JP6321542B2 - タンパク質の合成方法 - Google Patents
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Description
−SEAペプチドの使用
−任意で後でSEAに変換されるSEAoffペプチドの使用
を含む。
−N末端にシステイン、C末端にCOS−基を担持するペプチドの使用
−当該COS基を、樹脂に支持されたペプチドのC末端で−COSRチオエステルに変換すること
−次のペプチド断片の末端システイン上で各ライゲーションを実施するために樹脂で支持されたペプチドのC末端チオエステル官能性を使用すること
に基づく。
A1−C1−A2−C2−A3− … −Ci−1−Ai−…. −Cn−1−An (I)
(式中、
A1、A2、A3、… Ai …、Anがペプチド断片であり;
C1、C2、C3、… Ci−1、… Cn−1がチオール基を担持するアミノ酸残基であり;
nが3〜50の整数であり;そして
iが2〜nの整数である)
で表され、以下の工程:
(a1)Y−A1−SEAoff (II1)断片を調製する1つ以上の工程、ここでA1はペプチド断片であり、当該断片のC末端が、SEAoffと呼ばれる環式bis(2−スルファニルエチル)アミノ基
(b)Y−A1−SEAoff(II1)と、□−Y’と表記される固相支持体とを反応させる1つ以上の工程、ここで□は固相支持体自体を表し、Y’は、以下の式
(a2)H−C1(PG1)−A2−SEAoff (II2)断片を調製する1つ以上の工程、ここでC1、A2及びSEAoffは上記で定義したものであり、(PG1)は、H又はアミノ酸C1のチオールの保護基を表す;
(c1)式(III1’)のチオエステルペプチドを調製する1つ以上の工程、当該工程は、以下の式
(d1)以下の式
(an−1)Cn−1(PG n−1)−An断片を調製する1つ以上の工程、ここで(PGn−1)は、H又はアミノ酸Cn−1のチオールの保護基を表す;
(dn−1)芳香族チオールArSHの存在下、PGn−1がHでない場合、PGn−1が除去される条件下、Cn−1(PG n−1)−Anと□−Z−A1− C1−A2−…Ci−1Ai−…Cn−2An−1SEAoff (IIIn−1)を縮合させて、□−Z−A1− C1−A2−…Ci−1Ai−…Cn−1An (IVn)を得る1つ以上の工程;
を含む。
(e)前記固相支持体からペプチドA1−C1−A2−…Ci−1Ai−…Cn−1An (I)を切り離す工程;
を含む。
Y’がアザイドから選択される基を含み、Yがアルキン基を含む基から選択される、又は
Y’がアルキン基を含み、Yがアザイド基を含む基から選択される、又は
Y’がアルデヒド基を含み、YがHであり、A1のN末端アミノ酸が、システイン、セリン又はスレオニンから選択され、又は
Y’がアルデヒド基を含み、YがSchiff塩基を形成するNH2基を含む。
(ci)任意で環式ジスルフィドの還元剤の存在下、チオールR−SHの作用により、□−Z−A1−C1− …Ci−1AiSEAoff (IIIi)を□−Z−A1− C1− …Ci−1−AiSR (III’i)に変換する1つ以上の工程;
(di)(PGi)が水素又はアミノ酸Ciのチオールの保護基を表す場合、Ci(PGi)Ai+1SEAoffを□−Z−A1− C1− …Ci−1Ai−SR (III’i)と縮合して、□−Z−A1−C1− …CiAi+1SEAoff (IIIi+1)を得る工程;
を含む。
□−Z−A1−SEAoff (III1)
(式中、
A1はペプチド断片であり、当該断片のC末端が、SEAoffと呼ばれる環式bis(2−スルファニルエチル)アミノ基
で表される、当該固相支持体である。
ペプチド(IIi) Ci(PG i)Ai+1SEAoff、及び:
1つ以上のチオールR−SH、及び任意で環式ジスルフィドの還元剤:
カップリング活性化剤、及び;
洗浄産物;
を含有する受容部も有する。
−上記方法により1つ以上のポリペプチドを製造すること、及び
−それを医薬として許容される支持体と組み合わせること
を含む、医療製品を製造する方法である。
Y’がアルキンを含むとき、Yはアザイドであり、
Y’がアザイドを含むとき、Yはアルキンであり、
Y’がアルデヒドであるとき、YはHであり、A1のN末端アミノ酸は、システイン、セリン又はスレオニンから選択され、又は
Y’がアルデヒドであるとき、YはSchiff塩基を形成出来るNH2基、例えばヒドラジノカルボニル基H2NNHCO、又はより一般的には、ヒドラジン又はH2NOの誘導体、即ちヒドロキシルアミンの誘導体から選択される。
□−N3
□−NH−CO−(CH2)m−N3
AiはC末端がbis(2−スルファニルエチル)アミノ基
Ci−1はチオール基を担持するアミノ酸残基を表す)
に対応する環式ジスルフィド状態のbis(2−スルファニルエチル)アミノ基を担持するペプチド(又はポリペプチド)との縮合反応(diに基づく。
−チオールR−SH及び任意で環式ジスルフィドの還元剤、
−カップリング活性化剤、及び
−洗浄産物
のために提供されてもよい。
−上記方法により1つ以上のポリペプチドを製造する工程、及び
−それを医薬として許容される支持体と組み合わせる工程
を含む、医薬製品を製造する方法である。
H−GILKEPVQGA−CHHLEPGG−CHHLEPAG−CILKEPVHGA−NH2
ペプチド11aは、図2に示すダイアグラムに従い、4つのペプチド断片の連続ライゲーションにより調製される。
N3−Esoc基はWO2011/058188に記載されている。
−ぺプチジル樹脂2 H−GILK(Boc)E(tBu)PVQ(Trt)GA−SEA−PSの合成
固相支持体SEA−PS(PS=ポリスチレン)は、出願FR−2952058に記載される。
活性化アームN3−Esoc−ONp(ダイアグラム3)は、WO2011/058188に記載の手順に従い合成される。2−[2−(2−アザイド−エトキシ)−エチルスルホニル]−エチルと4−ニトロフェニル(145 mg, 0.4 mmol, 1.5 eq)の混合物を最小の量のDMFに溶解し、樹脂に直接移す。N−メチルモルホリン(55 μL, 0.5 mmol, 2 eq)を添加する。当該反応混合物を常温のアルゴン大気中で12時間撹拌する。当該樹脂をDMF (2 x 2 min)、CH2Cl2 (2 x 2 min)及びEt2O (2 x 2 min)で連続して洗浄し、真空下で乾燥させる。
LC−MS:緩衝剤A: H2O/TFA (1:0.05% v/v), 緩衝剤B: CH3CN/H2O/TFA (4:1:0.05% v/v/v)。C18 Xbridge BEHカラム(300 Å, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm)上のRP−HPLC、線形勾配30分以内0−100% B流速1 mL/min, ELS検出。
P−1−(1,2,3−トリアゾリル)−Esoc−GILKEPVQGA−SEAoffの調製は、下記ダイアグラム4に例示される。
アミノメチルPEGA 800 (0.4 mmol/g)を、WO2011/058188に記載の手順に従いペンチン酸とカップリングさせる。得られたアルキン樹脂(2 eq)を、1.67mlのHEPES 100 mM緩衝剤pH = 7.5とメタノールの9:1混合物中のアザイドペプチド4(10 μmol)溶液に添加する。得られた懸濁物をアルゴン(30分)でバブリングして脱酸素処理し、塩酸アミノグアニジン(1.1 mg, 1 eq), トリス(ハイドロキシプロピル)トリアゾリルメチル−アミン(THPTA)(260 mg, 60 eq), 五水和硫酸銅 (75 mg, 30 eq)及びアスコルビン酸ナトリウム(119 mg, 60 eq)を添加し、当該懸濁物をアルゴンでバブリングしながら室温で30分間撹拌する。当該ペプチジル樹脂5.1を、大量の:水(脱イオン)、EDTA 250 mM pH 4.2の溶液、水、メタノール、DMF及び最後に水で連続的に洗浄する。
HPLC:緩衝剤A: H2O/TFA (1:0.1% v/v),緩衝剤B: CH3CN/TFA (1:0.1% v/v/v)。結果を図5に示す。C18 Nucleosilカラム(300 Å, 5 μm, 4.6 x 250 mm)上のRP−HPLC、線形勾配20分以内25−45% B流速1 mL/min, DAD検出。結果を図6に示す。
tris(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)300 mmol/Lを、0.2 M リン酸緩衝剤pH = 7.3中で調製する。そして3−メルカプトプロピオン酸(MPA)(10 vol%, 0.1 mL, 1.14 mmol)を添加する。取得される溶液は、pH=4に調整される。
本実験は、グローブボックス([O2] <50 ppm)中で実施される。前記ペプチド7.1(9.4 mg, 0.0068 mmol, 1.5 eq)を、上記MPAA (270 μL 500 mmol/L, リン酸緩衝剤pH = 7.2)の溶液に溶解し、ペプチジル樹脂6.1に移す。当該反応混合物を、37℃で24時間撹拌する。反応後、当該樹脂を排水し、緩衝剤A (H2O/TFA)(1/0.05% v/v, 3x 300 μL x 2 min)で洗浄する。
ペプチジル樹脂5.2は、上記5.1を6.1に変換するプロトコールを使用して、MPAの樹脂6.2チオエステルに変換される。
ペプチド7.2(X = Ala, 9.5 mg, 0.0068 mmol, 1.5 eq)を、ペプチジル樹脂5.2に使用したのと厳密に同一の合成プロトコル(サイクル1)を使用して、ペプチジル樹脂6.2と反応させる。
LC−MS:緩衝剤A: H2O/TFA (1/0.05% v/v),緩衝剤B: CH3CN/H2O/TFA (4/1/0.05% v/v/v)。C18 Xbridge BEHカラム(300 Å, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm)上のRP−HPLC、線形勾配30分以内0−100% B 、流速= 1 mL/min, ELS検出。MS:陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧30V、四重極解析器。図10参照。
本ペプチドの合成は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic Letters 2010, 12, 5238−41に記載されている。
本反応は、グローブボックス([O2] <50 ppm)中、窒素大気下で実施される。300 mmol/LのTCEPの溶液を、0.2Mリン酸緩衝剤pH = 7.3中で調製する。そして3−メルカプトフェニル酢酸(MPAA 84 mg, 0.5 mmol)を添加する。取得されるTCEP/MPAAのpHを、6.5に調整する。
LC−MS:緩衝剤A: H2O/TFA (1/0.05% v/v),緩衝剤B: CH3CN/H2O/TFA (4/1:0.05% v/v/v)。C18 Xbridge BEHカラム(300 Å, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm)上のRP−HPLC、線形勾配30分以内0−100% B、流速1 mL/min、ELS検出。MS:陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧30V、四重極解析器。質量スペクトルを図12に示す。
II−A− 樹脂12の合成:Pal−ChemMatrix 5−アミノ−5−オキソペンタン酸
以下に合成ダイアグラム5を示す。
本合成は、下記ダイアグラム6に従い実施される:
本合成は、下記ダイアグラム7に従い実施される:
本合成は、下記ダイアグラム8に従い実施される:
本合成は、下記ダイアグラムに従い実施される:
LC−MS:緩衝剤A: H2O/TFA (1:0.05% v/v),緩衝剤B: CH3CN/H2O/TFA (4:1:0.05% v/v/v)。C18 Xbridge BEHカラム(300 Å, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm)上のRP−HPLC、線形勾配A/B:30分以内0−100% B、流速1 mL/min、ELS検出。MS:陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧30V、四重極解析器。図14は、取得されたRP−HPLCスペクトルを例示する。RsMPAAとマークしたピークは、MPAAの残基を表す。当該質量スペクトルを、図15に示す。
III−A− 断片N3−ESOC−AAAAAKDYIRN−SEAoffの合成
本合成は、下記ダイアグラムに従い実施される。
本ペプチジル樹脂は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238−41に記載のプロトコルに従い、0.25 mmolのスケールで合成される。
活性化アームN3−Esoc−ONpは、WO2011/058188に記載の手順に従い合成される。2−[2−(2−アザイド−エトキシ)−エチルスルホニル]−エチルと4−ニトロフェニルの混合炭酸塩(145 mg, 0.4 mmol, 1.5 eq)が、最小量のDMF中に溶解され、そして樹脂17に直接移される。N−メチルモルホリン(55 μL, 0.5 mmol, 2 eq)が添加される。当該反応混合物を室温でアルゴン大気中12時間撹拌する。樹脂18をDMF (2 x 2 min)、CH2Cl2 (2 x 2 min)及びEt2O (2 x 2 min)で連続して洗浄し、真空下で乾燥させる。
LC−MS:緩衝剤A: H2O/TFA (1/0.05% v/v),緩衝剤B: CH3CN/H2O/TFA (4/1/0.05% v/v/v)。C18 Xbridge BEHカラム(300 Å, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm)上のRP−HPLC、線形勾配30分以内0−100% B 、流速= 1 mL/min, ELS検出。MS:陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧30V、四重極解析器。
本合成は、下記ダイアグラムに従い実施される。
Dommerholt, J. et al., Angewandte Chem., Int. Ed. 2010, 49, 9422−9425に記載の手順に従い調製された、ビシクロ[6.1.0]ノン−4−イン−9−イルメチルと4−ニトロフェニルの混合炭酸塩(176 mg, 0.56 μmol, 3 eq)が、最小量のDMF中に溶解され、そしてアミノメチルPEGA1900樹脂(0.4 mmol/g)に直接移される。N−メチルモルホリン(55 μL, 0.5 mmol, 2 eq)が添加される。当該反応混合物を室温でアルゴン大気中12時間撹拌する。樹脂18をDMF (2 x 2 min)、CH2Cl2 (2 x 2 min)及びEt2O (2 x 2 min)で連続して洗浄し、真空下で乾燥させる。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(370 μL, 3.36 mmol, 6 eq)が添加される。当該反応媒体を、室温、アルゴン大気中、16時間撹拌する。当該樹脂をDMF (2 x 2 min)、CH2Cl2 (2 x 2 min)、DMF中の20%ピペリジン、そしてMeOH/DMF/AcOH混合物(9:9:2) (5 x 2 min)、及びMeOH (2 x 2 min)で連続して洗浄する。
DMF中に20%ピペリジン, MeOH/DMF/AcOH (9:9:2), DMF, MeOH、及び最後に水。
緩衝剤A: H2O/TFA (1:0.1% v/v),緩衝剤B: CH3CN/TFA (1:0.1% v/v/v)。C18 Nucleosilカラム(300 Å, 5 μm, 4.6 x 250 mm)上のRP−HPLC、線形勾配20分以内25−45% B流速1 mL/min, DAD検出。
本ペプチドは、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238−41に記載のプロトコルに従い、0.25mmolのスケールで合成される。
本ペプチドは、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238−41に記載のプロトコルに従い、0.25mmolのスケールで合成される。
本ペプチドは、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238−41に記載のプロトコルに従い、0.25mmolのスケールで合成される。
tris(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)200 mmol/Lが、pH7.2のグアニジン(6M)を含有する0.2Mリン酸緩衝剤中で調製される。そして3−メルカプトプロピオン酸(MPA) (5 vol%, 0.05 mL, 0.58 mmol)が添加される。取得される溶液のpHを、4に調整する。
本実験は、グローブボックス([O2] <50 ppm)中で実施される。前記ペプチド22(2.3 mg, 0.75 μmol, 1.5 eq)を、上記MPAA(150 μL、300mmol/L, グアニジン(6M)を含有する0.1Mリン酸緩衝剤pH = 7.2)の溶液に溶解し、ペプチジル樹脂21に移す。当該反応混合物を、37℃で24時間撹拌する。反応後、当該樹脂を排水し、グアニジン(6M)を含有する0.2Mリン酸ナトリウム緩衝剤pH = 7.2(3x 150 μL x 2 min)で洗浄する。
LC−MS:緩衝剤A: H2O/TFA (1/0.05% v/v),緩衝剤B: CH3CN/H2O/TFA (4/1/0.05% v/v/v) 。C18 Xbridge BEHカラム(300 Å, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm)上のRP−HPLC、線形勾配30分以内0−100% B流速1 mL/min, ELS検出。MS:陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧30V、四重極解析器(図21)。
ペプチド25(3 mg, 0.75 μmol, 1.5 eq)を、ペプチジル樹脂23の合成に使用したのと厳密に同一の合成プロトコルを使用して(サイクル1)、ペプチジル樹脂24と反応させる。
本反応は、グローブボックス([O2] <50 ppm)中、窒素大気下で実施される。200 mmol/LのTCEPの溶液を、グアニジン(6M)を含有する0.2Mリン酸緩衝剤pH = 7.3中で調製する。そして3−メルカプトフェニル酢酸(MPAA 33 mg, 0.2 mmol)を添加する。取得されるTCEP/MPAA溶液のpHを、6.5に調整する。
操作はグローブボックス([O2] <50 ppm)中で実施される。ペプチジル樹脂28を、NaOH (500 μL, 10−2 M)溶液を添加して、37℃で5分間撹拌することにより開裂させる。ビーズを濾過し、洗浄し、濾液を凍結乾燥する。
ペプチド29のRP−HPLCクロマトグラム(図24)
LC−MS:緩衝剤A: H2O/TFA (1/0.05% v/v),緩衝剤B: CH3CN/H2O/TFA (4/1/0.05% v/v/v) 。C18 Xbridge BEHカラム(300 Å, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm)上のRP−HPLC、線形勾配30分以内0−100% B流速1 mL/min, ELS検出。MS:陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧30V、四重極解析器(図25)。
Claims (11)
- ペプチド断片を組み合わせてn個のペプチド断片とチオール基を担持するn−1個以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを製造する方法であって、当該ポリペプチドが、
A1−C1−A2−C2−A3−…−Ci−1−Ai−….−Cn−1−An (I)
(式中、
A1、A2、A3、…Ai…、Anがペプチド断片であり;
C1、C2、C3、…Ci−1、…Cn−1がチオール基を担持するアミノ酸残基であり;
nが3〜50の整数であり;そして
iが2〜nの整数である)
で表され、以下の工程:
(a1)Y−A1−SEAoff(II1)断片を調製する工程、ここでA1はペプチド断片であり、当該断片のC末端が、SEAoffと呼ばれる環式bis(2−スルファニルエチル)アミノ基
Yは固相支持体の基と反応してA1と固相支持体との間に結合を形成する断片である;
(b)Y−A1−SEAoff(II1)と、□−Y’と表記される固相支持体とを反応させる工程、ここで□は固相支持体自体を表し、Y’は、以下の式
Y’がアザイドから選択される基を含み、Yがアルキン基を含む基から選択される、又は
Y’がアルキン基を含み、Yがアザイド基を含む基から選択される、又は
Y’がアルデヒド基を含み、YがHであり、A 1 のN末端アミノ酸が、システイン、セリン又はスレオニンから選択される、又は
Y’がアルデヒド基を含み、YがSchiff塩基を形成するNH 2 基を含む;
(a2)H−C1(PG1)−A2−SEAoff(II2)断片を調製する工程、ここでC1、A2及びSEAoffは上記で定義したものであり、(PG1)は、H又はアミノ酸C1のチオールの保護基を表す;
(c1)式(III1’)のチオエステルペプチドを調製する工程、当該工程は、以下の式
(d1)以下の式
(an−1)Cn−1(PGn−1)−An断片を調製する工程、ここで(PGn−1)は、H又はアミノ酸Cn−1のチオールの保護基を表す;
(dn−1)芳香族チオールArSHの存在下、PGn−1がHでない場合、PGn−1が除去される条件下、Cn−1(PGn−1)−Anと
□−Z−A1−C1−A2−…Ci−1Ai−…Cn−2An−1SEAoff(IIIn−1)
を縮合させて、
□−Z−A1−C1−A2−…Ci−1Ai−…Cn−1An(IVn)
を得る工程;
を含み、
そして、前記方法が、i=2,…n−2のいずれの場合も、以下の工程
(ci)環式ジスルフィドの還元剤の存在下、チオールR−SHの作用により、
□−Z−A1−C1−…Ci−1AiSEAoff(IIIi)
を
□−Z−A1−C1−…Ci−1−AiSR(III’i)
に変換する工程;
(di)芳香族チオールArSHの存在下、PG1がHでない場合、PG1が除去される条件下、Ci(PGi)Ai+1SEAoff(式中、(PGi)は、水素、又はアミノ酸Ciのチオールの保護基を表す)を、
□−Z−A1−C1−…Ci−1Ai−SR(III’i)
と縮合して、
□−Z−A1−C1−…CiAi+1SEAoff(IIIi+1)
を得る工程、
ここで、工程(ci)及び(di)は工程(dn−1)の前に行われる、
を更に含む、当該方法。 - 更に:
(e)前記固相支持体からペプチドA1−C1−A2−…Ci−1Ai−…Cn−1An(I)を切り離す工程;
を含む、請求項1に記載の方法。 - 固相支持体□が、樹脂である、請求項1又は2に記載の方法。
- C1,...Ci…Cnがシステインである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- PG1,...PGi…PGnがtert−ブチルスルフェニル基である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法であって、Rが、1〜12個の炭素原子を有し、直鎖又は分岐鎖で、アルキルラジカル、又はC6−C12アリールから選択される、当該方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法であって、i=2,…n−2のいずれの場合も、当該方法の工程di)が、SEAoffに影響を与えずにin situで選択的にPGiを除去する条件下で実施され、当該反応の溶媒が、pH4〜9の、芳香族チオールを含有する水性緩衝剤である、当該方法。
- 医薬品を製造する方法であって;
請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法により1つ以上のポリペプチドを製造する工程;及び
当該ポリペプチドを医薬として許容される担体と組み合わせる工程;
を含む、当該方法。 - 固相支持体であって、ペプチドがグラフトされ、以下の式:(III1)
□−Z−A1−SEAoff(III1)
(式中、
A1はペプチド断片であり、当該断片のC末端が、SEAoffと呼ばれる環式bis(2−スルファニルエチル)アミノ基
で表される、当該固相支持体。 - ポリペプチド合成キットであって、1つ以上の受容部を備えた1つ以上の支持部を備え、その上部又は内部に、1つ以上の請求項9に記載のグラフトされた固相支持体が配置される、当該キット。
- ペプチドを合成するための自動化されたデバイスであって、
内部にペプチドがグラフトされ、以下の式
□−Z−A1−SEAoff(III1)
に対応する固相支持体が配置された1つ以上の受容部であって、個別に:
ペプチド(IIi)Ci(PGi)Ai+1SEAoff、及び:
1つ以上のチオールR−SH、及び任意で環式ジスルフィドの還元剤:
カップリング活性化剤、及び;
洗浄産物;
を含有する当該受容部;
生産物の試料を取り出し、分別する機械的手段;並びに
これらの機械的手段の制御された利用を可能とするデータ処理手段;
を備える、当該デバイス。
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