JP7230319B2 - ネイティブケミカルライゲーション法による高分子の製造方法 - Google Patents
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Description
[1]ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、
(A)未保護のシステイン残基を有する高分子断片1:
と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片2:
とを、NCL法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片1-2:
を得る工程、
(B)前記工程(A)の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片1-2:
を得る工程を含んでなり、工程(A)および(B)を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法。
[2]工程(B)の後に、(C)脱保護剤を不活性化させる工程をさらに含む、上記[1]に記載の製造方法。
[3]不活性化剤を脱保護剤の添加量を上回る量で存在させる、上記[1]または[2]に記載の製造方法。
[4]工程(A)、工程(B)および工程(C)をさらに1回以上繰り返す、上記[2]または[3]に記載の製造方法。
[5]工程(C)の後に、得られた高分子断片を精製する工程を実施せずに、次の工程(A)、工程(B)および工程(C)を実施する、上記[4]に記載の製造方法。
[6]工程(A)、工程(B)および工程(C)を4回または5回繰り返して実施した場合に、ペプチド結合を有する高分子の収率が25~35%である、上記[4]または[5]に記載の製造方法。
[7]ペプチド結合を有する高分子が、ペプチドであり、
高分子断片1が、アミノ基が未保護のシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1であり、
高分子断片2が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をN末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をC末端に有するペプチド断片2であり、
保護されたシステイン残基を有する高分子断片1-2が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2であり、
未保護のシステイン残基を有する高分子断片1-2が、アミノ基が未保護のシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2である、
上記[1]~[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]脱保護剤が、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体である、上記[1]~[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]保護基が、上記[8]に記載の脱保護剤により脱保護される基である、上記[1]~[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]不活性化剤が、チオール系化合物である、上記[1]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11]反応系において、工程(A)で得られた高分子断片に対する脱保護剤の1回当たりの添加量の比率(モル比)が、1~30である、上記[1]~[10]のいずれかに記載の製造方法。
アリルオキシカルボニル基:Pd/TPPTS
トリアルキルシリルエチルオキシカルボニル基:HF
アルキルオキシカルボニル基:Pd/C/水素
ベンジルオキシカルボニル基:Pd/TPPTS
プロパルギルオキシカルボニル基:トリフルオロメタンスルホン酸
アダマンチルオキシカルボニル基:Pd/ジベンジリデンアセトン(dba)
イソプロピルアリルオキシカルボニル基:Zn/H+
トリクロロエトキシカルボニル基:Zn/酢酸
・高分子断片1は、N末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片であり、
・高分子断片2は、アミノ基が保護されたシステイン残基をN末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をC末端に有するペプチド断片であり、
・保護されたシステイン残基を有する高分子断片1-2は、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2であり、
・未保護のシステイン残基を有する高分子断片1-2は、アミノ基が未保護のシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2である。
(A)N末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片1:
と、アミノ基が保護されたシステイン残基をN末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をC末端に有するペプチド断片2:
とを、NCL法により連結させて、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2:
を得る工程、
(B)前記工程(A)の後に、脱保護剤を添加して、アミノ基が未保護のシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2:
を得る工程を含んでなり、工程(A)および(B)を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法が提供される。
ワンポットにおけるペプチド連結法を確立するため、Aloc基の脱保護剤として機能するパラジウム/トリフェニルホスフィン(Pd/TPPTS)を不活性化する方法について検討した。
2mLチューブにおいてNCL緩衝溶液(6M 塩酸グアニジン、0.2M NaH2PO4、100mM 4-メルカプトフェニル酢酸(MPAA)、40mM トリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、3mM MgCl2・6H2O、pH7.0)200μLに、N末端がAloc基で保護されたペプチドを2mMとなるように溶解した。次いで、6N 塩酸で反応溶液のpHを6.0に低下させ、アルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、Pd/TPPTS(4mM)を添加し、反応溶液を室温で2時間攪拌して、Aloc基の脱保護反応を行った。
カラム:AR-II(ナカライテスク社製)
カラム温度:室温
流速:1.0mL/分
試料導入量:20μL
溶離液:水、アセトニトリル
グラジエント:5~40%(35分間)
検出器:PDA検出器
MPAAによるPd/TPPTSの不活性化の条件を検討した。具体的には、0.6mLチューブにおいてNCL緩衝溶液(6M 塩酸グアニジン、0.2M NaH2PO4、100mM 4-メルカプトフェニル酢酸(MPAA)、40mM トリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、3mM MgCl2・6H2O、pH7.0)25μLに、4mM、8mMまたは12mMとなるようにPd/TPPTSを添加した。Pd/TPPTSを不活性化するため、反応溶液を室温で1時間撹拌した。次いで、各反応溶液にN末端がAloc基で保護されたペプチドを2mMとなるように添加し、室温で10分間撹拌した。
(1)ペプチド断片の合成
ペプチド1:LENVWRD(配列番号1)、ペプチド2:CVTYTEH(配列番号2)、ペプチド3:CKRKTVT(配列番号3)、ペプチド4:CRDVTY(配列番号4)、ペプチド5:CLKRQGRTLYGFGG(配列番号5)をペプチド合成機ResPep SL(INTAVIS社製)を用いてFmoc法による固相合成法により合成した。N末端のシステイン残基がAloc基で保護されたペプチドは、Aloc-Cys(Trt)-OH(Cas:96865-72-4、L01807、渡辺化学工業社製)を用いて上記固相合成法を行うことにより調製した。C末端がチオエステル化されたペプチドは、上記固相合成法を行うことにより調製したペプチドに2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム(MESNa)を反応させ、次いで、RP-HPLCにより精製することにより調製した。
質量分析装置:microflex(BRUKER社製)
測定モード:リフレクター・ポジティブ
マトリックス:α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)
ペプチド1-2-3-4-5を含む上記(5)の反応溶液を、6N 塩酸を用いてpH0.5~1.0に調整した。次いで、脱硫反応を阻害するMPAAを除去するため、ジエチルエーテルを反応溶液に添加し10秒間激しく攪拌した後、エーテル層を除去した。これらの操作を4回繰り返した後、加熱することによってエーテルを完全に除去した。
(1)ヒストンH3のリジン残基のトリメチル化
ヒストンH3のK9位置のリジン残基(K)のトリメチル化(me3)(以下、「H3K9me3」ということがある。)は、最も有名なヒストン修飾の1つであり、遺伝子サイレンシングの重要な特徴である。この修飾は、ヘテロクロマチンの形成に寄与する。ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)は、π-カチオン相互作用によってそのクロモドメイン(CD)によってH3K9me3を認識し、クロモシャドウドメイン(CSD)を介して二量体化する。豊富なヒストンH3K9me3マーカーが存在すると、HP1はそのCDおよびCSDドメインを介してヘテロクロマチン形成を誘導する。
N末端システイン残基の保護のためのAloc基および内部システイン残基の保護のためのAcm基が選択的に除去できるかどうかを試験した。NCL条件下で2当量のPd/TPPTS錯体でAloc基が除去されたことが確認された。一方、Acm基は同じ条件下で全く脱保護されなかった。次に、PdCl2錯体を用いてAcm基を除去した。この保護基は10当量のPdCl2錯体で20分以内に除去された。Aloc基も同じ条件下で除去されたが、反応速度はAcm基に比べて非常に遅かった。
通常、バリン残基-システイン残基間のNCL法による連結は、β-分枝形成の立体障害が原因でチオエステル交換が妨げられたため非常に遅かった。従前のヒストンH3の化学合成では、この連結を完了するのに約48時間かかった。本発明では標準的なバリン残基の代わりにペニシラミンを導入した。側鎖のチオール基はC末端チオエステルを攻撃して4員環を形成することが確認された。この状態は、4員環上に2つのメチル基が存在することによるソープ・インゴールド効果(Thorpe-Ingold Effect)によって安定化される(Y. Wang et al., Chem. Sci., 9:1940-1946(2018)参照)。この歪んだチオエステル形成は、バリン残基とシステイン残基の間の連結を容易にした。
下記のペプチド6、ペプチド7およびペプチド8をペプチド合成機ResPep SL(INTAVIS社製)を用いてFmoc法による固相合成法により合成した。
(9番目のアミノ酸残基はトリメチル化リジンである。46番目のXはペニシラミン(D-penicillamine、(2S)-2-アミノ-3-メチル-3-スルファニルブタン酸)を表す。)
ペプチド7:CLREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSS(配列番号12)
ペプチド8:CVMALQEACEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA(配列番号13)
(9番目および23番目のアミノ酸残基はAcm基で保護されたシステイン残基である。)
Claims (9)
- ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、
(A)未保護のシステイン残基を有する高分子断片1:
と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片2:
とを、ネイティブケミカルライゲーション法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片1-2:
を得る工程、
(B)前記工程(A)の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片1-2:
を得る工程を含んでなり、工程(A)および(B)を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法であって、
前記脱保護剤が、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体であり、
前記保護基が、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体により脱保護される基であり、
前記不活性化剤が、チオール系化合物である、製造方法。 - 工程(B)の後に、(C)脱保護剤を不活性化させる工程をさらに含む、請求項1に記載の製造方法。
- 不活性化剤を脱保護剤の添加量を上回る量で存在させる、請求項1または2に記載の製造方法。
- 工程(A)、工程(B)および工程(C)をさらに1回以上繰り返す、請求項2または3に記載の製造方法。
- 工程(C)の後に、得られた高分子断片を精製する工程を実施せずに、次の工程(A)、工程(B)および工程(C)を実施する、請求項4に記載の製造方法。
- 工程(A)、工程(B)および工程(C)を4回または5回繰り返して実施した場合に、ペプチド結合を有する高分子の収率が25~35%である、請求項4または5に記載の製造方法。
- ペプチド結合を有する高分子が、ペプチドであり、
高分子断片1が、アミノ基が未保護のシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1であり、
高分子断片2が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をN末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をC末端に有するペプチド断片2であり、
保護されたシステイン残基を有する高分子断片1-2が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2であり、
未保護のシステイン残基を有する高分子断片1-2が、アミノ基が未保護のシステイン残基をN末端に有するペプチド断片1-2である、
請求項1~6のいずれか一項に記載の製造方法。 - 金属錯体が、パラジウム錯体、プラチナ錯体、ニッケル錯体、ロジウム錯体、ルテニウム錯体、銅錯体および鉄錯体からなる群から選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 反応系において、工程(A)で得られた高分子断片に対する脱保護剤の1回当たりの添加量の比率(モル比)が、1~30である、請求項1~8のいずれか一項に記載の製造方法。
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Angew. Chem. Int. Ed.,2015年05月04日,Vol.54, No.19,p.5713-5717 |
Chem. Commun.,2012年09月13日,Vol.48, No.95,p.11601-11622 |
Chem. Commun.,2013年10月18日,Vol.49, No.81,p.9254-9256 |
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