CN103998455B - 合成蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于由肽片段组装蛋白质的方法。所述方法使蛋白质的制备方式简单可靠，并且可在工业规模上应用。这种方法可以制备具有治疗或诊断价值的蛋白质。本发明还涉及用于实施所述合成蛋白质方法的试剂盒以及用于检测和/或诊断的试剂盒。

Description

合成蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及由肽片段组装蛋白质的新型方法。该方法可以实现通过简单可靠、自动化和适用于工业规模的方法来制备蛋白质。该方法可用来制备治疗或诊断目的的蛋白质。本发明也涉及用于实施该合成方法的试剂盒和自动化装置以及检测和/或诊断试剂盒。
背景技术
当合成的多肽较大时，采用在固相中逐个连接氨基酸的传统方法的多肽合成会受低产率的限制。通过化学连接反应将两个多肽组装成更长多肽是已知的可以克服该限制的方法。
多肽的全合成对于制备具有明确结构或者带有天然修饰(例如翻译后修饰)或非天然修饰的蛋白质越来越有用。该化学连接反应方法可满足这种要求，但是其被证明在使用和工业应用方面存在局限性。
通常地，在这些方法中，期望通过连接反应组装成的多肽之间的键是天然的，也就是说与多肽的天然结构一致。
目前关于天然连接的主要方法是例如由Kent和Dawson提出的国际申请WO96/34878和WO98/28434中描述的方法。该方法基于(C-端)硫酯肽和半胱氨酰基-肽之间的化学选择性反应。然而，该方法的主要缺点是制备硫酯肽时需要复杂的化学方法。这些方法无法阻止不同的硫酯反应之间的竞争，这不可避免地生成难以分离的混合物，因此影响所得终产物的纯度，并且不可避免地损失产率。
一种替代方法是所谓的Staudinger连接，其描述于国际申请WO01/68565和WO01/87920中。这包括膦基硫酯与叠氮化物反应并水解该复合反应物以形成酰胺键。但是，该方法难以应用于工业规模。
在国际申请WO2007/037812中描述的另一种方法是基于α-酮酸与N-烷氧基胺的脱羧缩合反应。但是，酮酸是难以制备且难以引入肽中的分子。因此，该第三种方法也难以适用于不具备进行复杂有机合成的设备的肽合成实验室。
O.Melnyk等人在Org.Lett.,12(22),5238-41(2010)和专利申请FR-2952058中公开的工作以及Hou,W.,Zhang,X.,Li,F.和Liu,C.F.Peptidyl N,N-Bis(2-mercaptoethyl)-amides as Thioester Precursors for Native Chemical Ligation.Org.Lett.13,386-389(2011)中公开的工作描述了借助肽-二(硫乙基)胺基片段的肽天然连接反应。然而，迄今为止这种方法仍没有用于3个或更多个片段组装合成多肽。
申请WO2011/058188描述了提纯方法，包括在固相肽合成结束时在N-末端连接叠氮官能团。若使用Staudinger-Bertozzi反应或环加成反应(CuAAC,SPAAC)可能会将目标肽接枝到预先由膦或炔功能化的与水相容的树脂上。在洗涤树脂以除去未能共价连接到树脂上的被截断的肽之后，最终在温和条件(碱、亲核、或光照)下将该键断裂解离出肽。然而，在这篇文献中，并未想到使用接枝方法以实行通过连续的肽连接反应来合成蛋白质。
M.Villain等人的Chemistry and Biology8(2001)673-679的文献描述了提纯方法，包含在肽合成结束时通过N-末端残基与醛官能团反应将N-末端含有半胱氨酸或苏氨酸的肽接枝于树脂上的步骤，从而形成噻唑烷或噁唑烷环。然后洗涤该接枝的肽并将其从树脂上分解出来。然而，在这篇文献中，并没有想到使用接枝方法以实行通过连续的肽连接反应来合成蛋白质。
文献US7884182和文献“Synthesis of Peptide-PNA-Peptide Conjugates bySemi-Solid-Phase Chemical Ligation Combined with Deactivation/Capture ofExcess Reactants，Martijn C.de Koning.Eur.J.Org.Chem.2004,850-857”描述了利用固体载体的肽连接反应。作者通过噻唑烷键的形成将H-Cys-A-SR肽(R＝烷基)连接到该载体上，然后实施载体上硫酯官能团和H-Cys-B肽之间的天然的连接反应NCL。所述H-Cys-A-SR肽很难合成。在噻唑烷形成期间，由于反应性的两端，该方法具有很高的发生聚合反应或环化反应的几率。最终，该方法无法在载体上实施超过一个的连接反应。
文献FR2952058描述了在液相中C-末端到N-末端方向上的肽连接反应方法。该方法包括：
-利用SEA肽，-任选地利用SEAoff肽，然后将其转变为SEA。
文献US2002/0132975描述了在固相中通过肽片段的连续天然连接反应组装肽的方法。该合成方法可以从N-末端到C-末端或在相反方向上实施。该方法基于：
-利用含有N-末端半胱氨酸和C-末端COS-基团的肽，
-在树脂负载的肽的C-末端将-COS-官能团转化为-COSR硫酯基，
-利用树脂负载的肽的C-末端硫酯官能团来实施在邻近肽片段的末端半胱氨酸上的各个连接反应。
然而，硫代酸肽(即，带有COS-官能团)，例如专利申请US2002/0132975中描述的起始产品，很难通过合成制备、很难纯化并且该物质不稳定。此外，特别是当肽序列中存在游离的半胱氨酸时，由于还存在半胱氨酸烷基化反应的风险，很难进行硫代酸官能团到硫酯的活化步骤。最终，与SEAoff基团相反，硫代酸基团是未被阻断的反应性基团。对此，Canne,L.E.等人的J.Am.Chem.Soc.1999,121,8720-8727的工作中也有特别的阐明，其中作者发现由硫代酸基团残基反应性导致显著生成环状副产物。
相对于现有技术的方法，本发明的方法具有更高的SEAoff官能团到硫酯的转化效率，反应条件更温和并且不会导致生成副产物。此外，与其他反应性基团(具体是专利申请US2002/0132975中描述的硫代酸)相反，SEAoff是一种在连接反应条件下被阻断的体系。最终，SEAoff片段易于在固相中通过Fmoc/叔丁基策略合成，这不同于硫代酸肽的情况。
为了可能实现在工业规模上通过全合成来合成肽，需要改进方法，这就要求寻找简单、廉价、能生产高纯度的优质产品并且符合工业卫生的方法。
基于上述理由，有必要寻找收敛性的并且能工业应用的全合成方法，以可能合成所需长度和性质的肽链；具体而言，涉及从N-末端到C-末端组装的方法，其具有实施简单并且获得的肽或多肽纯度高的特点。事实上，与更传统的从C-末端到N-末端的相反组装策略相比，从N-末端到C-末端的组装具有很大的优势，因为这种方法允许通过除去乙酰化的N-截断肽实现肽片段的“自净化”，所述乙酰化的N-截断肽是固相肽合成(SPPS)中的主要杂质。
本发明使得克服溶液中涉及多重连接反应的困难。本发明使得合成很大的蛋白成为可能。本发明也很容易自动化并且可推广到工业规模。
发明内容
发现，即成为本发明的主题，在固相合成方法中包含简单方法(例如肽-硫酯生成和天然的连接反应)的多个肽片段的组装能够得到收敛性全合成方法，该全合成方法能够自动化、能够应用于工业上而且满足纯度要求标准。
为了该目的，本发明提议了用于制备包含n个肽片段和至少n-1个带有硫醇官能团的氨基酸的多肽的肽片段组装方法，所述多肽由下式表示：
A1-C1-A2-C2-A3-…-Ci-1-Ai-....-Cn-1-An (I)
其中A1、A2、A3、…Ai…、An是肽片段，
C1、C2、C3…Ci-1…Cn-1是带有硫醇官能团的氨基酸残基，
n为3-50，优选3-20，或者更优选3-10，和
i是2至n的任意整数。
该方法包括：
(a1)至少一步涉及制备Y-A1-SEAoff(II1)，其中A1表示其C-末端带有被称为SEAoff的环-二(硫乙基)胺基的肽片段，和
Y是能够与固体载体的官能团反应以在A1和固体载体之间形成键的片段，
(b)至少一步涉及Y-A1-SEAoff(II1)与定义为□-Y'的固体载体的反应，□表示固体载体本身，Y'表示根据如下示意图能够与Y反应生成Z基团的反应性官能团：
(a2)至少一步涉及制备H-C1(PG1)-A2-SEAoff(II2)片段，其中C1、A2和SEAoff定义同上，(PG1)表示H或者氨基酸C1中硫醇基团的保护基，
(c1)至少一步涉及制备式(III1')的硫酯肽，根据如下示意图经过硫醇R-SH的作用，任选地在环状二硫化物还原剂存在下，其中R可为任选取代的烷基或芳基，从二(2-硫乙基)氨基肽□-Z-A1-SEAoff(III1)来制备化学式(III1')的硫酯肽：
(d1)至少一步涉及在芳族硫醇ArSH的存在下、在PG1不为H时被消去的条件下，将(III'1)与肽片段(II2)缩合：
(an-1)至少一步涉及制备Cn-1(PGn-1)-An片段，其中(PGn-1)表示H或氨基酸Cn-1的硫醇基团的保护基，
(dn-1)至少一步涉及在芳族硫醇ArSH存在下，在当PGn-1不为H时被消去的条件下，将Cn-1(PGn-1)-An与□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-2An-1SEAoff(IIIn-1)缩合，从而得到□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-1An(IVn)。
根据本发明的一种具体实施方式，所述方法还包含：
(e)将肽A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-1An(I)从固体载体上分离的步骤。
根据本发明的一种实施方式，所述固体载体□选自树脂，特别是选自基于聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、胶乳、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、合成或天然亲水聚合物、玻璃珠、硅胶的树脂。
根据本发明的一种实施方式，C1、...Ci…Cn是半胱氨酸。
根据本发明的一种实施方式，PG1、...PGi…PGn是叔丁基亚磺酰基。
根据本发明的一种实施方式，
Y'包含选自叠氮的官能团，以及Y选自包含炔官能团的基团，或者
Y'包含炔官能团，以及Y选自包含叠氮官能团的基团，或者
Y'包含醛官能团，以及Y是氢，A1的N-末端氨基酸选自半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸，或者
Y'包含醛官能团，以及Y包含能够形成希夫碱的NH2基团。
根据本发明的一种实施方式，R选自任选取代的包含1-12个碳原子的直链或支链烷基、任选取代的C6-C12芳烷基或芳基。
根据本发明的一种实施方式，对于每个i＝2、…n-2，所述方法包含
(ci)至少一步涉及在硫醇R-SH的作用下，任选地在还原试剂环二硫化物存在下，将□-Z-A1-C1-…Ci-1AiSEAoff(IIIi)转化为□-Z-A1-C1-…Ci-1-Ai-SR(III'i)，
(di)至少一步涉及将Ci(PGi)Ai+1SEAoff与□-Z-A1-C1-…Ci-1Ai-SR(III'i)缩合以生成□-Z-A1-C1-…CiAi+1SEAoff(IIIi+1)，其中(PGi)表示H或氨基酸Ci的硫醇基团的保护基。
根据本发明的一种实施方式，对于每个i＝2、…n-2，所述方法的di)步骤在PGi原位选择性离去而不影响SEAoff并且反应溶剂是包含芳族硫醇的、pH为4-9的缓冲水溶液的条件下进行。
本发明的另一个主题是接枝有肽并对应于下式(III1)的固体载体：
□-Z-A1-SEAoff (III1)
其中A1表示其C-末端带有被称为SEAoff的环-二(硫乙基)胺基的肽片段，□表示固体载体，Z表示A1和□之间的连接基。
该固体载体可用于多肽合成试剂盒中。这样的多肽合成试剂盒通常包含至少一种载体，所述载体提供有至少一个接收区，在其上或在其内配置至少一种接枝的固体载体(III1)。
本发明的另一个主题是用于肽合成的自动化设备，其可以实现本发明合成方法的自动化实施。这样的设备包含至少一个储存库，其中配置接枝了肽并对应于下式(III1)的固体载体：
□-Z-A1-SEAoff (III1)。
该设备也包含独立的储存库，所述储存库包含：
-上述的肽(IIi)Ci(PGi)Ai+1SEAoff，和：
-至少一种硫醇R-SH，和任选的还原剂环二硫化物
-偶联活化剂和
-洗涤产品。
这种自动化设备还包含用于取和分配产品样品的机械工具，以及允许控制应用这些机械工具的数据处理工具。
本发明的另一个主题是接枝有多肽的固体载体，包含n个肽片段和至少n-1个含有硫醇官能团的氨基酸，并对应于下式(IVn)：
□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-1An(IVn)
该固体载体可以用于在多肽和另一种分子之间进行亲和性试验。
为了将这些接枝固体载体用于生物亲和性试验中，通常需要将肽链A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-1An折叠起来，以具有生物学上相关的天然构象。对此，在合成步骤之后在通常半胱氨酸配对以形成二硫桥的条件下，将链折叠。
本发明的另一个主题是生物学检测试剂盒，其包含至少一种载体，所述载体提供有至少一个接收区，在其上或在其内配置至少一种接枝了至少一种多肽的固体载体，该多肽包含n个肽片段和n-1个带有硫醇官能团的氨基酸，并且该固体载体对应于下式(IVn)：
□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-1An(IVn)。
本发明的另一个主题是制备药用产品的方法，其至少包含：
-通过上述定义的方法制备至少一种多肽，以及
-将其结合到药物可接受的载体上。
具体实施方式
现在对本发明进行更详细的描述，但本发明不限于以下的描述。
在本申请的上下文中，“肽或多肽”意指通过肽键连接在一起的氨基酸残基(氨基酸残基数目大于或等于2)的直链。因此，本申请含义内的“肽或多肽”可以是根据这些术语常规接受的意义，例如寡肽、肽或蛋白质。根据本发明的多肽中存在的氨基酸残基可以选自蛋白源或非蛋白源的氨基酸残基。优选地它们选自20种蛋白源的氨基酸残基。
从N-末端至C-末端进行多肽记录。沿着多肽链存在的氨基酸残基根据通用的单字母或三字母密码表示。氨基酸残基是式-NH-(CH-R)-(C＝O)-的多肽片段，其中R表示各氨基酸之间不同的侧链。
在本申请的上下文中，“肽片段”意指包含至少一个氨基酸残基的多肽部分。本申请的含义内，因此肽片段可以是例如：如果肽片段既不包括多肽的N-末端也不包括多肽的C-末端，则为氨基酸残基序列(例如-AHG-或-Ala-His-Gly-)；或者如果肽片段包含多肽的N-末端，则为在其N-末端具有基团的氨基酸残基序列(例如H-AHG-或H-Ala-His-Gly-)；或者如果肽片段包含多肽的C-末端，则为在其C-末端具有基团的氨基酸残基序列(例如-AHG-OH或-Ala-His-Gly-OH)。
应理解每个肽片段优选地仅包含选自20种蛋白源氨基酸残基的氨基酸残基。但是，根据一种具体实施方案，在序列内部位置的肽片段Ai也可以包含一个或更多个非蛋白源氨基酸残基，所述肽片段A2…Ai…An-1中的一个或更多个可带有一个或更多个经修饰的氨基酸，所述修饰在实施本方法之前进行。作为一个非限制性实例，氨基酸的修饰可以特别地选自基团，所述基团选自：羧酸残基(生物素、乙酰基、氨基氧乙酸残基)，荧光团例如四甲基罗丹明，金属螯合剂例如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)，脂质例如棕榈酸，聚合物例如α-甲氧基-ω-羧基聚(乙二醇)或其他基团。它还可选自本领域技术人员已知的蛋白质源氨基酸的翻译后修饰(甲基化、磷酸化、乙酰化、糖基化、硫酸化、羟基化、羧甲基化、带有用于固相嵌入的适当保护基等)或任选的药物(蛋白质则用作媒介物(vector))。
修饰的氨基酸的存在尤其允许为了探测多肽与其他分子(荧光标记物等)的相互作用使得多肽被功能化，但是也可提供其他类型的功能化。
通过使用非蛋白质源氨基酸(具体是蛋白质源氨基酸的衍生物)，可以以简单的方式引入修饰，从而在目的片段的固相合成期间引入该修饰。例如，可以使用Fmoc-L-Lys(生物素)-OH(即其侧链上具有生物素的赖氨酸)，从而进行片段的合成。然后该片段以与使用蛋白质源氨基酸片段相同的方式用于组装中。
多肽的氨基酸残基A1、…Ai、An可以任选地被侧链携带的官能团的保护基暂时或永久性地保护，其性质取决于侧链的反应性官能团，这对于本领域技术人员是已知的。
根据本发明的一种实施方案，肽片段Ai包含2至600个氨基酸残基优选5至100个氨基酸残基，更特别优选8至50个氨基酸残基。
式(II)多肽可以例如通过常规的肽合成方法获得，具体通过固相合成法获得。其也可以通过之前的天然连接反应获得。
双(2-硫乙基)氨基肽的制备：Y-A1-SEAoff(步骤a1)的制备方法可根据“Melnyk,O.等人Bis(2-sulphanylethyl)amino native peptide ligation.,Org.Lett.,12(22),5238-41(2010)”以及FR-2952058描述的方法进行。根据该方法的实施方式，通过将SEA接枝的聚合物树脂载体与氨基酸的卤代物或与氨基酸和活化剂接触，实现C-末端氨基酸与接枝有SEA(2-硫乙基)胺基的聚合物树脂P载体偶联，所述活化剂优选选自(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基膦鎓六氟磷酸盐)、BOP、(溴-三-吡咯烷基-膦鎓六氟磷酸盐)或者HATU(2-(1Η-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,I,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐甲烷铵)，更特别地优选PyBroP和HATU。下文在制备起始肽片段的实施例中更详细地描述该实施方式。然后通过Y基团将A1-SEA-P官能化并且将其与聚合物P分离。
本发明的方法包含将官能化的肽Y-A1-SEAoff(II1)与定义为□-Y'的固体载体的反应，□表示固体载体本身，并且Y'表示能够与Y反应生成Z基团的反应性官能团，如示意图1所示：
示意图1
所述固体载体优选以可溶或不溶的颗粒(珠)形式存在的聚合物。例如可以使用基于聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、胶乳、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺的树脂和由此衍生的树脂。也可以使用硅胶或玻璃珠作为固体载体。
有利地，使用的固体载体选自合成的亲水性聚合物，如树脂PEGA,SPOCC(超渗透性有机组合化学)或者天然的碳水化合物聚合物如琼脂糖或琼脂糖凝胶。
这些树脂接枝Y'基团，Y'包含选自叠氮、炔(优选纯炔或末端炔、环辛炔)的官能团，Y则本身选自炔，优选纯炔或末端炔，以及叠氮。
根据本发明的变体，这些树脂接枝有Y'基团，Y'基团包含醛官能团，Y是H并且A1的N-末端氨基酸选自半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸，或者Y是能够形成希夫碱的NH2基，例如肼羰基H2NNHCO或者更普遍地肼或H2NO的衍生物，即，羟胺衍生物。
更确切地说，本发明优选的实施方式如下：
当Y'包含炔时，Y包含叠氮；
当Y'包含叠氮时，Y包含炔；
当Y'是醛时，Y是H并且A1的N-末端氨基酸选自半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸；或者
当Y'是醛时，Y是能够形成希夫碱的NH2基，例如肼羰基H2NNHCO或者，更普遍地，肼或H2NO的衍生物，即，羟胺衍生物。
所述肽片段和固体载体之间的键，也称之为连接基，借助适当官能团实现。因此，首先借助于对应于待合成的多肽N-末端的氨基酸，将N-末端的肽片段固定在固体载体连接基官能团上(使肽片段的C-末端呈SEAoff形式)，这构成了第一引物，然后根据如下所述的连续反应加入后续的肽片段。
根据第一个变体，接枝了二(2-硫乙基)胺基肽的固体载体：□-Z-A1-SEAoff(III1)可以通过WO2011/058188中描述的方法制备：
所述肽A1-SEAoff与对应于通式X1-L-X2的化合物反应，其中X1表示选自-N3和-C≡CH的基团，并且L表示间隔基，X2表示包含能够与所述肽A1末端NH2反应的官能团的基团，X2和A1之间的键在上述提到的连接反应条件下保持不变并且在肽链不降解的条件下断裂。这样的X2基团详细地描述于WO2011/058188中。
所述肽A1通过其末端酸官能团和SEAoff前体基团负载于固体载体上。将负载的肽A1与化合物X1-L-X2接触导致在肽A1末端NH2基团和X2基团之间生成共价键从而形成化合物X1-L'-A1，其中X1的含义同上并且L'表示由-L-X2与肽A1的N-末端缩合形成的连接臂。所述SEAoff基团仅在所述肽X1-L'-A1离开所述固体载体之后形成。
通常地，L'是包含1-50个碳原子的烷烃双基链，并且一个或多个官能团可选自，但不限于羟基、胺基、酯基、硫酯基、醚基、酰胺基、NO2基、SO2基，卤原子，任选取代的芳基，并且该烷烃双基链任选地被一个或多个基团中断，其选自：醚桥(-O-)、胺基桥(-NH-)、酯基桥(-COO-)、酰胺桥(-CONH-)、脲基桥(-NH-CO-NH-)、脲烷桥(-NH-CO-O-)。
然后，反应性基团X1与带有合适官能团的固体载体反应。这样的固体载体在WO2011/058188中有描述。特别地，当X1表示-C≡CH时，带有如下官能团之一的固体载体可选自：□-N3
□-NH-CO-(CH2)m-N3；
当X1表示N3时，固体载体的官能化基团可以选自例如优选纯炔，存在于或多或少复杂分子中，例如描述于WO2011/058188中的那些分子，例如□-NH-CO-(CH2)m-C≡C-H、环辛炔基团等。
X1与固态载体之间的反应在化学选择性的条件下进行，并且X1和肽A1的氨基酸之间不发生竞争反应。
根据第二个变体，接枝有二(2-硫乙基)胺基肽的固体载体：□-Z-A1-SEAoff(III1)可以通过“M.Villain等人Chemistry and Biology8(2001)673-679”中描述的方法制备。
根据该方法，如下示意图2所示，固体载体上的醛官能团分别与肽A1的N-末端的半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸形成噻唑烷键或恶唑烷键。
在该示意图中，L'表示固体载体和醛官能团之间的间隔基臂，A1'表示与所述肽A1的N-末端半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸形成的肽残基。优选地,L'是包含1-50个碳原子和一或多个官能团的烷烃二基链，所述官能团选自，但不限于：羟基官能团、胺官能团、酯官能团、硫酯官能团、醚官能团、酰胺官能团、NO2官能团、SO2官能团、卤素原子、任选取代的芳基，并且该烷烃二基链任选地被一或多个选自以下的基团中断：醚桥(-O-)、胺基桥(-NH-)、酯基桥(-COO-)、酰胺桥(-CONH-)、脲基桥(-NH-CO-NH-)、脲烷桥(-NH-CO-O-)。
事实上，根据这种变体，通过肽和官能化的固体载体之间的直接反应进行接枝反应。唯一的要求是在所述肽A1的N-末端位置存在半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。或者最终目标肽在N-末端位置包含这些氨基酸中的一个，并且所述方法可以在没有序列修饰的情况下在该肽上进行；否则，有必要将这三个残基中的一个加到目标序列的N-末端位置上。
在所有情况下，在实施转化ci)和缩合di)步骤的条件下，将固体载体和A1连接在一起的所述连接基臂Z必须是稳定的。此外，在所述多肽(I)解离的条件下，其必须能够在不被破坏的情况下裂解。
本发明进一步涉及如下所示的H-Ci-1(PGi-1)-Ai-SEAoff(IIi)(其中i＝2,…n-1)的制备方法，其中Ci-1、Ai和SEAoff的定义同上，并且(PGi-1)表示H或氨基酸Ci-1的硫醇基团的保护基。
式(IIi)的肽在N-末端包含氢原子和残基Ci-1(PGi-1)。残基Ci-1是包含硫醇官能团的氨基酸残基。该硫醇官能团特别是β-胺基硫醇官能团(在这种情况下所述残基Ci-1优选表示半胱氨酸残基)，γ-胺基硫醇官能团(在这种情况下所述残基Ci-1优选表示高半胱氨酸残基)，或硒代半胱氨酸。
贯穿于以下的描述中，根据一种具体的实施方式，Ci-1可以被认为表示半胱氨酸残基(Cys)。
根据本发明的优选变体，Ci-1的硫醇官能团被保护基PGi-1保护。优选地，PGi-1表示保护基(SR')以便在氨基酸Ci-1的硫醇上形成二硫化物残基，并且R'表示C1-C6烷基、特别是SR'表示叔丁基亚磺酰基，或C6-C12芳基亚磺酰基或芳烷基亚磺酰基,例如苯基亚磺酰基或苄基亚磺酰基。
应理解根据本发明的方法或通过肽合成的任何其他方法，每个肽片段Ai可以通过如上所述的连续的操作预先制备。
本发明特别地涉及接枝于固体载体上的并且带有硫酯肽的SEAoff官能团的肽□-Z-A1-C1-A2-…Ci-2-Ai-1-SR(I＝2,…n)(III'i-1)的转化反应ci)以及其与带有呈环二硫化物态的二(2-硫乙基)胺基官能团的肽(或多肽)之间的缩合反应di)，所述肽(或多肽)对应于通式：
其中，Ai表示C-末端带有环二(2-硫乙基)胺基被称为SEAoff的肽片段，并且Ci-1表示带有硫醇官能团的氨基酸残基。
应理解术语SEAoff表示非活性的环二硫化物，与下文中被称为SEAon的反应性二硫化物结构-N[(CH2)2-SH]2相反。该特别的步骤在“Dheur,J.,Ollivier,N.,Vallin,A.andMelnyk,O.Synthesis of Peptide Alkylthioesters Using the Intramolecular N,S-Acyl Shift Properties of Bis(2-sulfanylethyl)amido Peptides.J.Org.Chem.76,3194-3202(2011)”记载用于其它化合物的合成。
该合成步骤基于至少一步ci)：经过硫醇R-SH的作用，任选地在环状二硫化物还原剂存在下，将□-Z-A1-…Ci-1Ai-SEAoff(IIIi)转化为□-Z-A1-…Ci-1-Ai-SR(III'i)(其中I＝2,…n-1)。
应理解当I＝n时，SEAoff转化为SR是不必要的，并且(IIIn-1)与C-末端肽片段-Cn-1(PGn-1)An之间的缩合反应dn)可以直接进行。
在该转化步骤之后是缩合反应di)：在芳族硫醇ArSH的存在下，□-Z-A1-…Ci-1Ai-SR(III'i)与Ci(PGi)-Ai+1-SEAoff(IIi+1)缩合，在此条件下，当PGi不为H时，其被消去以得到□-Z-A1-…Ci-1Ai-CiAi+1-SEAoff(III'i+1)。
当i＝n-1时，与不带有SEA基团的肽–Cn-1(PGn-1)An进行缩合反应步骤，SEAoff转化为SR并不是必需的，但可以进行，当使用自动化设备进行全合成时尤其如此，其余的操作条件与其它缩合反应相同，特别是在芳族硫醇ArSH存在时，在此条件下当PGn-1不为H时被消去。
表示为R的烷基基团是具有1-12个碳原子的直链或支链烷基，或C6-C12的芳基，其任选地被一或多个选自以下的基团取代：卤素原子(例如F)、或CO2H、SO3H、CONH2、OH、SH、烷氧基、烷硫基、巯基烷硫基、酯残基或聚乙二醇残基，或任选地被任选取代的苯基或不干扰所用反应的其他有机基取代。步骤ci)所用的通式R-SH硫醇可以为例如HSCH2CH2CO2H、HSCH2CH2SO3H、HSCH2CH2SH、HSCH2CH2SCH2CH2SH或HSCH2Ph。
根据变体，若所述R-SH硫醇是充分还原性的，则额外的环二硫化物还原剂不是必要的。
步骤di)所用的芳族硫醇优选自含二硫键的还原性化合物，优选苯硫酚和/或通过芳环取代得到的衍生物，例如4-羧基甲硫酚。或者，非芳族硫醇代替所述芳族硫醇，例如二硫苏糖醇、苄硫醇。当然，这些硫醇的混合物也是合适的。
所述步骤ci)所用的还原剂SEAoff选自环二硫化物还原剂。其特别选自膦(例如三(2-羧乙基)膦)，或任何其他的所述环二硫化物还原剂，例如硫醇(例二硫苏糖醇(DTT))。
有利地，在过量的Ci(PGi)-Ai+1-SEAoff或者Cn-1(PGn-1)-An存在的情况下，进行所述缩合反应步骤。
连接反应优选在水溶液中进行，例如pH为4-9的磷酸盐缓冲溶液。优选地，该反应在pH为5-9，有利地pH为5.5-8.5，更优选地pH为5.5-7.5，理想地在pH接近7.0时进行。
所述缩合反应优选在0至50℃的温度下，理想地在大约37℃的温度下进行。该反应的持续时间根据所用的试剂和其它反应条件进行调节。合适的持续时间也可根据反应过程中液相色谱-质谱的分析结果进行调节。合适的持续时间一般为几小时到几天。
有利地，两个缩合反应步骤之间对固体载体进行洗涤，以便除去未反应的余量肽残基，其任选地可以回收或再循环。
任选地，通过所属领域的技术人员所公知的方法将构成多肽的氨基酸侧链进行脱保护反应。根据本发明，多个肽片段的组装方法可如图1的示意图所示。
根据本发明，所述方法制备多个肽的组装体，其通过连接基Z接枝于固体载体□上，所述肽组装体包含带有硫醇官能团的氨基酸残基，即，n个肽片段Ai和至少n-1个带有硫醇官能团的氨基酸Ci的组装体，由下式表示：
□-Z-A1-C1-A2-C2-A3-…-Ci-1-Ai-….-Cn-1-An (IVn)
其中A1、A2、A3、…Ai…、An是肽片段，
C1、C2、C3…Ci-1…Cn-1是带有硫醇官能团的氨基酸残基，
n为3-50，优选3-20，或者更优选3-10，并且
i是2-n的任意整数。
因此，本发明的方法包含n-1步的肽组装步骤。有利地，n-1步的肽组装步骤涉及：在硫醇R-SH作用下，任选地在环二硫化物还原剂存在下，□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-SEAoff转化为□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1-Ai-SR的步骤，然后在芳族硫醇ArSH存在下将□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-SR与Ci(PGi)-Ai+1-SEAoff缩合的步骤，在此条件下，将PGi消去以生成□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-CiAi+1-SEAoff。
然而，不排除在肽(IVn)合成中所用的一步或多步的肽组装可以使用本领域技术人员所公知的另一连接方法进行。
特别是，如上所述，第n-1步是通过SEAoff与Cn-1(PGn-1)-An之间直接反应进行SEA连接。
有利地，制备肽(IVn)的方法的所有步骤按照如下顺序进行：步骤ci)、di)、i＝1、…n-2，任选的cn-1)，然后是dn-1)。
在制备所述多肽中，优选地在多肽离开树脂之前，也可以设定一或多步的化学处理，例如通过本领域技术人员公知的方法进行氨基酸转化，例如高半胱氨酸烷基化为甲硫氨酸或半胱氨酸的脱硫反应或硒代半胱氨酸脱硒为丙氨酸。
优选地，所述方法之后为固体载体与肽(I)之间的键裂解，在此条件下，肽(I)被解离出来：
A1-C1-A2-C2-A3-…-Ci-1-Ai-….-Cn-1-An (I)。
裂解方法根据连接基臂Z的性质而不同。特别是，按照WO2011/058188的教导，根据所述连接基臂Z的性质，可以通过亲核进攻或在碱性或酸性条件或通过紫外光照来裂解间隔基臂Z的X2部分和所述肽(I)之间的共价键以解离出所述肽(I)。
当间隔基臂Z通过来自所述肽A1的丝氨酸或N-末端的苏氨酸的半胱氨酸与固体载体携带的醛官能团缩合得到以形成的噻唑烷或噁唑烷环时，根据“M.Villain et al.,Chemistry and Biology8(2001)673-679”的教导，最终的肽有利地通过O-甲基羟胺处理使其解离。
后者的条件也适用于当形成的键Z是希夫碱的情况。
本发明的另一个主题是接枝有肽的固体载体，对应于下式：
□-Z-A1-SEAoff (III1)
其中，Z、□、A1和SEAoff的含义同上。这样的载体，与第一肽片段A1接枝，可以引发复杂多肽的合成。我们特别地预期可以工业或半工业制备接枝有一般感兴趣的肽A1序列的固体载体，其通常作为生物学感兴趣的肽N-末端序列。例如，我们会列举如下类型的序列：用于蛋白寻址和分泌的信号肽，标记肽(例如荧光标记)，纯化标记例如组氨酸标记，带有泛素化信号的肽等等。
这种与第一个肽(特别是感兴趣的肽)接枝的固体载体可以有利地用于多肽合成的试剂盒。在该试剂盒中，其可以联合包含接收区的载体，例如可以进行连续连接反应的多孔板的孔。其可以联合合成试剂，例如，如上所述的用于进行连接反应的那些试剂。
本发明的另一个主题是用于肽合成的自动化设备，其可以实现本发明合成方法的自动化实施。这样的设备包含至少一个储存库，其中配置接枝了肽并对应于下式(III1)的固体载体：
□-Z-A1-SEAoff (III1)
A1可具体选自上述的感兴趣的肽。
该设备也包含储存库，所述储存库包含：
-上述的肽(IIi)Ci(PGi)Ai+1SEAoff，对于容纳具有不同序列的每个肽提供不同的储存库。
还为以下提供储存库：
-至少一种硫醇R-SH，和任选的环二硫化物还原剂，
-偶联活化剂和
-洗涤产品。
这种自动化的设备还包含用于从不同储存库中取样和在包含固体载体的储存库中分配这些样品的机械工具。所述工具由一组用于循环流体的管和阀组成，任选地排列在微流控回路中，或者排列在配置有样品吸量管的铰链臂中。这种自动化的设备也包含允许控制应用这些机械工具的数据处理工具(软件)，以实现连续反应。
本发明的另一个主题是接枝有多肽的固体载体，包含n个肽片段Ai和至少n-1个带有硫醇官能团的氨基酸Ci，对应于下式(IVn)：
□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-1An(IVn)
其中，Z、□、Ai、Ci、i、n和SEAoff的含义同上。事实上，在连续的连接反应和任选的氨基酸侧链脱保护反应以及肽链折叠结束时，固体载体可以用于进行生物试验，具体是用于合成的多肽对任何分子的亲和性试验。
本发明的另一个主题是包含至少一种载体的检测试剂盒和/或诊断试剂盒，所述载体包含至少一个接收区，在其上配置至少一种接枝了至少一种多肽的固体载体，所述多肽包含n个肽片段和至少n-1个带有硫醇官能团的氨基酸，并且该接枝的固体载体对应于下式(IVn)：
□-Z-A1-C1-A2-…Ci-1Ai-…Cn-1An(IVn)。
因此，所述检测试剂盒可以用于筛选生物活性分子或用于诊断性试验。可以设定所述诊断试剂盒包含几个单独的接收区，在其上放置接枝了相同或不同的多肽的固体载体。例如，接枝有相同或不同多肽的固体载体可以置于多孔板的孔中，以形成检测和/或诊断载体。
优选地，为了实施检测，将接枝到固体载体上的多肽预先与促进二维和/或三维结构形成的介质进行接触。例如，根据“E.C.B.Johnson et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3283-3287”的教导，可将所述多肽与pH为8的磷酸盐缓冲溶液接触并将其接触空气，或者将所述肽与pH＝9的水溶液接触。另一个有用的用于折叠的方法是使用GSH、GSSG的配对(GSH用于谷胱甘肽，GSSG用于氧化型谷胱甘肽)。
所述检测和/或诊断试剂盒可以进一步地包含用于检测所述多肽和被检测分子之间的相互作用的工具。
本发明的另一个主题是制备药用产品的方法，其至少包括：
-通过上述定义的方法制备至少一种多肽，以及
-将其结合到药物可接受的载体上。
事实上，本发明的方法可以应用于合成具有治疗活性的多肽，特别是疫苗。基于本领域技术人员的常识并结合多肽的性质(特别是溶解性)和所选给药方法，本领域技术人员将多肽与药物可接受的载体进行复合。
本发明的其他特点和优点在阅读下列的优选实施方式的描述后会变得更清楚，这些实施方式通过举例以及可参考的附图来说明。
附图说明
图1：根据本发明的肽合成方法的一般示意图。
图2：根据实施例1的所述肽11a，
H-GILKEPVQGA-CHHLEPGG-CHHLEPAG-CILKEPVHGA-NH2的合成方法示意图。
图3：肽4的RP-HPLC色谱图
图4：肽4的MS谱
图5：肽5.1a的RP-HPLC色谱图
图6：肽5.1a的MS谱
图7：肽8.2的RP-HPLC色谱图
图8：肽8.2的MS谱
图9：肽8.3的RP-HPLC色谱图
图10：肽8.3的MS谱
图11：肽11a的RP-HPLC色谱图
图12：肽11a的MS谱
图13：纯化的肽11a的RP-HPLC色谱图
图14：肽16a的RP-HPLC色谱图
图15：肽16a的MS谱
图16：肽19的RP-HPLC色谱图
图17：肽19的MS谱
图18：肽21的RP-HPLC色谱图
图19：肽21的MS谱
图20：肽23.1的RP-HPLC色谱图
图21：肽23.1的MS谱
图22：肽26.1的RP-HPLC色谱图
图23：肽26.1的MS谱
图24：肽29的RP-HPLC色谱图
图25：肽29的MS谱
实验部分
I-肽11的合成：
H-GILKEPVQGA-CHHLEPGG-CHHLEPAG-CILKEPVHGA-NH2
根据图2的示意图，肽11a通过四个肽片段的连续的连接反应制备。
I-A-制备N3-Esoc-GILKEPVQGA-SEAoff(肽4):
N3-Esoc基团描述在文献WO2011/058188中：
图2中定义为X1的肽是GILKEPVQGA。
N3-Esoc-GILKEPVQGA-SEAoff的制备如下示意图3所示。
操作步骤：
-肽基树脂2H-GILK(Boc)E(tBu)PVQ(Trt)GA-SEA-PS的合成
固体载体SEA-PS(其中PS＝聚苯乙烯)记载在专利申请FR-2952058中。
肽基树脂以0.25mmol的量来合成，可根据“Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic Letters2010,12,5238-41”描述的规程进行。合成之后，所述树脂连续地用CH2Cl2(2×2min)和DMF(2×2min)洗涤，待用于下一步。
-片段N3-ESOC-GILKEPVQGA-SEAoff4的合成：
通过WO2011/058188记载的方法合成被活化的臂N3-Esoc-ONp(示意图3)。将混合的碳酸2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙磺酰基]-乙基酯和碳酸4-硝基苯基酯(145mg,0.4mmol,1.5eq)溶于最低量的DMF中，然后直接转移到所述树脂上。然后加入N-甲基吗啉(55μL,0.5mmol,2eq)。该反应混合物在氩气气氛中于环境温度下搅拌12个小时。先后用DMF(2×2min)、CH2Cl2(2×2min)和Et2O(2×2min)洗涤所述树脂，然后真空干燥。
通过TFA/TIS/DMSO/H2O(20mL,92.5/2.5/2.5/2.5％v/v)混合物作用1.5小时，进行最后的侧链脱保护和使肽从树脂上分离。所述肽从冷的乙醚/庚烷(200mL,1:1v/v)混合物中沉淀出来，离心、然后溶于最少量的水中并冻干。
将肽4粗品(30mg,0.02mmol)溶于磷酸钠缓冲液(20mL,0.2M,pH＝7.2)中，然后在N,N,N',N'-四甲基偶氮二甲酰胺(TMAD)(6.8mg,0.04mmol,2eq)存在下氧化20分钟。该反应混合物直接通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(C18Nucleosil柱(d＝1cm,L＝20cm,5μm)，紫外检测(λ＝215nm)，缓冲液A:H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，梯度：缓冲液B(先在5分钟内0增加到20％，然后60min内20％增加到42％，6mL/min))。获得15mg的肽4(产率＝14％)。结果分析如图3所示。
LC-MS分析：
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。
MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪。结果如图4所示。
I-B-肽基树脂P-1-(1,2,3-三唑基)-Esoc-GILKEPVQGA–SEAoff的制备，其中P＝ PEGA800，5.1
P-1-(1,2,3-三唑基)--Esoc-GILKEPVQGA-SEAoff的制备如下示意图4所示。
操作步骤：
根据WO2011/058188所描述的方法，树脂胺基甲基PEGA800(0.4mmol/g)与4-戊炔酸偶联。将得到的炔树脂(2eq)加入到叠氮肽4(10μmol)在100mM、pH＝7.5的HEPES缓冲液和甲醇按照9:1构成的1.67mL混合物中的溶液中。得到的悬浮液通过不断用氩气鼓泡(30分钟)除氧，然后加入氨基胍盐酸盐(1.1mg,1eq)和三(羟丙基)三唑基甲基-胺(THPTA)(260mg,60eq)、五水硫酸铜(75mg,30eq)和抗坏血酸钠(119mg,60eq)，得到的悬浮液在环境温度下通过用氩气鼓泡来搅拌30分钟。然后用大量的水(去离子)、250mM pH4.2的EDTA溶液、水、甲醇、DMF和水先后洗涤肽基树脂5.1。
将少量的肽基树脂用50mM的CAPS溶液处理来控制接枝反应，其中pH使用苏打(2×30min)调节到11.7，然后用TFA酸化到pH＝3。
5.1a的HPLC和MS分析：
HPLC：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.1％v/v)，缓冲液B：CH3CN/TFA(1:0.1％v/v/v)。结果如图5所示。RP-HPLC在C18Nucleosil柱5μm,4.6×250mm)上进行，使用线性梯度：20分钟内缓冲液B从25％增加到45％，流速1mL/min，DAD检测。结果如图6所示。
I-C-将树脂5.1转化为硫酯树脂6.1
在pH＝7.3的0.2M磷酸盐缓冲液中制备300mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液。然后加入3-巯基丙酸(MPA)(10vol％,0.1mL,1.14mmol)。所得溶液的pH调节到4。
将之前的溶液(V＝200μL)加入到在装备玻璃料的注射器中装填的树脂5.1(4.5μmol)中。该反应混合物在T＝37℃下搅拌24小时。所述树脂用在0.1M、pH＝7.2的磷酸钠缓冲液中制备的3-巯基苯基乙酸(MPAA,500mmol/L)溶液洗涤(3x300μL×1min)。
I-D-肽7.1H-C(StBu)HHLEPGG-SEAoff的连接反应。肽基树脂5.2的合成。循环1
该实验在手套箱中进行([O2]<50ppm)。所述肽7.1(9.4mg,0.0068mmol,1.5eq)溶于之前提到的MPAA(270μL500mmol/L,磷酸盐缓冲液pH＝7.2)溶液中，然后转移到肽基树脂6.1上。该反应混合物在37℃下搅拌24小时。反应后，排去树脂的水并用缓冲液A(H2O/TFA)(1/0.05％v/v,3×300μL×2min)对其洗涤。
LC-MS分析：8.2的RP-HPLC色谱分析。如图7：8.2的最大峰表示产物8.2以二聚体(二硫化物)的形式被分离。该二聚体在碱性介质中产物裂解期间通过空气氧化形成。
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪。如图8：最大峰表示产物8.2以二聚体(二硫化物)的形式被分离。
I-E-肽基树脂5.2转化为树脂6.2
使用上述5.1转化为6.1的规程，将肽基树脂5.2转化为树脂6.2MPA的硫酯
I-F-肽基树脂5.3的合成。循环2
采用与肽基树脂5.2的完全相同的合成规程(循环1)，将肽7.2(X＝Ala,9.5mg,0.0068mmol,1.5eq)与肽基树脂6.2反应。
LC-MS分析：8.3的RP-HPLC色谱图，如图9所示。
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪。如图10所示。
I-G-肽H-CILKEPVHGA-NH2(肽9)的合成
该肽的合成描述于“Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic Letters2010,12,5238-41”中。
I-H-肽11a的合成
该反应在手套箱中于氮气气氛下进行([O2]<50ppm)。在0.2M、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中配制300mmol/L的TCEP溶液。然后加入3-巯基苯基乙酸(MPAA84mg,0.5mmol)。所得的TCEP/MPAA溶液的pH调节到6.5。
肽9(4.6mg,0.0068mmol,1.5eq)溶于之前的TCEP/MPAA(110μL)溶液中，然后转移到肽基树脂5.3上。所述反应介质在37℃下搅拌24小时。在连接反应之后，将肽基树脂10的水除去，然后用缓冲液A(H2O/TFA(1/0.05％v/v)(3×300μL×2min)洗涤。所述肽基树脂11的裂解反应在手套箱中进行([O2]<50ppm)。所述肽基树脂11的裂解反应通过加入NaOH(500μL,10-2M)溶液并在37℃搅拌15分钟的条件下进行。将珠过滤掉，洗涤并将滤液冻干。
肽11a直接通过反相高效液相色谱进行纯化(RP-HPLC)(C18Nucleosil柱(d＝1cm,L＝20cm,5μm)，紫外检测(215nm)，缓冲液A:H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，梯度：缓冲液B(先在5分钟内从0增加到20％，然后60min内从20％增加到42％，6mL/min))。获得4.2mg的肽11(产率＝21％)。
LC-MS分析。肽11a的RP-HPLC色谱图，该色谱图如图11所示。
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪。质谱图如图12所示。
纯化的肽11a在RP-HPL进行色谱分析。该色谱图如图13所示。
II-肽H-CHHLEPGG-CILKEPVHGA-NH216a的合成
II-A-树脂12的合成：Pal-ChemMatrix5-胺基-5-氧代戊酸
如下示意图5所示：
示意图5
步骤：将戊二酸酐(129mg,1mmol,10eq)溶于最少量的DMF中，然后直接转移到Pal-ChemMatrix树脂(263mg,0.1mmol,δ＝0.43mmol/g,1eq)上。加入N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)(197μL,1mmol,10eq)。反应介质在氩气气氛并于环境温度下搅拌1.5小时。所述树脂先后用DMF(2×2min)和CH2Cl2(2×2min)进行洗涤，然后除去溶剂。通过TNBS实验以证实不存在游离胺。
II-B-树脂13的合成：PAL-ChemMatrix N-(3-胺基-2羟丙基)酰胺
根据如下示意图6进行该合成。
操作步骤：1,3-二氨基-2-丙醇(99mg,1mmol,10eq)和苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基膦鎓六氟磷酸盐(PyBOP)(114mg,0.2mmol,2eq)溶于最少量的DMF中，然后直接转移到树脂12上。加入DIEA(191μL,1mmol,10eq)。该反应混合物在氩气气氛并于环境温度下搅拌2小时。所述树脂13先后用DMF(2x2min)和CH2Cl2(2×2min)进行洗涤，然后除去溶剂。通过TNBS实验以证实存在游离胺。
II-C-噻唑烷肽基树脂15的合成
根据如下示意图7进行该合成：
示意图7
操作步骤：将氧化试剂高碘酸钠(NaIO4)(1.2mg,5.7μmol,4eq)溶于最少量的0.1M的pH＝7.2磷酸盐缓冲溶液中，然后转移到树脂13(7.2mg,2.9μmol,2eq)上。反应介质在环境温度下搅拌15分钟。然后向所述树脂中加入乙醇胺(1.4μL,22.9μmol,16eq)来中和过量的氧化试剂。搅拌后，树脂14用0.1M的pH＝6磷酸盐缓冲液洗涤。
在手套箱中进行([O2]<50ppm)操作。肽7.1(2mg,1.4μmol,1eq)溶于V＝72μL的500mmol/L MPAA溶液中，该溶液是在0.1M的pH＝6磷酸盐缓冲液中配制的。所述肽溶液转移到之前提到的树脂14上。该反应混合物在37℃下搅拌24小时。通过V＝200μL的甲基羟胺溶液(在pH＝4.5的醋酸铵溶液中配制的14mmol/L溶液)中和过量的醛。搅拌后，排去树脂15的溶剂，然后用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(3*300mL×2min)洗涤。
II-D-肽9H-CILKEPVHGA-NH2的连接反应。肽基树脂16的合成：
根据如下示意图8进行该合成。
示意图8
操作步骤：在手套箱中进行([O2]<50ppm)操作。在0.2M的pH＝7.2磷酸盐缓冲液中配制300mmol/L的TCEP溶液。然后加入3-巯基苄基乙酸(MPAA)(84mg,0.5mmol)。将得到的TCEP/MPAA溶液的pH调节到pH＝6.5。
肽9(3mg,2.1μmol,1.5eq)溶于V＝70μL的之前的TCEP/MPAA溶液中，然后转移到肽基树脂15上。反应介质在T＝37℃搅拌24小时。连接反应后，排去树脂16的溶剂，然后用缓冲液A：(H2O/TFA)(1/0.05％v/v,3×300μL×2min)洗涤。
II-E-肽基树脂16的裂解反应，肽H-CHHLEPGG-CILKEPVHGA-NH216a的合成。
根据如下示意图进行该合成：
操作步骤：在手套箱中进行([O2]<50ppm)操作。通过加入V＝500μL的甲基羟胺溶液(在pH＝3的磷酸盐溶液中配制的300mmol/L溶液)并在37℃下搅拌3小时将肽基树脂16进行裂解。过滤珠，并将其洗涤，冻干滤液。
LC-MS分析：肽16a H-CHHLEPGG-CILKEPVHGA-NH2的RP-HPLC色谱图
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度A/B：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪。如图14所示的获得的RP-HPLC谱：标记为RsMPAA峰表示MPAA残留物。所述质谱图如图15所示。
III-肽H-AAAAAKDYIRN-CIIGKGRSYKGTVSITKSGIK- CQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENY-CRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVK(生物素)-NH229 的合成
III-A-片段N3-ESOC-AAAAAKDYIRN-SEAoff19的合成
根据如下示意图进行该合成：
-肽基树脂17H-AAAAAK(Boc)D(OtBu)Y(tBu)IR(Pbf)N(Trt)-SEA-PS
(PS＝聚苯乙烯)的合成
该肽基树脂以0.25mmol的量来合成，可根据“Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic Letters2010,12,5238-41”描述的规程进行。
合成之后，所述树脂先后用CH2Cl2(2×2min)和DMF(2×2min)洗涤，待用于下一步。
-片段N3-ESOC-AAAAAKDYIRN-SEAoff19的合成
通过WO2011/058188记载的方法合成被活化的臂N3-Esoc-ONp。将混合的碳酸2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙磺酰基]-乙基酯和碳酸4-硝基苯基酯(145mg,0.4mmol,1.5eq)溶于最低量的DMF中，然后直接转移到所述树脂17上。加入N-甲基吗啉(55μL,0.5mmol,2eq)。该反应混合物在氩气气氛中于环境温度下搅拌12个小时。先后用DMF(2×2min)、CH2Cl2(2×2min)和Et2O(2×2min)洗涤树脂18，然后真空干燥。
通过TFA/TIS/DMSO/H2O(20mL,92.5/2.5/2.5/2.5％v/v)混合物作用1.5小时，进行最后的侧链脱保护和使肽从所述树脂上分离。所述肽从冷的乙醚/庚烷(200mL,1:1v/v)混合物中沉淀出来，离心、然后溶于最少量的水中并冻干。
将肽19粗品(100mg,0.05mmol)溶于磷酸钠缓冲液(26mL,0.2M,pH＝7.2)中，然后在N,N,N',N'-四甲基偶氮二甲酰胺(TMAD)(18.4mg,0.1mmol,2eq)的存在下氧化20分钟。该反应混合物直接通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(C18Nucleosil柱(d＝1cm,L＝20cm,5μm)，紫外检测(λ＝215nm)，缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，梯度：缓冲液B(先在5分钟内从0增加到20％，然后60min内从20％增加到42％，6mL/min))。获得23mg的肽19(产率＝23％)。
LC-MS分析：19的RP-HPLC色谱图
LC-MS:缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪。
获得的RP-HPLC谱如图16所示。所述质谱如图17所示。
III-B-肽29的合成
根据如下示意图进行该合成：
将肽19接枝到环辛炔固体载体上。载体20的制备：
根据“Dommerholt,J.et al.,Angewandte Chem.,Int.Ed.2010,49,9422-9425”中描述的方法，制备混合的碳酸二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯和碳酸4-硝基苯酯(176mg,0.56μmol,3eq)，然后将其溶于最少量的DMF中，然后直接转移到胺基甲基PEGA1900树脂(0.4mmol/g)上。加入N,N-二异丙基乙基胺(370μL,3.36mmol,6eq)。该反应介质在氩气气氛下于环境温度下搅拌16小时。先后用DMF(2×2min)、CH2Cl2(2×2min)、20％的哌啶DMF溶液，然后用MeOH/DMF/AcOH混合物(9:9:2)(5×2min)以及甲醇(2×2min)洗涤所述树脂。
将得到的炔烃树脂(2eq)加入到叠氮基肽19在由水(去离子水)和含0.1％TFA的乙腈以8:2构成的2.4ml混合物中的溶液中。该悬浮液在环境温度下搅拌80小时。然后先后用大量的：含0.1％TFA的乙腈，含0.1％TFA的水，水，甲醇，DMF，甲醇以及最后的水洗涤肽基树脂20。
-肽基树脂20的表征。在20％的哌啶DMF、MeOH/DMF/AcOH(9:9:2)、DMF、MeOH和最后的水中进行肽的分离和肽21的形成(H-AAAAAKDYIRN-SEAoff21)
HPLC分析：21的RP-HPLC色谱图
缓冲液A：H2O/TFA(1:0.1％v/v)，缓冲液B：CH3CN/TFA(1:0.1％v/v/v)。RP-HPLC在C18Nucleosil柱5μm,4.6×250mm)上进行，使用线性梯度，20分钟内缓冲液B从25％增加到45％，流速1mL/min，DAD检测。
获得的RP-HPLC谱如图18所示。产物21的质谱图如图19所示。
-肽22H-C(StBu)IIGKGRSYKGTVSITKSGIK-SEAoff的合成
该肽以0.25mmol的量来合成，可根据“Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic Letters2010,12,5238-41”描述的规程进行。
-肽25H-C(StBu)QPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENY-SEAoff的合成
该肽以0.25mmol的量来合成，可根据“Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic Letters2010,12,5238-41”描述的规程进行。
-肽27H-CRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVK(生物素)-NH2的合成
该肽以0.25mmol的量来合成，可根据“Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic Letters2010,12,5238-41”描述的规程进行。
树脂20转化为硫酯树脂21
在含胍(6M)的0.2M、pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中配制200mmol/L的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液。然后加入3-巯基丙酸(MPA)(5vol％,0.05mL,0.58mmol)溶液。将获得的溶液的pH值调节到4。
将之前的溶液(V＝150μL)加入到在装备玻璃料的注射器中装填的树脂20中。该反应混合物在T＝37℃搅拌24小时。用在含胍(6M)的0.1M、pH＝7.2的磷酸钠缓冲液中配制的3-巯基苯基乙酸溶液(MPAA,300mmol/L)洗涤所述树脂(3×150μL×1min)。
-肽22H-C(StBu)IIGKGRSYKGTVSITKSGIK-SEAoff的连接反应。肽基树脂23的合成
该实验在手套箱中进行([O2]<50ppm)。肽22(2.3mg,0.75μmol,1.5eq)溶于之前提到的MPAA(150μL，300mmol/L，含有胍(6M)的0.1M、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液)溶液中，然后转移到肽基树脂21上。该反应介质在37℃下搅拌24小时。反应后，排去树脂的溶剂并用含有胍(6M)的0.2M、pH＝7.2的磷酸钠缓冲液对其洗涤(3×150μL×2min)。
LC-MS分析：从肽基树脂23出发在碱性介质中分离肽之后得到的23.1的RP-HPLC色谱图(如图20)。
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪(图21)。
采用如上使用的将20转化为21的规程将肽基树脂23转化为MPA的硫酯树脂24。
-肽25H-C(StBu)QPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENY-SEAoff的连接反应。肽基树脂26的合成
采用与肽基树脂23(循环1)完全相同的合成规程，将肽25(3mg,0.75μmol,1.5eq)与肽基树脂24反应。
LC-MS分析：从肽基树脂26出发在碱性介质中分离肽后得到的肽26.1的RP-HPLC色谱图(如图22)。
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪(图23)。
-肽29的合成
该反应于氮气气氛下在手套箱中进行([O2]<50ppm)。在含胍(6M)的pH＝7.2的0.2M磷酸盐缓冲溶液中配制200mmol/L的TCEP溶液。然后加入3-巯基苯基乙酸(MPAA33mg,0.2mmol)。将获得的TCEP/MPAA溶液的pH值调节到6.5。
将肽27(3.4mg,0.75μmol,1.5eq)溶于之前的TCEP/MPAA(150μL)溶液中，然后转移到肽基树脂26上。该反应介质在37℃下搅拌24小时。连接反应后，排去肽基树脂28的溶剂，然后用含胍(6M)的pH＝7.2的0.2M磷酸钠缓冲溶液洗涤。
-肽基树脂28的裂解反应，肽29的合成
在手套箱([O2]<50ppm)进行操作。通过加入NaOH(500μL,10-2M)溶液，在37℃下搅拌5分钟，将肽基树脂28进行裂解。过滤珠，洗涤并将滤液冻干。
LC-MS分析
肽29的RP-HPLC色谱图(图24)。
LC-MS：缓冲液A：H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B：CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)。RP-HPLC在C18Xbridge BEH柱3.5μm,4.6×150mm)上进行，使用线性梯度：30分钟内缓冲液B从0增加到100％，流速1mL/min，ELS检测。MS：电喷雾正离子模式，锥孔电压30V，四级杆分析仪(图25)。
当然，本发明并不限于所描述和展现的实施例和实施方式，在本领域技术人员的技术范围内可以进行大量的改变。

Claims (21)

1.肽片段组装方法，其用于制备包含n个肽片段和至少n-1个带有硫醇官能团的氨基酸的多肽，所述多肽以下式表示：
A1-C1-A2-C2-A3-...-Ci-1-Ai-....-Cn-1-An (I)
其中A1、A2、A3、...Ai...、An是肽片段，
C1、C2、C3...Ci-1...Cn-1是带有硫醇官能团的氨基酸残基，
n为3-50，和
i为2至n的任何整数，所述方法包括：
(a)至少一步涉及制备Y-A1-SEAoff(II1)片段，其中A1表示其C-末端带有被称为SEAoff的环-二(硫乙基)胺基的肽片段，和
Y是能够与固体载体的官能团反应以在A1和固体载体之间形成键的片段，
(b)至少一步涉及Y-A1-SEAoff(II1)与定义为□-Y'的固体载体的反应，□表示固体载体本身，Y'表示根据如下式能够与Y反应生成Z基团的反应性官能团：
其中：
Y'包含选自叠氮的官能团，以及Y选自包含炔官能团的基团，或者
Y'包含炔官能团，以及Y选自包含叠氮官能团的基团，或者
Y'包含醛官能团，以及Y是氢，A1的N-末端氨基酸选自半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸，或者
Y'包含醛官能团，以及Y包含能够形成希夫碱的NH2基团，
(c)至少一步涉及制备H-C1(PG1)-A2-SEAoff(II2)片段，其中C1、A2和SEAoff定义同上，(PG1)表示H或者氨基酸C1中硫醇基团的保护基，
(d)至少一步涉及制备式(III1')的硫酯肽，根据如下式通过硫醇R-SH的作用，任选地在环状二硫化物还原剂存在下，其中R为烷基或芳基，从二(2-硫乙基)氨基肽□-Z-A1-SEAoff(III1)来制备化学式(III1')的硫酯肽：
(e)至少一步涉及在芳族硫醇ArSH的存在下、在PG1不为H时被消去的条件下，将(III'1)与肽片段(II2)缩合：
(f)至少一步涉及制备Cn-1(PGn-1)-An片段，其中(PGn-1)表示H或氨基酸Cn-1的硫醇基团的保护基，
(g)至少一步涉及在芳族硫醇ArSH存在下，在当PGn-1不为H时被消去的条件下，将Cn-1(PGn-1)-An与□-Z-A1-C1-A2-...Ci-1Ai-...Cn-2An-1SEAoff(IIIn-1)缩合，从而得到□-Z-A1-C1-A2-...Ci-1Ai-...Cn-1An(IVn)。
2.根据权利要求1的方法，进一步包含：
(h)将肽A1-C1-A2-...Ci-1Ai-...Cn-1An(I)从固体载体上分离的步骤。
3.根据权利要求1的方法，其中所述固体载体□选自基于聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、胶乳、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、合成或天然亲水聚合物、玻璃珠、硅胶的树脂。
4.根据权利要求2的方法，其中所述固体载体□选自基于聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、胶乳、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、合成或天然亲水聚合物、玻璃珠、硅胶的树脂。
5.根据权利要求1的方法，其中C1、...Ci...Cn是半胱氨酸。
6.根据权利要求1的方法，其中PG1、...PGi...PGn是叔丁基亚磺酰基。
7.根据权利要求1的方法，其中R选自包含1-12个碳原子的直链或支链烷基，或者C6-C12芳基。
8.根据权利要求1的方法，其中对于每个i＝2、...n-2，所述方法包含
(i)至少一步涉及在硫醇R-SH的作用下，任选地在还原试剂环二硫化物存在下，将□-Z-A1-C1-...Ci-1AiSEAoff(IIIi)转化为□-Z-A1-C1-...Ci-1-Ai-SR(III'i)，
(j)至少一步涉及将Ci(PGi)Ai+1SEAoff与□-Z-A1-C1-...Ci-1Ai-SR(III'i)缩合以生成□-Z-A1-C1-...CiAi+1SEAoff(IIIi+1)，其中(PGi)表示H或氨基酸Ci的硫醇基团的保护基,
其中步骤(i)和(j)在步骤(g)之前进行。
9.根据权利要求8方法，其中，对于每个i＝2、...n-2，所述方法的(i)步骤在PGi原位选择性离去而不影响SEAoff并且反应溶剂是包含芳族硫醇的、pH为4-9的缓冲水溶液的条件下进行。
10.制备药用产品的方法，至少包含：
-通过权利要求1-9任一项的方法制备至少一种多肽，以及
-将其结合到药物可接受的载体上。
11.接枝有肽并对应于下式(III1)的固体载体：
□-Z-A1-SEAoff (III1)
其中A1表示其C-末端带有被称为SEAoff的环-二(硫乙基)胺基的肽片段，□表示固体载体，Z表示A1和□之间的连接基。
12.包含至少一种载体的多肽合成试剂盒，所述载体提供有至少一个接收区，在其上或在其内配置至少一种根据权利要求11所述的接枝的固体载体。
13.接枝有多肽的固体载体，包含n个肽片段和至少n-1个含有硫醇官能团的氨基酸，并对应于下式(IVn)：
□-Z-A1-C1-A2-...Ci-1Ai-...Cn-1An(IVn)
其中A1、A2、A3、...Ai...、An是肽片段，
C1、C2、C3...Ci-1...Cn-1是带有硫醇官能团的氨基酸残基，
n为3-50，
i为2和n之间的任意整数，
□表示固体载体，和
Z表示A1和□之间的连接基，
其中所述固体载体能够通过包括根据权利要求1的方法的步骤(a)至(g)的过程获得。
14.包含至少一种载体的生物学检测试剂盒，所述载体提供有至少一个接收区，在其上或在其内配置至少一种根据权利要求13所述的接枝的固体载体。
15.根据权利要求1的方法，其中n为3-10。
16.根据权利要求1的方法，其中肽片段Ai包含8至50个氨基酸残基。
17.根据权利要求8的方法，其中在过量的Ci(PGi)-Ai+1-SEAoff或者Cn-1(PGn-1)-An存在的情况下，进行所述缩合反应步骤(i)。
18.根据权利要求9的方法，其中步骤(i)所用的芳族硫醇选自含二硫键的还原性化合物。
19.根据权利要求9的方法，其中缩合反应步骤(i)在37℃的温度下进行。
20.根据权利要求1-4或权利要求6-9中任一项的方法，其中在两个缩合反应步骤之间对所述固体载体进行洗涤。
21.根据权利要求5的方法，其中在两个缩合反应步骤之间对所述固体载体进行洗涤。
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