故本發明將根據肽來闡述。當然，熟習此項技術者將對此完全理解。 以類似方式，熟習此項技術者將理解，術語「胺基酸」在本文中以其最廣泛意義使用且係指含有胺及羧酸官能基二者通常以及側鏈之有機化合物。熟習此項技術者熟知且熟悉22種胺基酸，其天然納入多肽中且稱為蛋白或天然胺基酸。另外，由於基本偶合反應並不限於該等特定分子，故熟習此項技術者將意識到，本發明之優點亦適用於非蛋白胺基酸(又名「非天然胺基酸」)，其中40種已利用已確立的合成步驟添加至蛋白質中。本文所述之結果將已充分確立的單字母名稱用於合成肽之胺基酸中。 自Merrifield之先前工作(R. B. Merrifield (1963) 「Solid Phase Peptide Synthesis I, The Synthesis of a Tetrapeptide」, J. Am. Chem. Soc. 85 (14), 2149-2154)開始，業內已充分確立固相肽化學法之基礎。常用Fmoc (9-茀基甲基氧基羰基)保護基團方法充分闡述於熟習此項技術者可容易獲得之參考文獻中；例如，Chan及White, 「Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach」, Oxford University Press (2000)。 實驗中所提及之LIBERTY BLUE™儀器可自Matthews North Carolina之CEM Corporation購得。解決在高溫下及使用微波輻照之固相肽合成之標的之相關美國專利包括(但不必限於)以下各項：7393920；7550560；7563865；7939628；7902488；7582728；8153761；8058393；8426560；8846862；9211522。該等專利之內容全部以引用方式併入本文中。 表1 利用不同量之碳二亞胺合成胸腺素 實驗條件： 肽序列(胸腺素) = SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-NH2 合成規模 = 0.1 mmol 樹脂 = Rink醯胺MBHA聚苯乙烯樹脂(0.38 mmol/g) 儀器 = Liberty藍微波肽合成儀(CEM Corp., Matthews, NC) 去保護 = 3 mL之10% (w/v)六氫吡嗪於EtOH:NMP (1:9)中 微波去保護方法 = 在90℃下1 min 洗滌 = 去保護後(2 mL、2 mL、3 mL - DMF)；偶合後 = 無 偶合 = 5倍過量之AA/DIC/Oxyma於4 mL溶液中 裂解 = 5 mL之TFA/TIS/H2 O/DODt (92.5:2.5:2.5:2.5)，在38℃下在Accent MW裂解系統(CEM Corp., Matthews, NC)中保持30 min 分析 = 在具有3100單一Quad MS之Waters UPLC ACQUITY H類上使用乙腈/含有0.1% TFA之水作為溶劑系統在C18管柱(1.7 mm, 2.1 × 100 mm)上分析肽 表2 利用不同量之碳二亞胺合成GRP 實驗條件： 肽序列(GRP) =VPLPAGGGTVLTKMYPRGNHWAVGHLM-NH2 合成規模= 0.1 mmol 樹脂 = Rink醯胺MBHA聚苯乙烯樹脂(0.35 mmol/g) 儀器 = Liberty藍微波肽合成儀(CEM Corp., Matthews, NC) 去保護 = 3 mL之10% (w/v)六氫吡嗪於EtOH:NMP (1:9)中 微波去保護方法 = 在90℃下1 min 洗滌 = 去保護後(2 mL、2 mL、3 mL - DMF)；偶合後 = 無 偶合 = 5倍過量之AA/DIC/Oxyma於4 mL溶液中 裂解 = 5 mL之TFA/TIS/H2 O/DODt (92.5:2.5:2.5:2.5)，在38℃下在Accent MW裂解系統(CEM Corp., Matthews, NC)中保持30 min 分析 = 在具有3100單一Quad MS之Waters UPLC ACQUITY H類上使用乙腈/含有0.1% TFA之水作為溶劑系統在C18管柱(1.7 mm, 2.1 × 100 mm)上分析肽。 表3 利用不同量之碳二亞胺合成泛素 實驗條件： 肽序列(泛素) = MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG-NH2 合成規模= 0.1 mmol 樹脂 = Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂(0.20 mmol/g) 儀器 = Liberty藍微波肽合成儀(CEM Corp., Matthews, NC) 去保護 = 4 mL之10% (w/v)六氫吡嗪於EtOH:NMP (1:9)中 + 0.1 M HOBt 微波去保護方法 = 在90℃下1 min 洗滌 = 去保護後(4 × 4 mL DMF)；偶合後 = 無 偶合 = 5倍過量之AA/DIC/Oxyma於4 mL溶液中 裂解 = 5 mL之TFA/TIS/H2 O/DODt (92.5:2.5:2.5:2.5)，在38℃下在Accent MW裂解系統(CEM Corp., Matthews, NC)中保持30 min 分析 = 在具有3100單一Quad MS之Waters UPLC ACQUITY H類上使用乙腈/含有0.1% TFA之水作為溶劑系統在C18管柱(1.7 mm, 2.1 × 100 mm)上分析肽 如表1中所顯示，藉由增加相對於胺基酸之碳二亞胺過量(75%對63%)觀察到純度顯著增加。自如表2及3中所顯示合成之其他肽觀察到類似改良。總之，該等結果顯示不僅偶合效率增加，亦避免來自碳二亞胺之潛在封端。推測此來自與封端相關之增加的醯化動力學，由此避免此潛在副反應。另外，增加偶合反應之溫度亦有助於確保自碳二亞胺形成之脲完全溶解且在後續排水及洗滌步驟中去除。因此，高溫提供針對來自經由使用大於1當量碳二亞胺產生之較大量脲之潛在溶解度問題之保護。 然後經由水解、後續衍生及藉由氣相層析(CATGmbH)分析來研究每一胺基酸之差向異構。使用過量碳二亞胺方法觀察到極低程度之差向異構。推測此歸因於偶合反應最快完成(活化物質之短壽命)且不存在外部鹼。因此，此方法提供優於迄今針對高溫偶合闡述之任一先前方法之優點。 表4 利用2當量碳二亞胺合成胸腺素之差向異構分析 在偶合過程期間使用鹼並不理想，此乃因其可引起不期望副反應。Collins等人[7]顯示在90℃下在基於碳二亞胺之偶合方法下在任一鹼不存在下使半胱胺酸差向異構最小之方式。Palasek等人[13]已顯示可在鎓鹽活化方法下在以2當量存在之DIEA及NMM存在下發生大量半胱胺酸差向異構之方式。亦已知Fmoc保護基團緩慢易變至DIEA。此可在較高溫度下增加且產生可難以分離之不期望插入序列。 表5 用於高溫肽偶合之碳二亞胺及鎓鹽活化策略之比較 表6 用於高溫肽偶合之碳二亞胺活化策略之比較 在本說明書中已闡述本發明之較佳實施例，且儘管已採用特定術語，但其僅以一般及描述性意義使用且並不用於限制目的，本發明之範圍定義於申請專利範圍中。

Claims (19)

  1. 一種將胺基酸偶合成肽或擬肽之方法，其改良包含： 在同一容器中實施活化及偶合； 納入與該胺基酸相比大於1當量之量之碳二亞胺； 在活化劑添加劑存在下；且 在大於30℃之溫度下。
  2. 如請求項1之方法，其係固相肽合成(SPPS)方法。
  3. 如請求項1之方法，其中初始對所添加酸中之至少一者進行Fmoc保護。
  4. 如請求項1之方法，其中該碳二亞胺係以與該胺基酸相比1.5當量與4當量之間之量存在。
  5. 如請求項1之方法，其係在大於70℃之溫度下實施。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其限於短於10分鐘之總偶合時間。
  7. 如請求項1至5中任一項之方法，其限於短於15分鐘之總偶合時間。
  8. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該活化劑添加劑係以與該胺基酸相比1當量與1.5當量之間之量存在。
  9. 如請求項1至5中任一項之方法，其中： 該活化劑添加劑係以與該胺基酸相比1當量與1.5當量之間之量存在；且 該偶合步驟限於短於10分鐘。
  10. 如請求項1至5中任一項之方法，其中： 該活化劑添加劑係以與該胺基酸相比1當量與1.5當量之間之量存在；且 該偶合步驟限於短於15分鐘。
  11. 一種將胺基酸偶合成肽或擬肽之組合物，該組合物包含： 胺基酸； 有機溶劑； 與該胺基酸相比大於1當量之量之碳二亞胺；及 活化劑添加劑。
  12. 如請求項11之組合物，其中該組合物進一步包含 1當量與1.5當量之間之該活化劑添加劑。
  13. 如請求項11之組合物，其中該組合物進一步包含1.5當量與4當量之間之該碳二亞胺。
  14. 如請求項11之組合物，其中該胺基酸係Fmoc保護之胺基酸。
  15. 如請求項11之組合物，其進一步包含該胺基酸及該碳二亞胺之O-醯基異脲中間體。
  16. 如請求項15之組合物，其進一步包含DIC或Oxyma活化劑。
  17. 如請求項16之組合物，其進一步包含該胺基酸及該碳二亞胺之該O-醯基異脲之酯。
  18. 如請求項11之組合物，其包含至少一種連接至固相樹脂之胺基酸。
  19. 如請求項11之組合物，其進一步包含連接至固相肽合成樹脂之肽鏈。
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