JP6010052B2 - 複数のペプチド断片をアッセンブルすることによるペプチドを調製するための方法 - Google Patents
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Description
Aiは、以下の環状ビス(2‐スルファニルエチル)アミノ基:
Ci‐1は、チオール官能基を有するアミノ酸残基を表す)
に対応する、環状ジスルフィド状態においてビス(2‐スルファニルエチル)アミノ官能基を有するペプチド(又はポリペプチド)とのそれらの縮合反応、並びに得られたポリペプチドの、C末端での、還元媒体における天然型化学ライゲーションに関する。
A1、A2、A3、...、Ai、...、Anは、ペプチド断片であり、
C1、C2、C3、...、Ci-1、...、Cn‐1は、チオール官能基を有するアミノ酸残基であり、
nは、3〜50の間、好ましくは3〜20の間、又はより好ましくは3〜10の間を含み、及び
iは、2〜nの間を含む任意の整数である)
で表される。
を、環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールR‐SHの作用により、ビス(2‐スルファニルエチル)アミノペプチドであるA1‐SEAoff(SEAoffは、上で定義された通りである)から調製し、
続いて、以下の構造のペプチド断片:
と、芳香族チオールArSHの存在下、上記ペプチドチオエステル(II)とを縮合して得られた、以下の構造の新しいペプチド断片:
を、以下の式のペプチド‐チオエステル:
に、環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールR‐SHの作用により、変換し、
続いて、以下の構造のペプチド断片:
と、芳香族チオールArSHの存在下、上記ペプチドチオエステル(II’)とを縮合して、以下の構造のペプチド断片:
を生成し、
次に、以下の構造のペプチド断片:
を得るために、n‐2回までこれら2つの操作を繰り返し、並びに
この得られたペプチド断片(IVm)と、以下の式のペプチド:
との天然型ライゲーション反応を、一般式(I)の複数のペプチドアッセンブリを生成するために、環状ジスルフィド還元剤の存在下、還元により、行うこと
からなる。
本発明を以下の説明においてより詳細にそして非限定的に述べる。
‐上記式(I)のポリペプチドを製造するための方法に従ったポリペプチド又はペプチドの製造、及び
‐上記のように調製したポリペプチド又はペプチドを、純品又は1つ以上の適合するそして医薬的に許容されるアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物
を含む医薬組成物を製造するための方法に関する。
‐上記式(I)のポリペプチドを製造するための方法に従ったポリペプチド又はペプチドの製造、及び
‐診断装置のために使用するのに適合した形態での、本ポリペプチドの処方又は形成
を含む診断装置を製造するための方法に関する。
3つの断片のワン‐ポットアッセンブリ
1‐アルキルチオールR‐SH(R=‐(CH2)2COOH)及び環状ジスルフィド還元剤の存在下、A1‐SEAoffの変換による、A1‐SR(R=アルキル)に相当する、ペプチド1(H‐ILKEPVHGA‐S(CH2)2COOH)の合成
A1‐C1‐A2‐C2‐A3に相当する、ペプチド4 H‐ILKEPVHGACHHLEPGGCILKEPVHGV‐NH2の合成
A1‐C1‐A2‐SEAoff及びペプチド3(H‐C2‐A3)
TCEP(トリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィン)の存在下、還元によるA1‐C1‐A2‐SEAoffのA1‐C1‐A2‐SEAonへの変換
ペプチド3(16.17mg、11.2μm)を、先の溶液(533μl)に溶解し、その後、不活性雰囲気下、37℃で再度置いた先の反応媒体を添加する。
1‐K1(断片1)‐MPAの合成
K1(断片1)‐SEAoffの合成
ペプチド4K1(125‐209)の合成
グアニジンHCl(573.24mg、6mmol)を、0.1Mリン酸緩衝液(pH=7.3)(1ml)に溶解する。4‐メルカプトフェニル酢酸(MPAA、33.68mg、0.2mmol)を、後の溶液(1ml)に溶解する。NaOH 5M(150μl)を添加して、溶液のpHを7.53に調節する。
K1(125‐209)(3.99mg、0.355μmol)を、10容積%のグリセロール、1mMの還元型グルタチオン、0.2mMの酸化型グルタチオンを含む、10mM PBS緩衝液、138mM NaCl、2.7mM KCl(pH=7.4)(10ml)に溶解する。反応媒体を4℃に置く。
1‐K1(断片3)‐ビオチンの合成
4K1(125‐209)K‐ビオチンペプチドの合成
グアニジンHCl(573.28mg、6mmol)を、0.1Mリン酸緩衝液(pH=7.3)(1ml)に溶解する。4‐メルカプトフェニル酢酸(MPAA、33.59mg、0.2mmol)を、後の溶液(1ml)に溶解する。NaOH 5M(80μl)を添加し、溶液のpHを7.40に調節する。
A)SEAonペプチド断片の合成を、Ollivier N., Dheur J., Mhidia R., Blanpain A.,及びMelnyk O., Bis(2-sulphanylethyl)amino native peptide ligation., Org. Lett. 12(22), 5238-41 (2010)に従って行う。
ペプチド断片(1a)を、グリシンで調製したプライマーサポートから得る。
ペプチド断片(1b)を、アラニンで調製したプライマーサポートから得る。
ペプチド断片(1c)を、バリンで調製したプライマーサポートから得る。
ペプチド断片(1d)を、チロシンで調製したプライマーサポートから得る。
先に得られたペプチド断片(1a)、(1b)、(1c)及び(1d)を、以下の一般的な図:
Claims (7)
- 以下の式:
A1、A2、A3、...、Ai、...、Anは、ペプチド断片であり、
C1、C2、C3、...、Ci-1、...、Cn-1は、チオール官能基を有するアミノ酸残基であり、
nは、3〜50の間を含み、
iは、2及びnの間を含む整数である)
で表される、n断片及びチオール官能基を有するn−1アミノ酸のペプチドアッセンブリを調製するための方法であって、
ビス(2‐スルファニルエチル)アミノペプチド:A1‐SEAoff
(式中、SEAoffは、以下:
から出発し、
環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールR‐SHの作用により、
以下の式:
のペプチド‐チオエステルの調製を実施し、
続いて、以下の構造:
のペプチド断片と、芳香族チオールArSHの存在下、前記ペプチドチオエステル(II)とを縮合して得られた、以下の構造:
の新たなペプチド断片を、
以下の式:
のペプチド‐チオエステルに、環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールR‐SHの作用により、変換し、
そして、以下の構造:
のペプチド断片と、芳香族チオールArSHの存在下、前記ペプチドチオエステル(II’)とを縮合して、以下の構造:
のペプチド断片を生成し、
そして、n‐2回までこれらの2つの操作を繰り返して、以下の構造:
のペプチド断片を得て、
続いて、前記得られたペプチド断片(IVm)と、以下の式:
とを、環状ジスルフィド還元剤の存在下、還元により、天然型ライゲーション反応を実施して、一般式(I)の複数のペプチドアッセンブリを生成する
ことを特徴とする、方法。 - 3又は4つの断片のペプチドアッセンブリが、A1‐C1‐A2‐C2‐A3又はA1‐C1‐A2‐C2‐A3‐C3‐A4の構造を調製することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 3つの断片のペプチドアッセンブリが、「ワンポット(one pot)」反応で調製されることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- C1、C2、C3、...、Ci-1、...、Cn-1が、Cys残基を表すことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチド断片A2、...、Ai、...、An-1の1つ以上が、1つ以上の修飾アミノ酸を有することができることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド‐チオエステルと、構造(III)のペプチド断片との前記縮合が、4‐メルカプトフェニル酢酸の存在下で行われることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 医薬組成物を製造するための方法であって、以下:
請求項1〜5のいずれか1項に記載の式(I)のポリペプチドを製造するための方法に従ってポリペプチド又はペプチドを製造し、及び
上記のように調製したポリペプチド又はペプチドを、純品又は1つ以上の適合するそして医薬的に許容されるアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物を調製する
ことを含むことを特徴とする、方法。
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