KR20240038025A - 액체 상 합성을 위한 화합물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 하기 화학식 1의 친수성 링커 화합물을 포함하고: 액체 상 합성에서의 그의 사용 방법을 기재한다. 화학식 1에서, "m"은 0 내지 20이고, "n"은 1 내지 50이고, "Z"는 본원에 기재된 바와 같은 링커 화합물이다.
Description
본 출원은 ST.26 XML 포맷의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2022년 8월 22일에 생성된 "X22492 서열 목록"이라는 제목의 파일로서 제공되며, 크기는 92 킬로바이트이다. ST.26 XML 포맷의 서열 목록 정보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
폴리펩티드 및 아미노산 서열의 화학적 합성은 아미노산이 순차적으로 서로 커플링되는 반복 과정에 의해 달성된다. 상기 과정은 성장하는 펩티드 쇄의 C- 또는 N-말단을 탈보호하고, 그에 대해 보호된 아미노산을 커플링시키고, 이어서 새로 커플링된 아미노산을 탈보호하여 순차적으로 다음 커플링을 위해 준비하는 반복 과정을 수반한다. 아미노산 커플링 및 탈보호 단계가 거듭하여 반복되는 이러한 반복 과정은 화학적 합성에서 주요 도전과제 - 즉, 다른 반응 성분 (용매, 미반응 출발 물질 및 시약, 및 바람직하지 않은 반응 부산물)으로부터 합성 생성물을 분리하는 도전과제를 증폭시킨다.
고체 상 펩티드 합성 ("SPPS")은 폴리펩티드 및 아미노산 서열을 합성하는 데 가장 통상적으로 사용되는 방법 및 시스템이다. SPPS는 활성화된 아미노산을 고체 지지체에 커플링시키는 것을 수반한다. 이 고체 지지체는 통상적으로 관능화된 (예컨대, NH2 기로) 중합체 수지 비드이다. 다음 아미노산 (일반적으로 Fmoc, BOC 또는 다른 보호기를 통해 보호된 그의 NH2 말단을 가짐)은 수지 상의 관능화된 기가 말단 아미노산의 활성화된 COOH 기와 반응하고 그에 결합하도록 수지와 반응한다. 이러한 방식으로, 말단 아미노산이 수지에 공유 부착된다.
이어서, 후속 단계에서, 말단 아미노산의 NH2 말단을 탈보호하여, 후속 반응을 위해 그의 NH2 기를 노출시킨다. 따라서, 새로운 아미노산이 도입된다. 이 새로운 아미노산은 보호기 (예컨대 Fmoc, BOC 또는 또 다른 보호기)를 통해 보호된 그의 NH2 말단을 갖는다. 따라서, 이러한 새로운 아미노산이 첨가될 때, 새로운 아미노산으로부터의 활성화된 에스테르는 말단 아미노산의 새로이 탈보호된 NH2 기와 반응하여, 이들 2개의 아미노산을 함께 커플링시킨다. 일단 이러한 새로운 아미노산이 커플링되면, 이는 마찬가지로 보호된 NH2 기를 가지며, 이는 후속적으로 탈보호되고 다음 아미노산과 반응할 수 있다. 이러한 반복적, 반복 과정을 거듭하여 진행함으로써, 전체 아미노산 서열이 구축될 수 있다. 일단 전체 서열이 구축되면, 서열은 수지로부터 언커플링 (절단)되고 탈보호되어 아미노산 서열을 생성할 수 있다. 이러한 공정을 통해 첨가되는 다양한 아미노산의 측쇄 (R1, R2 등)를 BOC, t-부틸 또는 트리틸 등과 같은 기를 통해 직교 보호하여 이러한 측쇄가 아미노산 합성 공정 동안 반응하는 것을 방지할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 합성 공정 동안 이러한 측쇄 또는 다른 기를 어떻게 구축하고, 보호하고, 후속적으로 탈보호할 수 있는지를 인지할 것이다.
SPPS 공정의 각각의 단계에서, 성장하는 폴리펩티드는 고체 지지체에 부착되어 남아있고, 이는 상 분리에 의해 다른 반응 성분으로부터 분리되어 남아있다. 고체 지지체는 고체 지지체에 부착된 동안 목적 생성물의 여과에 의한 분리를 가능하게 함으로써 분리를 용이하게 한다. SPPS는 상업적으로 사용되고, 펩티드 합성에서 여전히 표준이다. 그러나, 이는 비싸고, 시간 소모적이며, 요구되는 광범위한 수지 세척으로 인해 높은 수준의 공정 폐기물을 생성한다는 단점을 갖는다. 첨가되는 각각의 아미노산은 탈보호되고 커플링되어야 하며, 이는 어렵고 통상적으로 대량의 용매가 사용되게 한다. 수지로부터 잔류 시약을 제거하기 위해 각각의 반응 후에 다중 용매 세척이 종종 요구된다. 제조 시설에서의 사이클 시간은 1일당 대략 1개의 아미노산 커플링 및 탈보호 사이클일 수 있다. 이러한 용매들 중 다수가 환경 친화적이지 않다는 점이 더 나쁜 문제이다. 또한, SPPS에서의 상 분리는 높은 생성물 순도를 수득하는 데 어려움을 나타낸다. 성장하는 폴리펩티드가 다른 반응 성분과 동일한 상에 있지 않기 때문에, 반응 속도는 액체 상에서보다 더 느리고, 바람직하지 않은 부반응, 예컨대 응집을 최소화하면서 목적 생성물로의 전환을 최대화하는 것은 어려울 수 있다. 불균질 반응 혼합물의 반응 모니터링 및 최적화는, 특히 분석물이 균질 액체 스트림에 용해되는 것을 필요로 하는 분석 방법, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 사용하는 경우에 어려울 수 있다.
SPPS와 대조적으로, 액체 상 펩티드 합성 ("LPPS")은 폴리펩티드가 균질 반응 조건에서 제조되는 방법을 지칭한다. 이는 가용성 중합체 지지체 모이어티를 수반하는 합성 방법을 포함할 수 있으며, 그 위에서 폴리펩티드는 SPPS에 사용된 것과 유사한 반복 탈보호 및 커플링 공정으로 제조될 수 있다. 탈보호 및 커플링 반응이 균질한 용액 상에서 일어나게 함으로써, LPPS는 SPPS에 수반된 어려움 중 일부를 극복할 수 있다. 일반적으로, LPPS는 보다 적은 용매, 출발 물질 및 시약을 요구함으로써 SPPS보다 보다 물질적으로 효율적일 수 있다. 또한, 액체-상 반응 속도는 상 경계에서 발생하는 반응에 비해 더 빠를 수 있다. 이는 반응 최적화 노력을 용이하게 할 수 있으며, 예를 들어 성장하는 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 라세미화를 최소화하기 위해 보다 적은 시간 내에 또는 보다 온화한 반응 조건 하에 탈보호 단계가 일어나게 한다. LPPS는 또한 예를 들어 질량 분광측정법 ("LCMS")과 결합된 HPLC에 의해 직접적인 반응 모니터링을 가능하게 하며, 여기서 가용성 중합체 지지체에 부착된 생성물은 유사한 SPPS 공정에서보다 보다 간단하게 검출 및 정량화될 수 있다.
SPPS에 비한 LPPS에서의 이점에도 불구하고, LPPS 전략을 성공적으로 구현하는 것은 어려울 수 있다. 목적 생성물을 단리하고 이를 다른 반응 성분 및 바람직하지 않은 부산물로부터 효율적으로 분리하는 문제가 남아있다. 이를 위해, 액체-상 반응 혼합물로부터 폴리펩티드 생성물의 분리를 가능하게 하는 다수의 전략이 사용되어 왔다. 소수성 가용성 링커 시스템은 태그-보조 LPPS 지지체로서 개발되었다 (예를 들어, 문헌 [Takahashi, D.; et al. (2017) Angewandte Chemie International Edition 129:7911-7915] 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2018/0215782 참조). 이들 링커 시스템을 사용하여, 펩티드를 링커 상에서 연장시킬 수 있고, 이어서 부산물을 침전 또는 추출 수성 후처리에 의해 제거한다. 그러나, 펩티드 쇄가 연장됨에 따라 용해도 문제가 주요 문제가 되는 펩티드의 길이와 같은 일부 핵심 한계가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 수성 세척은 시약 및 부산물을 제거하는 데 제한된 효능을 가질 수 있기 때문에 순도 문제가 있을 수 있다. 이들 성분은 하류 합성 단계를 방해하고, 불리한 부가 및 결실을 초래할 수 있다. 또한, 유기 층 내의 높은 잔류수는 펩티드 커플링에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 이는 탈수 단계의 추가를 필요로 할 수 있다.
친수성 링커 시스템은 소수성 링커 시스템에 비해 중요한 이점을 제공할 수 있다. 이들 시스템에서, 링커는 친수성 "태그"를 특색으로 하며, 이는 반응 부산물이 보다 환경 친화적인 유기 용매로의 간단한 추출에 의해 제거될 수 있게 한다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 액체-상 펩티드 합성을 위한 친수성 지지체로서 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Fischer, P.M.; Zheleva, D.I. (2002) Journal of Peptide Science 8:529-542] 참조). 그러나, 이들 적용에 사용되는 PEG 유도체는 종종 다분산성이고, 고정된 분자량이 없다. 가변적인 PEG 쇄 길이는 고분자량 PEG 접합 생성물의 분석 및 정제에서 복잡성을 생성할 수 있다. 따라서, LPPS에 대해 고정된 분자량을 갖는 새로운 친수성 링커 시스템을 발견하는 것은 개선이 될 것이며, 이는 특히 펩티드의 상업적 제조에서 이들 결점을 해결할 것이다. 이러한 시스템이 긴 펩티드 (15-mer 이상)에 대한 액체 상 펩티드 합성 방법을 가능하게 할 수 있다면 추가의 진보가 될 것이다. 실제로, 본 실시양태는 구체적으로 태그-보조 LPPS를 위한 친수성 링커 시스템 및 상업적 규모의 펩티드의 합성을 위한 그의 사용 방법을 제공할 것이다. 이러한 방법 및 시스템은 본원에 개시된다.
본 발명의 실시양태는 액체 상 유기 합성, 예컨대 LPPS를 위한 친수성 링커 구축물로서 유용한 고정된 분자량의 화합물을 제공한다. 본 개시내용의 화합물은 링커에 부착된 반복되는 이종이관능성 PEG-유사 단위를 특색으로 하며, 그 위에 폴리펩티드 또는 다른 분자가 커플링 (예를 들어, 아미노산 커플링) 및 탈보호 단계를 통해 구축될 수 있다. 특히, 본 개시내용의 화합물은 반복되는 합성 단계, 예를 들어 아미노산 커플링 및 탈보호 단계를 통해 폴리펩티드 또는 다른 분자를 구축하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 화학식 1의 친수성 링커 화합물을 포함한다:
여기서 "m"은 0 내지 20이고, "n"은 1 내지 50이고, "Z"는 링커 기이다. "Z"는 임의로 보호된 화합물, 예컨대 아미노산에 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기이며, 이는 다시 하나 이상의 임의로 보호된 화합물, 예컨대 아미노산 또는 펩티드에 대한 반복 탈보호 및 커플링 단계를 겪을 수 있고, 이어서 생성된 생성물, 예컨대 폴리펩티드 생성물은 화학적 변환을 통해 "Z" 기로부터 유리될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태는 "m"이 0, 1, 2, 또는 3이고 "n"이 1 내지 50인 화학식 1의 화합물을 포함한다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태는 "m"이 0, 1, 2, 또는 3이고 "n"이 1 내지 10인 화학식 1의 화합물을 포함한다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태는 "m"이 1이고 "n"이 2 내지 10인 화학식 1의 화합물을 포함한다.
본 개시내용의 추가 실시양태는 "Z"가 하기로부터 선택된 것인 화학식 1의 화합물을 포함하고:
본 개시내용의 친수성 링커는 펩티드 및 다른 화합물의 합성에 유용하고, 여기서 화합물의 활성화된 에스테르, 예컨대 아미노산 또는 펩티드 단편은 먼저 화학식 1의 링커의 유리 알콜 -OH 또는 아민 -NH2 상에 커플링된다. 그 후, 화합물, 예를 들어 펩티드는 중간 탈보호 후에 연속적으로 개별 분자 성분, 예컨대 아미노산 또는 펩티드 단편의 활성화된 에스테르를 커플링시킴으로써 성장된다. 완성된 화합물, 예를 들어 펩티드는 산성 조건에서 링커로부터 절단된다.
본 발명의 실시양태는 액체 상 합성 시스템, 예컨대 고정된 분자량을 갖는 LPPS 시스템에 사용하기 위한 친수성 링커 화합물을 제공한다. LPPS에 사용되는 경우에, 개시된 화합물은 긴 펩티드 (15-mer 이상)에 대한 액체 상 펩티드 합성 방법을 가능하게 한다. 실제로, 본 실시양태는 액체 상 합성, 예컨대 LPPS를 위한 친수성 링커 시스템 및 분자 또는 펩티드의 상업적 규모의 합성을 위한 그의 사용 방법을 구체적으로 제공할 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 친수성 링커 화합물은 상기 요약된 화학식 1의 화합물일 수 있다. 구체적인 바람직한 예는 하기를 포함한다:
화학식 1a의 화합물:
화학식 1b의 화합물:
화학식 1c의 화합물:
화학식 1d의 화합물:
화학식 1e의 화합물:
화학식 1f의 화합물:
화학식 1g의 화합물:
화학식 1h의 화합물:
화학식 1i의 화합물,
화학식 1j의 화합물:
화학식 1k의 화합물:
화학식 1l의 화합물
화학식 1 m의 화합물:
화학식 1n의 화합물:
및 하기 화학식 1o의 화합물:
본원에 기재된 친수성 링커 화합물을 사용하는 액체 상 합성은 아미드 결합을 통해, 즉 한 분자 상의 카르보닐 기의 또 다른 분자의 아미노 기로의 축합을 통해 연결된 화합물을 조립하는 데 사용될 수 있다. 하나의 아미노산의 카르복실 기의 또 다른 아미노산의 아미노 기로의 축합 반응으로부터 펩티드 결합이 생성되므로 펩티드 합성은 본원에 기재된 친수성 링커 분자 및 방법의 명백한 용도이다. 따라서, 아미드 결합을 함유하는 화합물은 분자를 조립하기 위한 커플링 및 탈보호 반응의 반복을 통해 조립될 수 있으며, 이는 완결 시 합성 동안 사용된 지지체로부터 방출되어야 한다. 구체적으로, 이용가능한 카르복실산 기를 갖는 Fmoc 기에 의해 보호된 아미노 기를 갖는 분자는 본원에 기재된 바와 같은 친수성 링커 분자 상에 커플링될 수 있다. 이어서, 생성된 분자는 Fmoc 기를 제거함으로써 탈보호될 수 있고, 생성된 분자의 비보호된 아미노 기는 이용가능한 아미노 기를 갖는 추가의 분자 상의 이용가능한 카르복실산 기에 커플링될 수 있다. 실시예 21 내지 24는 본원에 기재된 친수성 링커 분자를 사용한 비-펩티드 분자의 액체 상 합성을 보여준다.
SPPS 및 LPPS 둘 다에 의한 펩티드 제조는 커플링 및 탈보호 반응의 반복을 통해 진행되어 펩티드를 연장시키며, 이는 완결 시 합성 동안 사용된 지지체로부터 방출되어야 한다. 또한, 합성에 사용되는 아미노산 또는 펩티드 단편 출발 물질은 종종 커플링 단계 동안 선택성을 보장하는 것을 돕는 측쇄 보호기를 갖는다. 측쇄 보호기는 펩티드 연장 공정에서 탈보호 단계 동안 사용된 조건에 안정하도록 선택된다. 예를 들어, FMOC 기는 아미노산 출발 물질 내의 아미노 기를 보호하는 데 사용될 수 있고, 2급 아민 염기로 용이하게 제거된다. 대조적으로, BOC 및 트리페닐메틸 (트리틸) 보호기는 펩티드 연장 동안 FMOC 기를 제거하는 데 전형적으로 사용되는 염기성 조건 하에 안정하고, 완결 시 강한 유기 산으로 제거될 수 있다. 일부 펩티드 합성 링커는 아미노산 측쇄 탈보호에 사용된 것과 동일한 조건 하에 절단될 수 있다. 이는 "경질" 절단 방법으로 지칭되며 - 펩티드 연장 완결 시 펩티드는 동시에 탈보호되고 수지로부터 절단된다. 복잡한 합성 전략은 측쇄 탈보호의 조건과 직교인 조건 하에 절단이 일어나도록 하는 링커 화학의 신중한 선택에 의해 가능해질 수 있다. 이는 "연질" 절단 방법으로 지칭된다 - 펩티드는 측쇄 보호기의 일부 또는 전부가 여전히 무손상인 채로 수지로부터 절단된다.
본 개시내용의 친수성 링커는 "경질" 및 "연질" 절단 방법을 이용하는 합성 공정에 사용될 수 있다. "연질" 절단 합성 전략을 사용하는 것은, 예를 들어 합성된 펩티드가 보다 복잡한 펩티드의 하이브리드 단편-기반 합성에서 출발 물질로서 사용되도록 할 수 있다. 또한, 하이브리드 SPPS/LPPS 공정은 본원에 기재된 친수성 링커를 사용하는 수렴적 펩티드 합성 전략의 일부로서 구현될 수 있다. 펩티드 단편은 SPPS를 사용하여 구축되고, 그의 고체 지지체로부터 절단되고, 단리되고, 임의로 정제된 다음, LPPS를 사용하여 친수성 링커에 부착된 펩티드 상에 이들을 커플링시킴으로써 조립될 수 있다. 이러한 수렴적 하이브리드 SPPS/LPPS 전략은 전적으로 SPPS인 공정에 비해 규모 확대 시 더 실용적이고 효율적일 수 있다.
단편-기반 수렴적 펩티드 합성 전략은 또한 본원에 기재된 친수성 링커를 사용하여 LPPS로 구현될 수 있다. 이 경우에, 펩티드 단편은 LPPS를 사용하여 구축되고, 친수성 링커 지지체로부터 절단되고, 단리되고, 임의로 정제된 다음, LPPS를 사용하여 친수성 링커에 부착된 펩티드 상에 이들을 커플링시킴으로써 조립된다.
본 개시내용의 친수성 링커 화합물은 또한 막-증진 펩티드 합성 (MEPS)을 용이하게 하는 링커 시스템의 부분으로서 사용될 수 있다. MEPS 주위에 구축된 합성 전략은 다른 반응 성분으로부터 성장하는 펩티드의 막-기반 분리 (또는 투석여과)를 이용한다. LPPS 전략에서 MEPS의 실제 구현은 반응이 수행되는 동일한 유기 용매에서, 예를 들어 유기 용매 나노여과 (OSN)를 사용하여 이러한 분리가 수행될 수 있게 하는 시스템의 사용에 의해 용이해진다. 이러한 막-기반 분리 기술은 성장하는 펩티드와 다른 반응 성분 사이의 크기 차이에 의해 분리를 달성한다. 이를 위해, "나노스타" 허브 구조는 성장하는 펩티드의 분자 크기를 증가시키지만, 그 자체가 조밀하고 용이하게 합성되는 LPPS 지지체로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yeo, J.; et al. (2021) Angewandte Chemie International Edition 60:7786-7795] 참조). 방향족 허브 구조는 펩티드 합성 링커가 부착될 수 있는 중심 부착 지점으로서 기능할 수 있다. 이들 허브 구조는 또한, 예를 들어 UHPLC-MS (초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법)에 의한 반응 모니터링에 유용한 추가의 UV 발색단으로서의 역할을 할 수 있다. 나노스타 허브는 성장하는 합성 펩티드와 다른 반응 성분 사이의 질량 차이를 증가시켜, 투석여과 효율을 증가시킨다.
본 개시내용의 친수성 링커 화합물은 MEPS 기반 전략의 일부로서 사용될 수 있다. 특히, 본 개시내용의 친수성 링커 화합물은 연결되어 나노스타 허브를 형성할 수 있다. 반응식 1은 링크(Rink)- 또는 왕(Wang)-유형 링커를 중심 페닐 고리에 연결하는 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 특징으로 하는 이전에 개시된 나노스타 구조의 합성을 나타낸다 (Yeo, 2021).
반응식 1.
반응식 1에서의 나노스타 구조 2와 유사하게, 본원에 기재된 화학식 1의 화합물은 또한 나노스타 허브에 부착되어, 예를 들어 화학식 2의 화합물을 제공할 수 있다:
여기서 "Z"는
"m"은 0, 1, 2, 또는 3이고; "n"은 1 내지 10이고; "p"는 2 또는 3이다. 특히, 화학식 2의 나노스타 화합물을 제조할 수 있고 여기서 "Z"는
"m"은 1이고; "n"은 2, 4, 6, 8, 또는 10이고; "p"는 2 또는 3이다.
링커가 펩티드 부착 기에 부착된 2개 이상의 친수성 관능기를 특색으로 하는 "분지형" 친수성 링커 화합물이 본 개시내용에서 또한 고려된다. 분지형 친수성 링커 시스템은 하기 화학식 3의 화합물을 포함할 수 있다:
여기서 "Z"는 임의로 보호된 아미노산에 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 나타내고, 이는 다시 하나 이상의 임의로 보호된 아미노산 또는 펩티드에 대한 반복 탈보호 및 커플링 단계를 겪을 수 있고, 이어서 생성된 폴리펩티드 생성물은 화학적 변환을 통해 "Z" 기로부터 유리될 수 있고; "m"은 0, 1, 2, 또는 3이고; "n"은 1 내지 10이고; "p"는 2 또는 3이다. 특히, 화학식 3a, 3b, 및 3c의 분지형 화합물이 제조될 수 있다:
여기서 "k"는 1이고, "m"은 1이고, "q"는 1이고; "l", "n" 및 "t"는 각각 독립적으로 2, 4, 6, 8, 또는 10이다.
최근 수년간 유동 화학 공정의 대규모 구현을 가능하게 하는 기술에서 상당한 진보가 이루어졌다. 유동 화학에서, 시약 및 반응물은 통상적으로 튜브 또는 파이프를 통해 연속 유동 혼합물로 함께 펌핑된다. 주목할 만한 이점은 전통적인 배치 공정과 비교할 때 화학 제조 공정으로 유동 화학 전략을 구현함으로써 실현될 수 있다. 유동 화학 전략은 반응 파라미터, 예컨대 압력, 온도, 및 반응 시간에 대한 제어를 용이하게 한다. 반응 혼합물을 관에 통과시킴으로써, 예를 들어 혼합물은 관의 높은 표면적에 노출되고, 이는 반응으로의 또는 반응으로부터의 열의 플럭스를 증가시키며, 이는 신속한 가열 또는 냉각을 가능하게 한다. 유동 반응기는 가압되어, 대기압에서 비점 초과로 가열하고 반응 속도를 증가시킬 수 있다. 전통적인 배치 공정은 혼합 및 열 전달 속도 때문에 규모 확장 시 복잡해질 수 있는 반면, 유동 화학 공정은 이들 파라미터에 대한 고도의 제어를 보다 용이하게 유지할 수 있다. 추가로, 이동 스트림에서 반응을 수행함으로써, 소량의 고에너지 중간체만이 공정 과정 동안 임의의 시간에 생성되어, 그와 연관된 안전성 위험을 감소시킨다.
유동 화학 원리는 SPPS 및 액체 상 합성 시스템, 예컨대 LPPS 둘 다에 적용되었다. SPPS에서, 충전층 유동 시스템은 대규모 및 소규모 둘 다에서 연구되었고, 이러한 시스템은 자동화에 고도로 적용가능하다. LPPS에서, 고정화된 시약 및 마이크로반응기는 소규모로 펩티드 단편을 제조하는 데 사용되어 왔고 (예를 들어, 문헌 [Baxendale, I.R.; et al. (2006) Chemical Communications 4835-4837]; 및 문헌 [Fuse, S.; et al. (2014) Angewandte Chemie International Edition 53:851-855] 참조), 연속 교반-탱크 반응기 (CSTR) 기술은 디- 및 트리펩티드 생성물의 대규모 제조에 적용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Jolley, K.E.; et al. (2017) Organic Process Research and Development 21:1557-1565] 참조).
본 개시내용의 친수성 링커 화합물은 유동 화학 액체 상 공정, 예컨대 LPPS를 가능하게 하는 데 특히 유용하다. 용액 중 친수성 링커에 커플링된 성장하는 분자, 예를 들어 펩티드에 대한 커플링 및 탈보호 반응의 신속한 반응 속도는 유동 화학 공정 구현을 위한 유리한 특색이다. 바람직하지 않은 부산물 및 미반응 출발 물질로부터 목적하는 반응 생성물을 분리하는 문제가 용액-상 유동 화학에 남아있다. 본원에 개시된 친수성 링커 화합물을 사용한 분자, 예컨대 펩티드의 제조는 용액 중에서 일어나지만, 목적 생성물의 단리는 상 분리에서 일어나며, 이는 연속 액체-액체 분리 (예를 들어, 혼합기-침강기 또는 연속 유동 원심분리기 사용)의 사용을 가능하게 한다.
상당한 부피의 독성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세트아미드, 및 디클로로메탄이 통상의 고체 상 펩티드 합성에서, 예를 들어 세척, 커플링 및 탈보호 단계에서 이용되며, 이는 산업 위생 및 환경 보호에 문제를 제기한다. 이러한 이유로, 펩티드 합성에 사용하기 위한 보다 환경 친화적인 (즉, "보다 친환경적인") 대안적 용매를 개발하는 것에 대한 강한 관심이 존재한다. 본원에 기재된 방법은 이러한 보다 친환경적인 용매를 사용할 수 있다. 보다 친환경적인 세척 용매의 예는 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, MTBE (메틸 tert-부틸 에테르) 및 CPME (시클로펜틸 메틸 에테르)를 포함한다. 본원에 기재된 커플링 반응은 또한 보다 친환경적인 용매, 예컨대 DMSO 중에서 일어날 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 카르복실산 (-CO2H) 및 아민 (-NH2) 관능기를 포함하는 유기 화합물을 지칭한다. 아미노산은 단백질생성 (즉, 번역 동안 생합성적으로 단백질 내로 혼입됨), 예컨대 글리신, L-알라닌 및 L-페닐알라닌, 또는 비-단백질생성, 예컨대 3-아미노이소부티르산 및 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친수성 링커"는 그 위에 분자, 예컨대 폴리펩티드가 커플링 (예를 들어, 아미노산 커플링) 및 탈보호 단계를 통해 구축될 수 있고, 물에 대해 높은 친화도를 갖는 1개 이상의 관능기를 특색으로 하는 화학적 모이어티를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유동 화학"은 연속적으로 유동하는 스트림에서 화학 반응을 수행하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "나노스타"는, 코어 유기 화학 구조가, 그 위에 생체중합체 (예를 들어, 폴리펩티드) 쇄가 구축될 수 있는 2개 이상의 링커에 대한 중심 부착 지점 (또는 "허브")으로서의 역할을 하는, 생체중합체의 합성에 사용되는 링커 구축 개념을 지칭한다. 폴리펩티드의 구축을 위한 나노스타 구조가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Yeo, J.; et al. (2021) Angewandte Chemie International Edition 60:7786-7795] 참조).
본원에 사용된 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체 쇄를 지칭한다. 이들 아미노산은 변형된 아미노산을 포함한 천연 또는 합성 아미노산일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "AEEA"는 2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)아세틸을 지칭하고; "Aib"는 2-아미노이소부티르산을 지칭하고; "Boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "CAD"는 하전된 에어로졸 검출기를 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DEPBT"는 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온을 지칭하고; "DIC"는 디이소프로필카르보디이미드를 지칭하고; "DIEA"는 디이소프로필에틸아민을 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "DVB"는 디비닐벤젠을 지칭하고; "EDC"는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 지칭하고; "ESMS"는 전기분무 질량 분광측정법을 지칭하고; "Fmoc"는 플루오레닐메틸옥시카르보닐을 지칭하고; "Fmoc-수베롤(Suberol)"은 5-Fmoc-아미노-2-카르복시메톡시-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d]시클로헵텐을 지칭하고; "HMPA"는 4-(히드록시메틸)페녹시아세트산을 지칭하고; "HMPB"는 4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)부티르산을 지칭하고; "LCMS"는 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법을 지칭하고; "LPPS"는 액체 상 펩티드 합성을 지칭하고; "MTBE"는 메틸 tert-부틸 에테르를 지칭하고; "옥시마"는 에틸 시아노히드록시이미노아세테이트를 지칭하고; "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜을 지칭하고; "PyBop"는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트17을 지칭하고; "PyOxim"은 [(E)-(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴)아미노]옥시-트리피롤리딘-1-일포스파늄을 지칭하고; "SPPS"는 고체-상 펩티드 합성을 지칭하고; "tBu"는 tert-부틸을 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "Trt"는 트리틸을 지칭하고; "UPLC"는 초고성능 액체 크로마토그래피를 지칭한다.
반응식 2.
반응식 2는 친수성 링커 화합물 8의 제조를 보여주며, 여기서 "X"는 화학적으로 불안정한 -OH 또는 -NH2를 보유하는 관능기를 나타내고, 이는 임의로 보호된 아미노산에 대한 에스테르 또는 아미드 결합 (각각)을 형성할 수 있고, 이는 다시 하나 이상의 임의로 보호된 아미노산 또는 펩티드에 대한 반복 탈보호 및 커플링 단계를 겪을 수 있고, 이어서 생성된 폴리펩티드 생성물은 화학적 변환을 통해 "X" 기로부터 유리될 수 있다.
화합물 8을 반응식 1에서 Fmoc 보호기 전략을 사용하여 고체-상 합성에 의해 제조하였다. 이 합성은 부분적으로 또는 전체적으로 자동화 펩티드 합성기 상에서 수행될 수 있다. 단계 1에서, Fmoc-시버(Sieber) 아미드 수지 (1)는 피페리딘을 사용하여 탈보호된 다음, 단계 2에서 아미드 커플링 조건 (예를 들어, 옥시마 및 DIC)을 사용하여 Fmoc-보호된 중간체 2와 커플링되어 중간체 3을 제공한다. 단계 3 (피페리딘을 사용한 탈보호) 및 단계 4 (아미드 커플링 조건, 예를 들어 PyOxim 및 유기 염기를 사용한 Fmoc-보호된 중간체 2와의 아미드 커플링)의 반복 사이클링은 중간체 4를 수득하고, 사이클은 함께 커플링된 "n" 단량체 단위를 달성하기 위해 "n" - 1회 반복된다. 단계 5에서, 중간체 4를 피페리딘으로 탈보호한 다음, 단계 6에서 중간체 5 또는 6과 아미드 커플링 (예를 들어, PyOxim 및 유기 염기 사용)하여 중간체 7을 수득한다. 중간체 7이 Fmoc-보호된 질소를 보유하는 경우에, 이를 단계 7에서 피페리딘을 사용하여 탈보호시킨다. 최종적으로, 친수성 링커 화합물 8은 산성 조건 하에 (예를 들어, TFA를 사용하여) 시버 수지로부터 절단된다.
반응식 3.
반응식 3은 질소를 보유하는 친수성 링커 화합물 9를 사용한 아미노산의 중합체 쇄의 연장을 보여주며, 링커 위에 아미노산의 중합체 쇄가 구축된 다음, 산성 조건 하에 링커로부터 절단될 수 있다. 단계 1에서, Fmoc-보호된 아미노산 10을 극성 비양성자성 유기 용매, 예컨대 DMF 또는 DMSO 중에서 아미드 커플링 조건 (예를 들어, PyOxim 및 유기 염기)을 사용하여 친수성 링커 화합물 9와 커플링시켜 제1 커플링된 중간체 11을 수득한다. 반응 완결 시, 덜 극성인 비양성자성 용매, 예컨대 MTBE를 첨가하고, 이는 커플링된 중간체 11이 반응 혼합물로부터 침전되도록 한다. 침전물을 벌크 반응 혼합물로부터 (예를 들어, 원심분리 및 상청액의 경사분리에 의해) 분리하고, 임의로 이를 불용성인 용매 (예를 들어, MTBE)로 다시 처리하고, 이어서 침전물을 (예를 들어, 원심분리 및 상청액의 경사분리에 의해) 분리함으로써 세척한다. 이러한 방식으로 중간체 11을 반응 혼합물로부터 단리하고, 반응 용매, 미반응 출발 물질, 및 반응 폐기물의 벌크로부터 분리한다. 단계 2에서, 중간체 11을 피페리딘을 사용하여 탈보호하고, 침전/생성물 분리/임의적인 세척 절차를 수행한 다음, 단계 3에서 다음 보호된 아미노산 (12)을 아미드 커플링 조건 (예를 들어, PyOxim 및 유기 염기)을 사용하여 커플링시키고, 이어서 침전/생성물 분리/임의적인 세척 절차 후 중간체 13을 수득한다. 이 시점에서, 중간체 13은 다른 화학적 변환으로 수행될 수 있다 (예를 들어, 반응식 6에 요약된 바와 같음). 말단 질소 보호기가 -Fmoc이고 중합체 쇄 연장이 계속되는 경우에, 단계 2 및 3을 보호된 아미노산 (예를 들어, 14)을 사용하여 순서대로 반복적으로 반복하여 중간체 15를 수득한다.
반응식 4.
반응식 4는 산소를 보유하는 친수성 링커 화합물 16을 사용한 아미노산의 중합체 쇄의 연장을 보여주며, 링커 위에 아미노산의 중합체 쇄가 구축된 다음, 산성 조건 하에 링커로부터 절단될 수 있다. 이 방법의 단계는, 단계 1이 에스테르화 단계 (시약, 예를 들어 PyBop/유기 염기 또는 DIC/DMAP를 사용하여 수행됨)인 것을 제외하고는, 반응식 3에 요약된 단계와 유사하다. 반응식 3에 요약된 바와 같은 반복 탈보호 및 보호된 아미노산과의 커플링 단계 (각각 단계 2 및 3)는 중합체 화합물 17을 제공한다.
반응식 5.
반응식 5는 산소에 의해 연결된 링커로부터 연장된 아미노산 중합체를 절단하기 위한 3개의 경로를 보여준다. 이들 링커로부터 절단될 때, 아미노산 중합체는 그의 C-말단에 유리 카르복실산 (-CO2H)을 갖는다.
제1 경로에서, 단계 1b에서 화합물 17은 산성 조건 (예를 들어, DCM 중 2-5% TFA) 하에 "연질" 절단을 겪고, 아미노산 중합체로부터 링커를 가수분해하여 C-말단에 카르복실산 기를 제공하고, N-말단 보호기 (및 R1, R2, R3 등에 존재할 수 있는 다른 보호기)를 화합물 18에 무손상으로 남긴다. 염기, 예컨대 피리딘으로 중화시킨 후, 수성 후처리하여 친수성 링커의 벌크를 18로부터 분리한다. 이어서, N-말단의 보호기가 무손상인 18을 예를 들어 단편-기반 펩티드 합성 전략의 일부로서 또 다른 아민과 커플링시킬 수 있다.
제2 경로에서, 단계 1a에서, N-말단 보호기를 적합한 조건 하에 제거하여 (-Fmoc 보호의 경우에, 피페리딘이 사용됨) 19를 수득한다. 단계 2b에서 아미노산 중합체는 R1, R2, R3 등에 존재할 수 있는 보호기를 무손상 상태로 남겨두는 조건 (예를 들어, DCM 중 2-5% TFA 사용) 하에 링커로부터 가수분해되어 20을 제공할 수 있거나, 또는 예를 들어 TFA, 트리이소프로필실란, 1,2-에탄디티올, 및 물의 혼합물 (85 : 5 : 5 : 5 v/v 비)을 사용하는 "경질" 절단 조건 하에 산-불안정성 보호기의 전반적 탈보호를 달성할 수 있다.
제3 경로에서, 중간체 19는 단계 2a에서 아미드 커플링 조건 (예를 들어, DEPBT 및 유기 염기, 또는 21은 유기 염기를 사용하여 숙신이미딜 에스테르로서 반응할 수 있음) 하에 카르복실산 21과 커플링되어 22를 제공한다. 단계 3에서, 화합물 23은 상기 요약된 "경질" 또는 "연질" 절단을 사용하여 친수성 링커로부터 절단된다.
반응식 6.
반응식 6은 질소에 의해 연결된 링커로부터 연장된 아미노산 중합체를 절단하기 위한 2개의 경로를 보여준다. 이들 링커로부터 절단될 때, 아미노산 중합체는 그의 C-말단에 1급 아미드 (-CONH2)를 갖는다.
제1 경로에서, 중간체 24 상의 N-말단 보호기는 단계 1a에서 제거되어 (보호기가 -Fmoc인 경우에 피페리딘을 사용함) 25를 제공한 다음, 친수성 링커로부터의 절단은 산성 조건 하에, "연질" 절단 조건 (예를 들어, DCM 중 2-5% TFA)을 사용하여 달성되어 R1, R2, R3 등의 보호기를 무손상으로 남기거나, 또는 "경질" 절단 조건 (예를 들어, 85 : 5: 5 : 5 TFA, 트리이소프로필실란, 1,2-에탄디티올, 및 물)을 사용하여 산 불안정성 R1, R2, R3 등의 보호기를 제거하여 26을 제공한다. 중간체 24의 N-말단 보호기가 산-불안정성 보호기, 예컨대 -Boc인 경우에, 단계 1a 및 2b는 "경질" 절단 조건 하에 원 포트에서 달성될 수 있다.
제2 경로에서, 25는 단계 2a에서 아미드 커플링 조건 (예를 들어, DEPBT 및 유기 염기, 또는 27은 유기 염기를 사용하여 숙신이미딜 에스테르로서 반응할 수 있음) 하에 카르복실산 27과 커플링되어 28을 제공한다. 단계 3에서, 화합물 29는 상기 요약된 "경질" 또는 "연질" 절단을 사용하여 친수성 링커로부터 절단된다.
실시예
하기 실시예는 개시내용의 다양한 실시양태를 추가로 예시하고, 개시내용의 화합물의 전형적인 합성을 나타낸다. 시약 및 출발 물질은 용이하게 입수가능하거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제시되고, 다양한 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
LCMS를 애질런트(AGILENT)® HP1200 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 수행하였다. 크로마토그래피 조건 - 칼럼: 워터스(Waters) CSH™ C18 150 x 2.1 mm, 1.7 μm; 20 내지 30분 실행에 걸쳐 5 에서 95% 용매 B:용매 A 구배 사용; 유량: 0.5 mL/분; 칼럼 온도: 40 내지 50℃; 용매 A: 물 중 0.2% TFA; 용매 B: 아세토니트릴이었다. 전기분무 질량 분광측정법 측정 (ESMS)은 크로마토그래피 시스템에 인터페이스된 질량 선택적 검출기 사중극자 질량 분광계 상에서 수행하였다.
실시예 1
2-(4-(아미노(2,4-디메톡시페닐)메틸)페녹시)-N-(53-아미노-8,17,26,35,44,53-헥사옥소-3,6,12,15,21,24,30,33,39,42,48,51-도데카옥사-9,18,27,36,45-펜타아자트리펜타콘틸)아세트아미드 [링크-(AEEA)6-NH2]의 제조
표제 화합물을 Fmoc-시버 아미드 수지 (치환 0.8, 스티렌 1% DVB, 100-200 메쉬)로부터 출발하여 심포니 X 자동화 펩티드 합성기(Symphony X Automated Peptide Synthesizer) (프로테인 테크놀로지스 인크.(Protein Technologies Inc.)) 상에서 Fmoc 전략을 사용한 고체-상 합성에 의해 제조하였다.
시버 수지 상의 AEEA 단위의 커플링: Fmoc-시버 아미드 수지 상의 (AEEA)6의 제조를 9개의 배치에서 0.5 mmol 규모 (총 4.5 mmol)로 수행하였다. 각각의 배치에 대해, 수지를 DMF (10 mL)의 2회 세척을 사용하여 각각 10분에 걸쳐 팽윤시켰다. 이어서, 탈보호 및 커플링 사이클을 하기와 같이 수행하였다: 수지를 DMF로 세척하고 (2분에 걸쳐 9 mL), DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 탈보호하고 (5분에 걸쳐 7 mL에 이어서 25분에 걸쳐 9 mL), DMF로 세척하고 (1분에 걸쳐 9 mL, 6회 반복), Fmoc-AEEA-OH [DMF 중 0.375 M Fmoc-AEEA-OH (4 mL, 1.5 mmol, 3 당량), 옥시마 (0.750 M, 2 mL, 3 당량), DIC (0.660 M, 2.5 mL, 3.3 당량)]와 커플링시키고, 질소 버블링에 의해 1시간 45분 동안 혼합하고, 최종적으로 반응 용기를 배수시키고, DMF (30초에 걸쳐 9 mL, 3회 반복)로 세척하였다. 이 탈보호 및 커플링 사이클을 총 6회 반복하여 시버 수지 상에 Fmoc-(AEEA)6을 수득하였다. 최종 DMF 세척 후, 수지를 DCM으로 세척하고 (1분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복), 질소의 유동 하에 4시간 동안 건조시켰다. 이러한 방식으로 제조된 각각의 배치에 대한 시버 수지 상의 Fmoc-(AEEA)6의 평균 수율은 1.156 g이었다.
시버 수지 상의 (AEEA)6 상에의 링크 기 커플링: 시버 수지 상의 Fmoc-(AEEA)6의 부분 (1.1 g, 0.5 mmol)을 DMF로 팽윤시키고 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복), DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 탈보호시킨 후 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복), DMF로 세척하였다 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복). DMF (9 mL) 중 Fmoc-링크 링커 (p-[a-[1-(9H-플루오렌-9-일)-메톡시포름아미도]-2,4-디메톡시벤질]-페녹시아세트산, 0.81 g, 1.5 mmol, 3.0 당량), PyOxim (0.79 g, 1.5 mmol, 3.0 당량), 및 DIEA (0.52 mL, 0.39 mg, 3.0 mmol, 6.0 당량)의 용액을 반응 용기에 첨가하고, 질소 버블링에 의해 2시간 동안 혼합하였다. 반응 용기를 배수시키고, DMF로 세척한 다음 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복), DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 탈보호하였다 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복). 수지를 DMF로 세척하였다 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복). 최종 DMF 세척 후, 수지를 DCM으로 세척하고 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복), 질소의 유동 하에 4시간 동안 건조시켜 시버 수지 상의 링크-(AEEA)6 1.21 g을 수득하였다.
시버 수지로부터의 링크-(AEEA)6-NH2의 절단: 시버 수지 (1.21 g) 상의 링크-(AEEA)6을 DCM (12 mL) 중 5% TFA와 30분 동안 혼합하고, 여과하고, 추가의 DCM으로 세척하였다. 여과물을 DIEA로 중화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 오일을 DMSO (2 mL)에 녹이고, 이어서 MTBE (30 mL)를 첨가한 다음, 혼합물을 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 새로운 MTBE (30 mL)를 첨가한 다음, 혼합물을 3000 rpm에서 3분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 경사분리하여 표제 화합물을 오일 침전물로서 남겼다. ESMS m/z 1188.5 (M+H+).
실시예 2
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[아미노-(2,4-디메톡시페닐)메틸]페녹시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세트아미드 [링크-(AEEA)8-NH2]의 제조
8개의 AEEA 단위를 고체 지지체 상에 커플링시킨 후에 Fmoc-링크 링커 상에 커플링시켜, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. Fmoc-링크 링커를 시버 수지 상의 (AEEA)8 상에 커플링시킨 후, Fmoc-링크-(AEEA)8-NH2를 DCM 중 2% TFA (20분에 걸쳐 5 부피, 5회 반복)를 사용하여 수지로부터 절단하였다. 합한 여과물을 DIEA로 중화시키고, 용액을 증발시켰다. DMF (2 부피)를 첨가하고, 이어서 MTBE를 첨가하여 상 분리를 개시하였다. 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 제거하여, Fmoc-링크-(AEEA)8-NH2를 유성 물질로서 남겼다. 최종 Fmoc 기를 DMF 중 30% 피페리딘으로 제거하고, 이어서 MTBE를 첨가하여 상 분리를 개시하였다. 상청액을 제거하여 표제 화합물을 오일로서 수득하였다. ESMS m/z 739.5 (M+2H+/2)
실시예 3
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[아미노-(2,4-디메톡시페닐)메틸]페녹시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세트아미드 [링크-(AEEA)10-NH2]의 제조
10개의 AEEA 단위를 고체 지지체 상에 커플링시킨 후에 Fmoc-링크 링커 상에 커플링시켜, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 1768.8 (M+H+)
실시예 4
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[아미노-(2,4-디메톡시페닐)메틸]페녹시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세트아미드 [링크-(AEEA)4-NH2]의 제조
4개의 AEEA 단위를 고체 지지체 상에 커플링시킨 후에 Fmoc-링크 링커 상에 커플링시켜, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 897.4 [(M+H+].
실시예 5
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-[아미노-(2,4-디메톡시페닐)메틸]페녹시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세트아미드 [링크-(AEEA)2-NH2]의 제조
2개의 AEEA 단위를 고체 지지체 상에 커플링시킨 후에 Fmoc-링크 링커 상에 커플링시켜, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 607.3 [(M+H+].
실시예 6
N-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노-2-옥소-에톡시)에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸]-4-[4-(히드록시메틸)-3-메톡시-페녹시]부탄아미드 [HMPB-(AEEA)10-NH2]의 제조
본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 10개의 AEEA 단위를 시버 수지 상에 커플링시켰다. 마지막 AEEA 단위를 수지 상에 커플링시킨 후, 이를 DCM으로 세척하고, 질소의 유동 하에 4시간 동안 건조시켰다. 수지의 일 부분 (0.50 mmol)을 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 DMF 중 20% 피페리딘으로 탈보호한 다음, 수지를 DCM (11.4 mL) 중에 현탁시키고, TFA (0.6 mL)를 첨가하였다. 현탁액을 25℃에서 30분 동안 혼합한 다음, 여과하고, DCM으로 세척하였다. 여과물을 DIEA로 중화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 오일을 DMSO (2 mL) 중에 용해시키고, 이어서 MTBE (30 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 제거하여, 원심분리 튜브 내에 (AEEA)10-NH2를 오일로서 남겼다.
(AEEA)10-NH2를 함유한 원심분리 튜브에 DMSO (1.5 mL) 중 DEPBT (150 mg, 0.50 mmol), HMPB (120 mg, 0.50 mmol) 및 DIEA (0.174 mL, 129 mg, 1.0 mmol)의 용액을 첨가하고, 용액을 5분 동안 정치시킨 후, 이를 튜브에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 진탕기에 두고, 2시간 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (20 mL)를 첨가하여 상 분리를 유도하였다. 혼합물을 원심분리하고 (2500 rpm에서 3분 동안), 상청액을 폐기하였다. 새로운 MTBE (20 mL)를 튜브에 첨가하고, 원심분리하고 (2500 rpm에서 3분 동안), 상청액을 폐기하여 표제 화합물을 오일로서 남겼다. ESMS m/z 1712.70 (M+Na-1H).
실시예 7
N-(17-아미노-8,17-디옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9-아자헵타데실)-4-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페녹시)부탄아미드 [HMPB-(AEEA)2-NH2]의 제조
HMPB를 (AEEA)2-NH2에 커플링시켜 HMPB-(AEEA)2-NH2를 수득한 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 552.3 (M+Na+).
실시예 8
N-(35-아미노-8,17,26,35-테트라옥소-3,6,12,15,21,24,30,33-옥타옥사-9,18,27-트리아자펜타트리아콘틸)-4-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페녹시)부탄아미드 [HMPB-(AEEA)4-NH2]의 제조
HMPB를 (AEEA)4-NH2에 커플링시켜 HMPB-(AEEA)4-NH2를 수득한 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 842.4 (M+Na+).
실시예 9
N-(53-아미노-8,17,26,35,44,53-헥사옥소-3,6,12,15,21,24,30,33,39,42,48,51-도데카옥사-9,18,27,36,45-펜타아자트리펜타콘틸)-4-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페녹시)부탄아미드 [HMPB-(AEEA)6-NH2]의 제조
HMPB를 (AEEA)6-NH2에 커플링시켜 HMPB-(AEEA)6-NH2를 수득한 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 1132.5 (M+Na+).
실시예 10
2-((5-아미노-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-3-일)옥시)-N-(53-아미노-8,17,26,35,44,53-헥사옥소-3,6,12,15,21,24,30,33,39,42,48,51-도데카옥사-9,18,27,36,45-펜타아자트리펜타콘틸)아세트아미드 [라마지(Ramage)-(AEEA)6-NH2]의 제조
시버 수지 상의 (AEEA)6 상에의 라마지 기 커플링: 시버 수지 상의 Fmoc-(AEEA)6의 일 부분 (986.8 mg, 0.5 mmol)을 DMF로 팽윤시키고 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복), DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 탈보호한 다음 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복), DMF로 세척하였다 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복). DMF:DMSO (4:1, 5 mL) 중 Fmoc-수베롤 (0.76 g, 1.5 mmol, 3.0 당량)의 용액을 반응 용기에 첨가하고, 이어서 옥시마 (DMF 중 0.750 M, 2 mL, 1.5 mmol, 3.0 당량) 및 DIC (DMF 중 0.660 M, 2.5 mL, 1.65 mmol, 3.3 당량)를 첨가하고, 질소 버블링에 의해 4시간 동안 혼합하였다. 반응 용기를 배수시키고, DMF로 세척한 다음 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복), DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 탈보호하였다 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복). 수지를 DMF로 세척하였다 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복). 최종 DMF 세척 후, 수지를 DCM으로 세척하고 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복), 질소의 유동 하에 4시간 동안 건조시켜 시버 수지 상의 링크-(AEEA)6 1.21 g을 수득하였다.
시버 수지로부터의 라마지-(AEEA)6-NH2의 절단: DCM 중 2% TFA를 사용하고 추가 처리 전에 30분 대신 10분 동안 반응물을 교반한 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 라마지-(AEEA)6-NH2를 시버 수지로부터 절단하였다. ESMS m/z 1153.55 (M+H).
실시예 11
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[(11-아미노-6,11-디히드로-5H-디벤조[1,2-e:1',2'-f][7]아뉼렌-2-일)옥시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세트아미드 [라마지-(AEEA)10-NH2]의 제조
Fmoc-수베롤을 시버 수지 상의 (AEEA)10에 커플링시켜, 실시예 10에 기재된 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 1733.8 (M+H).
실시예 12
2-((5-아미노-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-3-일)옥시)-N-(35-아미노-8,17,26,35-테트라옥소-3,6,12,15,21,24,30,33-옥타옥사-9,18,27-트리아자펜타트리아콘틸)아세트아미드 [라마지-(AEEA)4-NH2]의 제조
Fmoc-수베롤을 시버 수지 상의 (AEEA)4에 커플링시켜, 실시예 10에 기재된 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 863.4 (M+H).
실시예 13
2-((5-아미노-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-3-일)옥시)-N-(17-아미노-8,17-디옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9-아자헵타데실)아세트아미드 [라마지-(AEEA)2-NH2]의 제조
Fmoc-수베롤을 시버 수지 상의 (AEEA)2에 커플링시켜, 실시예 10에 기재된 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 595.3 (M+Na).
실시예 14
N-(2-(2-(2-아미노-2-옥소에톡시)에톡시)에틸)-2-(2-(2-(2-(4-(히드록시메틸)페녹시)아세트아미도)에톡시)에톡시)아세트아미드 [HMPA-(AEEA)2-NH2]의 제조
시버 수지 상의 (AEEA)2 상에의 HMPA 기 커플링: 시버 수지 상의 Fmoc-(AEEA)2의 부분 (845 mg, 0.5 mmol)을 DMF로 팽윤시키고 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복), DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 탈보호시킨 다음 (20분에 걸쳐 10 mL, 3회 반복), DMF로 세척하였다 (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복). DMF (10 mL) 중 HMPA (91 mg, 0.5 mmol, 1.0 당량), DIEA (0.174 mL, 1.0 mmol, 2.0 당량) 및 DEPBT (150 mg, 0.5 mmol, 1.0 당량)의 용액을 반응 용기에 첨가하고, 질소 버블링에 의해 2시간 동안 혼합하였다. 반응 용기를 배수시키고, DMF (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복)로 세척한 다음, DCM (2분에 걸쳐 10 mL, 5회 반복)으로 세척하고, 질소의 유동 하에 4시간 동안 건조시켜 시버 수지 상의 HMPA-(AEEA)2 908.6 mg을 수득하였다.
시버 수지로부터의 HMPA-(AEEA)2-NH2의 절단: HMPA-(AEEA)2-NH2를 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 시버 수지로부터 절단하여 표제 화합물을 수득하였다. ESMS m/z 472.2 (M+H+).
실시예 15
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[4-(히드록시메틸)페녹시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세트아미드 [HMPA-(AEEA)10-NH2]의 제조
HMPA를 시버 수지 상의 (AEEA)10에 커플링시켜, 실시예 14에 기재된 절차를 사용한 고체-상 합성에 의해 표제 화합물을 제조하였다. ESMS m/z 1632.7 (M+H).
실시예 16 - 링크-(AEEA)6-NH2 및 링커로부터의 "경질" 절단을 사용한 액체 상 펩티드 합성
서열식별번호: 1의 19-mer 펩티드를 하기와 같이 액체 상 펩티드 합성을 사용하여 제조하였다.
링크-(AEEA)6-NH2 상의 아미노산 쇄의 연장: Fmoc-Ser(tBu)-OH (0.5 mmol), PyOxim (0.5 mmol), 및 DIEA (1 mmol)를 DMF (1 mL)에 용해시켰다. 용액을 1분 동안 혼합한 다음, 링크 링커-(AEEA)6-NH2 (실시예 1에서 제조됨, 0.16 mmol)를 첨가하였다. 반응 용액을 10분 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 3250 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 나머지 물질을 DMF 중 30% 피페리딘 (1 mL)과 5분 동안 혼합하였다. 5분 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. LCMS는 각각의 원심분리 단계에서 MTBE-함유 상청액 중 생성물의 부재를 확인하였다.
아미노산 커플링 및 탈보호 단계를 반복하여, Fmoc-보호된 아미노산 (tBu로 보호된 측쇄 -OH 및 -CO2H 기)을 서열식별번호: 1에 주어진 바와 같이 C-말단에서 N-말단의 순서로 커플링시켰다. DMF 및 DMSO는 펩티드 구축물이 15개 이하의 아미노산일 때 아미노산 커플링 및 탈보호 단계를 위한 반응 용매로서 상호교환가능하였다. DMSO는 펩티드 길이가 15개 초과의 아미노산일 때 반응 용매로서 바람직하였다. 서열식별번호: 1에서 최종 알라닌 잔기 커플링의 완결 시, 상기 기재된 30% 피페리딘/DMF 탈보호 반응 조건을 사용하여 최종 Fmoc 기를 제거하였다. 생성물을 동결건조시켜 서열식별번호: 1의 펩티드 (잔류 용매와 함께 0.612 mg)를 수득하였다. ESMS m/z 1697.7 (M+2H+/2), 1132.0 (M+3H+/3). 조 단리된 중량은 액체 상 합성 동안 MTBE를 사용한 상 분리 단계 동안 상청액에서 생성물이 손실되지 않음을 나타내는 LCMS 데이터를 지지한다.
링커로부터의 펩티드의 "경질" 절단: 가용성 링커 및 보호기를 제거하기 위해, 서열식별번호: 1의 펩티드를 TFA : 트리이소프로필실란 : 1,2-에탄디티올 : 물 (85 : 5 : 5 : 5 v/v 비)을 함유하는 용액 중에서 2시간 동안 25℃에서 교반하여 하기 서열을 갖는 펩티드를 수득하였다:
AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (서열식별번호: 2)
서열식별번호: 2의 펩티드를 MTBE (반응 부피에 비해 10 : 1 MTBE)로 침전시키고, 상기 기재된 바와 같이 원심분리한 다음, 진공 하에 건조시켰다. 고해상도 MS m/z 관찰치 944.4783 (전하 상태 +2, 중성 질량 1886.9426), 이론적 중성 질량 1886.9414.
실시예 17 - 라마지-(AEEA)10-NH2 및 링커로부터의 "연질" 절단을 사용한 액체-상 펩티드 합성
라마지-(AEEA)10-NH2 상에서의 서열식별번호: 3의 제조: 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같은 절차를 이용하여, Fmoc-Ser(tBu)-OH를 3.0 mmol의 라마지-(AEEA)10-NH2 상에 커플링시키는 것으로 출발하여, Fmoc 탈보호로 이어지는 액체 상 펩티드 합성에 의해 서열식별번호: 3의 펩티드를 제조하였다. 나머지 Fmoc-보호된 아미노산 (tBu로 보호된 측쇄 -OH 기)을 서열식별번호: 3에 주어진 바와 같이 C-말단에서 N-말단의 순서로 커플링/탈보호하였다. Pro(7) 및 Pro(8)를 이량체 (Fmoc-Pro-Pro-OH)로서 혼입하였다. PyBOP는 PyOxim과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. ESMS m/z 913.1 (M+3H+/3).
링커로부터의 펩티드의 연질 절단: 서열식별번호: 3의 펩티드에 DCM 중 2% TFA (10 부피)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 1 당량의 피리딘을 사용하여 중화시키고, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 출발 물질이 생성물에서 관찰되었고, 여기에 DCM 중 2% TFA 20 부피를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 피리딘으로 중화시키고, 다시 진공 하에 농축시켰다. 잔류물에 DCM 중 5% TFA 용액 (50 부피)을 첨가하였다. 40분 후, 용액을 감압 하에 농축된 피리딘으로 중화시켜 서열식별번호: 4의 조 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1042.50 (M+Na+).
G-P-S(tBu)-S(tBu)-G-A-P-P-P-S(tBu)-NH2 (서열식별번호: 4)
실시예 18 - 링크-(AEEA)2-NH2를 사용한 액체 상 펩티드 합성
서열식별번호: 5의 펩티드를 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같이 액체 상 펩티드 합성에서 지지체로서 링크-(AEEA)2-NH2를 사용하여 제조하였다. MTBE를 최종 Fmoc 탈보호 반응 혼합물에 첨가한 다음, 혼합물을 원심분리하였다. 상청액을 폐기하여 서열식별번호: 5의 펩티드를 오일 침전물로서 수득하였다. ESMS m/z 1631.8 (M+Na+), 1609.8 (M+H+), 805.5 (M+2H+/2).
실시예 19 - HMPA-(AEEA)10-NH2 및 링커로부터의 "연질" 절단을 사용한 액체 상 펩티드 합성
서열식별번호: 6의 펩티드를 하기와 같이 액체 상 펩티드 합성을 사용하여 제조하였다.
HMPA-(AEEA)10-NH2 상에서의 아미노산 쇄의 연장: DMSO (2 mL) 중 Fmoc-Gly-OH (0.2388 g, 0.8032 mmol)의 용액에 PyBOP (0.418 g, 0.803 mmol) 및 DIEA (0.207 g, 1.60 mmol)를 첨가하였다. 이를 1분 동안 혼합하고, HMPA-(AEEA)10-NH2 (0.4372 g, 0.2678 mmol)에 첨가하고, 90분 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (40 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온, 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 경사분리하였다. 이 세척을 3회 반복하여 하부 오일 층을 남겼다. 커플링 절차를 1회 더 반복한 다음, 생성된 오일을 DMF (2 mL) 중 10% 피페리딘과 15분 동안 혼합하였다. MTBE (20 mL)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 상기 기재된 바와 유사한 방식으로 원심분리하였다. 10% 피페리딘/DMF 탈보호 절차를 1회 더 수행하여 하부 오일 층을 수득하였다.
나머지 Fmoc-보호된 아미노산 (트리틸로 보호된 글루타민 측쇄 -CONH2 기 및 -Boc로 보호된 트립토판 측쇄 -NH 기)을 서열식별번호: 6에 주어진 바와 같이 C-말단에서 N-말단의 순서로 상기 기재된 방식으로 커플링/탈보호하고, 후속 커플링 반응물을 90분 대신에 45분 동안 교반하였다. 최종 아미노산 (Fmoc-Phe-OH) 커플링 반응물을 45분 동안 교반한 후, 이소프로필아세테이트를 혼합물에 첨가하고, 이어서 상기 기재된 바와 같이 원심분리하고, MTBE로 세척하여 하부 오일 층을 표제 화합물로서 수득하였다. ES/MS m/z 1556.10 (M+2H+/2).
링커로부터의 펩티드의 연질 절단: 서열식별번호: 6의 펩티드를 DCM 중 3% TFA와의 2회 30분 인큐베이션을 사용하여, 본질적으로 실시예 17에 기재된 바와 같은 연질 절단 절차에 적용하여 서열식별번호: 7의 펩티드를 수득하였다. ES/MS m/z 1519.60 (M+Na+).
Fmoc-F-V-Q(Trt)-W(Boc)-L-I-A-G-OH (서열식별번호: 7)
실시예 20 - HMPB-(AEEA)10-NH2 및 링커로부터의 "연질" 절단을 사용한 액체 상 펩티드 합성
서열식별번호: 8의 펩티드를 하기와 같이 액체 상 펩티드 합성을 사용하여 제조하였다.
HMPB-(AEEA)10-NH2 상의 아미노산 쇄의 연장: Fmoc-보호된 아미노산 (트리틸로 보호된 글루타민 측쇄 -CONH2 기 및 -Boc로 보호된 트립토판 측쇄 -NH 기)을 커플링시킨 후, 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같이 C-말단에서 N-말단의 순서로 실시예 16에 기재된 방식으로 탈보호시켜, 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같이 서열식별번호: 8의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z ESMS m/z 1585.70 (M+2H+/2).
서열식별번호: 7의 펩티드를 수득하기 위한 연질 절단: 서열식별번호: 8의 펩티드를 DCM 중 3% TFA (20 부피) 중에 용해시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 1 당량의 피리딘으로 중화시킨 다음, 물로 세척하였다. 유기 층을 진공 하에 농축시켜 서열식별번호: 7의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1497.7 (M+H+).
실시예 21
tert-부틸 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노-2-옥소-에톡시)에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부톡시]-2-메톡시-페닐]메톡시]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-tert-부톡시카르보닐-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코사노에이트 [지방산 측쇄-HMPB-(AEEA)10-NH2]의 제조
방법 1 [커플링 순서 - (AEEA)2, γ-Glu, 지방산]: DMSO (11 mL) 중 Fmoc-(AEEA)2-OH (4.493 g, 8.469 mmol) 및 DMAP (51.7 mg, 0.423 mmol)의 용액에 DIC (1.33 mL, 8.469 mmol)를 첨가하고, 5분 동안 정치시켰다. 용액에 HMPB-(AEEA)10-NH2 (2.823 mmol)를 첨가하고, 이를 DMSO (3 mL)로 헹구었다. 반응 용액을 2시간 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (45 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 새로운 MTBE (45 mL)를 첨가한 다음, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, EtOAc (45 mL)를 첨가한 다음, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 경사분리하여 오일 침전물을 수득하였다. 30% 피페리딘/DMF (8 mL)를 오일 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합한 후, 이어서 MTBE (45 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 새로운 MTBE (45 mL)를 첨가한 다음, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 경사분리하여, 오일 침전물을 남겼다.
DMSO (9 mL) 중 Fmoc-Glu-OtBu (1.201 g, 2.823 mmol) 및 PyBOP (1.469 g, 2.823 mmol)의 용액에 DIEA (0.983 mL, 5.64 mmol)를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 숙성시킨 다음, 오일 침전물에 첨가하고, 30분 동안 혼합하였다. MTBE (45 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 새로운 MTBE (45 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, EtOAc (45 mL)를 첨가한 다음, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 다시 경사분리하여, 오일 침전물을 남겼다. 30% 피페리딘/DMF (8 mL)를 오일 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합한 후, 이어서 MTBE (45 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 새로운 MTBE (45 mL)를 첨가한 다음, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 경사분리하여, 오일 침전물을 남겼다.
DMSO:톨루엔 (9:1, 10 mL) 중 20-tert-부톡시-20-옥소-이코산산 (1.13 g, 2.83 mmol, 1.0 당량) 및 DEPBT (844.7 mg, 2.823 mmol, 1.0 당량)의 용액에 DIEA (0.983 mL, 5.64 mmol, 2.0 당량)를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 숙성시킨 다음, 오일 침전물에 첨가하고, 30분 동안 혼합하였다. MTBE (45 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 새로운 MTBE (45 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 경사분리하고, EtOAc (45 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 폐기하여 표제 화합물을 오일 침전물로서 남겼다. ESMS m/z 1274.10 (M+2H+/2).
방법 2 [커플링 순서 - (AEEA)2, γ-Glu-지방산의 숙신이미딜 에스테르]: Fmoc-(AEEA)2-OH를 동일한 규모로 상기 기재된 바와 같이 HMPB-(AEEA)10-NH2에 커플링시켰다. 30% 피페리딘/DMF의 용액 (3 mL)을 Fmoc-(AEEA)2-HMPB-(AEEA)10-NH2의 오일에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. MTBE (40 mL 총 부피)를 반응물에 첨가하고, 혼합물을 원심분리하였다 (3000 rpm x 2분). MTBE를 경사분리하고, DMSO (2 mL)를 오일에 첨가하여 이를 용해시켰다. 새로운 MTBE (40 mL 총 부피)를 첨가하고, 혼합물을 1회 더 원심분리하고, MTBE 층을 경사분리하였다. O1-tert-부틸 O5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) (2S)-2-[(20-tert-부톡시-20-옥소-이코사노일)아미노]펜탄디오에이트 (5.76 g, 8.46 mmol)를 DMSO:톨루엔의 혼합물 (9:1 비, DMSO 5.4 mL + 톨루엔 0.6 mL) 중에 용해시켰다. DIEA (3 mL, 16.92 mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 5분 동안 정치시켜 예비-활성화시켰다. 혼합물을 원심분리 튜브 내의 AEEA2-HMPB-(AEEA)10-NH2 (2.82 mmol)에 30분 동안 첨가하였다. MTBE (40 mL 총 부피)를 첨가하고, 혼합물을 원심분리하였다 (3000 rpm x 2분). MTBE 층을 제거하고, 새로운 MTBE (40 mL 총 부피)를 첨가하고, 혼합물을 1회 더 원심분리하였다. 상청액을 폐기하여, 표제 화합물을 오일로서 남겼다. ESMS m/z 1273.70 (M+2H+/2).
실시예 22
연질 절단 방법에 의한 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-부톡시-4-[(20-tert-부톡시-20-옥소-이코사노일)아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세트산 [지방산 측쇄]의 제조
지방산 측쇄-HMPB-(AEEA)10-NH2 (실시예 21에서 제조됨, 2500 mg)를 2% TFA/톨루엔 용액 (10 부피, 25 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 혼합한 다음, 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 피리딘 (TFA와 등몰)으로 중화시켰다. 나머지 유성 침전물에 MTBE (25 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 새로운 MTBE (25 mL)를 오일에 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 5분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 수집하여 오일 침전물을 수득하였다. 절단 및 세척을 2회 더 반복하였다. 유기부를 포화 수성 NaCl 및 물로 세척하고, 이어서 합한 유기부를 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다. ESMS m/z 874 (M+H+). 조 생성물을 UPLC-CAD [칼럼: 워터스 CSH™ C18 150 x 2.1 mm, 1.7 μm; 칼럼 온도: 50℃; 구배 - 21분 실행에 걸쳐 30에서 90% 용매 B:용매 A; 유량 - 0.5 mL/분; 용매 A: 물 중 0.2% TFA; 용매 B: 아세토니트릴; 검출기: 포토다이오드 어레이 UV, CAD]를 사용하여 분석하였다. 조 생성물은 61.71%의 순도를 나타냈다.
실시예 23
tert-부틸 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노-2-옥소-에톡시)에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-4-옥소-부톡시]-2-메톡시-페닐]메톡시]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-tert-부톡시카르보닐-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코사노에이트 [지방산 측쇄-HMPB-(AEEA)6-NH2]의 제조
DMSO (4 mL) 중 Fmoc-AEEA-OH (1156 mg, 3 mmol) 및 DMAP (18.4 mg, 0.149 mmol)의 용액에 DIC (0.47 mL, 3 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 정치시켜 활성화시킨 다음, HMPB-(AEEA)6-NH2 (1 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 진탕기에 두고, 2시간 동안 혼합하였다. MTBE (40 mL 총 부피)를 첨가하여 오일 유출을 유도하고, 혼합물을 원심분리하였다 (3000 rpm x 2분). MTBE 층을 폐기하고, 새로운 MTBE (40 mL 총 부피)를 첨가하였다. 혼합물을 1회 더 원심분리하고, MTBE를 폐기하였다. 생성된 오일에 30% 피페리딘/DMF (3 mL)를 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. 이어서, MTBE (40 mL 총 부피)를 첨가하고, 혼합물을 원심분리하였다 (3000 rpm x 2분). MTBE 층을 경사분리하고, DMSO (2 mL)를 오일에 첨가하여 이를 용해시키고, 새로운 MTBE (40 mL 총 부피)를 첨가하였다. 혼합물을 1회 더 원심분리하고, MTBE 층을 경사분리하였다. Fmoc-AEEA-OH (1156 mg, 3 mmol) 및 PyOxim (1598.1 mg, 3 mmol)의 용액을 DMSO (4 mL) 중에 용해시켰다. DIEA (1 mL, 6 mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 예비활성화를 위해 5분 동안 정치시켰다. 혼합물을 원심분리 튜브에서 AEEA-HMPB-(AEEA)6-NH2 (1 mmol)에 첨가하고, 30분 동안 혼합되도록 하였다. 30% 피페리딘/DMF (3 mL)를 사용한 Fmoc 제거 및 MTBE 세척을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. O1-tert-부틸 O5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) (2S)-2-[(20-tert-부톡시-20-옥소-이코사노일)아미노]펜탄디오에이트 (2040 mg, 3 mmol)를 DMSO:톨루엔의 혼합물 (9:1 비, DMSO 2.7 mL + 톨루엔 0.3 mL) 중에 용해시켰다. DIEA (1 mL, 6 mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 예비활성화를 위해 5분 동안 정치시켰다. 혼합물을 원심분리 튜브 내의 AEEA2-HMPB-(AEEA)6-NH2 (1 mmol)에 30분 동안 첨가하였다. 이어서, MTBE 세척을 반복하여 오일 형성을 유도하였다. MTBE를 폐기하여, 표제 화합물을 오일 침전물로서 남겼다. ESMS m/z 1966.3 (M+H+).
실시예 24
tert-부틸 20-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노-2-옥소-에톡시)에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]페닐]메톡시]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]에톡시]에틸아미노]-1-tert-부톡시카르보닐-4-옥소-부틸]아미노]-20-옥소-이코사노에이트 [지방산 측쇄-HMPA-(AEEA)10-NH2]의 제조
DMSO (4 mL) 중 Fmoc-(AEEA)-OH (578 mg, 1.50 mmol) 및 DMAP (9.2 mg, 0.075 mmol)의 용액에 DIC (0.235 mL, 1.50 mmol)를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 숙성시킨 다음, HMPA-(AEEA)10-NH2 (0.500 mmol)에 첨가하고, 2시간 동안 혼합하였다. MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 새로운 MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 다시 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 제2 커플링 사이클을 Fmoc-(AEEA)-OH를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행하고, 2시간 후, 이어서 MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 새로운 MTBE (14 mL)를 첨가하고, 다시 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하여 오일 침전물을 수득하였다. 30% 피페리딘/DMF (3 mL)를 오일 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 오일 침전물을 DMSO 1 mL에 녹이고, 새로운 MTBE (14 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 다시 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 경사분리하여 유성 침전물을 수득하였다.
DMSO (4 mL) 중 Fmoc-AEEA-OH (586 mg, 1.5 mmol) 및 PyOxim (791 mg, 1.5 mmol)의 용액에 DIEA (0.523 mL, 3.0 mmol)를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 숙성시킨 다음, 상기 수득된 유성 침전물에 첨가하고, 30분 동안 혼합하였다. MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 새로운 MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 1회 더 원심분리하였다. 상청액을 폐기하여 유성 침전물을 수득하였다. 30% 피페리딘/DMF (3 ml)를 오일 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 폐기하였다. 새로운 MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 다시 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하여 (AEEA)2-HMPA-(AEEA)10-NH2 유성 침전물을 수득하였다.
Fmoc-AEEA-OH의 제2 커플링과 유사한 방식으로, Fmoc-Glu-OtBu를 (AEEA)2-HMPA-(AEEA)10-NH2 상에 커플링시키고, 이어서 MTBE 첨가 및 원심분리하고, 이어서 DMF 중 30% 피페리딘으로 탈보호하고, 이어서 MTBE 첨가 및 원심분리하여 Fmoc-γGlu-(AEEA)2-HMPA-(AEEA)10-NH2를 유성 침전물로서 수득하였다.
DMSO (4 mL) 중 20-(tert-부톡시)-20-옥소이코산산 (600 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량) 및 PyBOP (781 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량)의 용액에 DIEA (0.523 mL, 3.0 mmol, 6.0 당량)를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 숙성시키고, 그 시간 동안 활성화된 에스테르가 침전되어, 톨루엔 (8 mL)을 첨가한 다음, 추가로 5분 동안 숙성시켰다. 용액을 Fmoc-γGlu-(AEEA)2-HMPA-(AEEA)10-NH2에 첨가하고, 1시간 동안 혼합하였다 (반응 혼합물의 완전한 용해는 달성되지 않았음). MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 새로운 MTBE (14 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 폐기하여 표제 화합물을 오일로서 남겼다. ESMS m/z 2488.2 (M+H+); 1245.5 (M+2H+/2).
실시예 25 - HMPB-(AEEA)10-NH2 및 링커로부터의 "연질" 절단을 사용한 액체 상 펩티드 합성
HMPB-(AEEA)10-NH2 상에서의 아미노산 쇄의 연장: Fmoc-Ala-OH (1.9 g, 6 mmol) 및 DMAP (36.8 mg, 0.301 mmol)의 혼합물을 4 mL의 DMSO에 용해시켰다. DIC (0.93 mL, 6 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 예비활성화를 위해 5분 동안 정치시켰다. 이 혼합물을 HMPB-(AEEA)2-NH2에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. MTBE를 첨가하여 혼합물 부피를 40 mL로 만들고, 오일로서 침전하는 커플링 생성물 Fmoc-Ala-HMPB-(AEEA)2-NH2를 사용하여 상 변화를 유도하였다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 2분), MTBE 상청액을 경사분리하였다. 추가의 MTBE를 유성 침전물에 첨가하여 부피를 40 mL로 만들고, 혼합물을 원심분리하고, MTBE 상청액을 경사분리하였다. 커플링 절차를 Fmoc-Ala-OH로 2회 반복하여 완전한 커플링을 달성하였다.
DMF (3 mL) 중 30% 피페리딘의 용액을 생성된 유성 침전물에 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 진탕시켰다. 이어서, MTBE를 첨가하여 부피를 40 mL로 만들고, 오일이 침전되도록 하였다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 2분), 상청액을 경사분리하고, DMSO (1 mL)를 유성 침전물에 첨가하였다. MTBE를 첨가하여 부피를 40 mL로 만들고, 혼합물을 다시 원심분리하고, 상청액을 경사분리하여 유성 침전물을 남겼다.
아미노산 커플링 및 탈보호 단계를 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같이 반복하고, 먼저 (2S)-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-부톡시-4-[(20-tert-부톡시-20-옥소-이코사노일)아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산을 커플링시키고, 이어서 나머지 Fmoc-보호된 아미노산 (tBu로 보호된 아스파르트산 측쇄 -CO2H 기, 트리틸로 보호된 글루타민 측쇄 -NH2, 및 -Boc로 보호된 리신 -NH2)을 서열식별번호: 9에 주어진 바와 같이 C-말단에서 N-말단의 순서로 커플링시키고, PyOxim 대신에 DEPBT를 사용하고 각각의 커플링 절차에 대해 60분 동안 혼합하여 서열식별번호: 9의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1961.08 (M+2H+/2).
서열식별번호: 10의 펩티드를 수득하기 위한 연질 절단:
DCM (15 mL) 중 2% TFA 중 서열식별번호: 9의 펩티드 (0.38 mmol, 1.5 g)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 피리딘 (1 당량)을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 유기 층을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc로 세척한 다음, DCM 중에 다시 용해시키고, 진공 하에 농축시켜 서열식별번호: 10의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1125 (M+2H+/2).
조 생성물을 UPLC-MS [칼럼: 워터스 CSH™ C18 150 x 2.1 mm, 1.7 mm; 칼럼 온도: 50℃; 구배 - 21분 실행에 걸쳐 30에서 90% 용매 B:용매 A; 유량: 0.5 mL/분; 용매 A: 물 중 0.2% TFA; 용매 B: 아세토니트릴; 검출기: 포토다이오드 어레이 UV, ESMS]를 사용하여 분석하였다. 조 펩티드는 71.31%의 순도를 나타냈다.
실시예 26 - HMPB-(AEEA)10-NH2를 사용한 액체 상 펩티드 합성
서열식별번호: 11의 펩티드를 하기와 같이 액체 상 펩티드 합성을 사용하여 제조하였다.
Fmoc-Leu-OH (4.2 g, 12 mmol) 및 DMAP (73.6 mg, 0.602 mmol)의 혼합물을 DMSO (5 mL) 중에 용해시켰다. DIC (1.58 g, 1.96 mL, 12 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 예비활성화를 위해 5분 동안 정치시켰다. 혼합물을 HMPB-(AEEA)10-NH2 (4 mmol)에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. MTBE를 첨가하여 혼합물 부피를 40 mL로 만들고, 오일로서 침전하는 커플링 생성물 Fmoc-Leu-HMPB-(AEEA)2-NH2를 사용하여 상 변화를 유도하였다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), MTBE 상청액을 경사분리하였다. 추가의 MTBE를 유성 침전물에 첨가하여 부피를 40 mL로 만들고, 혼합물을 원심분리하고, MTBE 상청액을 경사분리하였다. 커플링 절차를 Fmoc-Leu-OH로 2회 반복하여 완전한 커플링을 달성하였다.
DMF (3 mL) 중 30% 피페리딘의 용액을 생성된 유성 침전물에 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 진탕시켰다. 이어서, MTBE를 첨가하여 부피를 40 mL로 만들고, 오일이 침전되도록 하였다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), 상청액을 경사분리하고, DMSO (1 mL)를 유성 침전물에 첨가하였다. MTBE를 첨가하여 부피를 40 mL로 만들고, 혼합물을 다시 원심분리하고, 상청액을 경사분리하여 유성 침전물을 남겼다.
후속 아미노산 커플링 및 탈보호 단계를 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같이 반복하고, Fmoc-보호된 아미노산 (-OH 및 tBu로 보호된 -CO2H 측쇄 기)을 서열식별번호: 11에 주어진 바와 같이 C-말단에서 N-말단의 순서로 커플링하여 서열식별번호: 11의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1893 (M+2H+/2), 1262 (M+3H+/3).
실시예 27 - 사량체 펩티드의 액체 상 합성 및 HMPB-기반 링커로부터의 "연질" 절단
HMPB-(AEEA)10-NH2 상에서의 사량체 펩티드 제조: 서열식별번호: 12의 펩티드를 하기의 변화와 함께 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같이 제조하였다: 제1 아미노산 (Fmoc-Gly-OH)을 HMPB-(AEEA)10-NH2에 커플링시키고, Fmoc-Gly-OH, DIC 및 DMAP (3:3:0.15 몰비)를 DMSO에 용해시키고, 1분 동안 혼합한 후, HMPB-(AEEA)10-NH2에 첨가하였다. 2시간 후, MTBE (5 mL)를 첨가하여 상 분리를 개시하였다. 혼합물을 3250 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 제2 커플링 사이클을 Fmoc-Gly-OH를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행하고, 2시간 후, MTBE (5 mL)를 첨가하여 상 분리를 개시하였다. 혼합물을 3250 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. Fmoc 기를 30% 피페리딘/DMF를 사용하여 제거한 다음, 후속 커플링 및 탈보호를 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같이 수행하여 서열식별번호: 12의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 2360.1 (M+Na+), 2338.1 (M+H+), 1169.6 (M+2H+/2).
HMPB-(AEEA)10-NH2 링커로부터의 사량체 펩티드의 연질 절단:
2가지 방법을 사용하여 서열식별번호: 12의 펩티드를 "연질" 절단하여 서열식별번호: 13의 보호된 사량체 펩티드를 수득하였다:
Boc-Y(tBu)-Aib-E(tBu)-G-OH (서열식별번호: 13).
방법 1: 서열식별번호: 12의 펩티드에 5% TFA/DCM 용액 (10 부피)을 첨가하였다. 30분 후, 용액을 피리딘으로 중화시키고, 10% NaCl 용액으로 2회 세척하였다. 유기부를 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 최소량의 DMF 중에 용해시키고, 물 (3 부피)로 희석하였다. 혼합물을 MTBE로 3회 추출하고, 합한 유기부를 감압 하에 농축시켜 서열식별번호: 13의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 687.4 (M+Na+), 665.4 (M+H+).
방법 2: 서열식별번호: 12의 펩티드에 2% TFA/톨루엔 용액 (10 부피)을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 혼합한 다음, 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 피리딘 (TFA에 대해 등몰)으로 중화시켰다. 나머지 유성 침전물에 MTBE (3 mL)를 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 새로운 MTBE (3 mL)를 오일에 첨가하고, 혼합물을 3000 rpm에서 5분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 수집하여 오일 침전물을 수득하였다. 절단 및 세척을 오일 침전물 상에서 2회 더 반복하였다. 합한 유기 상청액 혼합물을 포화 수용액 NaCl 및 물로 세척한 다음, 합한 유기부를 감압 하에 농축시켜 서열식별번호: 13의 펩티드를 수득하였다.
HMPB-(AEEA)4-NH2 상에서의 사량체 펩티드 제조: HMPB-(AEEA)4-NH2를 사용하여 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 서열식별번호: 14의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1488.7 (M+Na+).
HMPB-(AEEA)4-NH2 링커로부터의 사량체 펩티드의 연질 절단: 서열식별번호: 14의 펩티드에 3% TFA/DCM 용액 (20 부피)을 첨가하였다. 30분 후, 용액을 피리딘으로 중화시키고, 물로 2회 세척하였다. 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 서열식별번호: 13의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 687.4 (M+Na+), 665.4 (M+H+).
HMPB-(AEEA)2-NH2 상에서의 사량체 펩티드 제조: HMPB-(AEEA)2-NH2를 사용하여 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 서열식별번호: 15의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1198.5 (M+Na+).
HMPB-(AEEA)6-NH2 상에서의 사량체 펩티드 제조: HMPB-(AEEA)6-NH2를 사용하여 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 서열식별번호: 16의 펩티드를 수득하였다. ESMS m/z 1778.8 (M+Na+).
실시예 28 - 사량체 펩티드의 액체 상 합성 및 HMPA-기반 링커로부터의 "연질" 절단
HMPA-(AEEA)10-NH2 상에서의 사량체 펩티드 제조: DMF (1 mL) 내의 Fmoc-Gly-OH (140 mg, 0.470891 mmol)의 용액에 DIC (60 mg, 0.47 mmol) 및 2,4,6-트리메틸피리딘 (0.125 mL, 0.945 mmol)을 첨가하였다. 이 용액을 HMPA-(AEEA)10-NH2 (256 mg, 0.15679 mmol)에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. MTBE (20 mL)를 여기에 첨가하고, 생성된 혼합물을 원심분리하였다 (5000 rpm x 3분). 상청액을 경사분리하고, 추출 MTBE 세척을 3회 더 수행하고, 매회 경사분리에 의해 상청액으로부터 하부 오일 층을 분리하였다. 상기 커플링 및 세척 과정을 3회 반복하였다. 반응을 완결시키기 위함. 침강 오일 층을 DMF 중 25% 피페리딘 (2 mL)과 20분 동안 혼합하였다. 이를 MTBE (20 mL)로 세척하고, 상기 기재된 바와 유사한 방식으로 3회 원심분리하여 하부 오일 층을 남겼다.
DMSO (750 μL) 및 아세토니트릴 (750 μL) 중 Fmoc-Glu(OtBu)-OH (90.74 mg, 0.2111 mmol) 및 PyOxim (112.5 mg, 0.2111 mmol)의 용액에 DIEA (74 μL, 0.424 mmol)를 첨가하고, 용액을 2분 동안 혼합하였다. 이 용액을 상기 오일 침전물 (0.180 g, 0.107 mmol)에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (20 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), 상청액을 경사분리하였다. 이 추출 세척을 2회 수행하고, 상청액을 경사분리하여 매회 하부 오일 층으로부터 분리하였다. 10% 피페리딘/DMF (2 mL)를 오일 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. 이를 MTBE (20 mL)로 세척하고, 상기 기재된 바와 유사한 방식으로 2회 원심분리하여 하부 오일 층을 남겼다.
DMSO (750 μL) 중 Fmoc-Aib-OH (68.4 mg, 0.210 mmol) 및 PyOxim (110.8 mg, 0.2080 mmol)의 용액에 DIPEA (55.05 μL, 0.316 mmol)를 첨가하였다. 용액을 2분 동안 혼합하고, 상기 오일 층 (0.197 g, 0.105 mmol)에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합되도록 하고, 이어서 MTBE (20 mL)를 첨가하여 오일을 침전시켰다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), 상청액을 경사분리하였다. 이 추출 세척을 2회 수행하고, 매회 경사분리에 의해 상청액으로부터 하부 오일 층을 분리하였다. 10% 피페리딘/DMF (2 mL)를 유성 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. 이를 유사하게 MTBE (20 mL)로 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 2회 원심분리하여 하부 오일 층을 남겼다.
DMSO (750 μL) 및 아세토니트릴 (750 μL) 중 Boc-Tyr(tBu)-OH (106.4 mg, 0.3153 mmol) 및 PyOxim (166.3 mg, 0.3153 mmol)의 용액에 DIEA (91 μL, 0.316 mmol)를 첨가하였다. 용액을 2분 동안 혼합하고, 상기 오일 층 (201.0 mg, 0.1026 mmol)에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합되도록 하고, 이어서 MTBE (20 mL)를 첨가하여 오일을 침전시켰다. 혼합물을 원심분리하였다 (3000 rpm x 3분). 이 추출 세척을 2회 수행하고, 매회 경사분리에 의해 상청액으로부터 하부 오일 층을 분리하였다. 상기 커플링 및 세척 과정을 4회 수행하여 반응을 완결시켜 서열식별번호: 17의 펩티드를 오일로서 수득하였다. ESMS m/z 2279.10 (M+H+); 1140.20 (M+2H+/2).
HMPA-(AEEA)10-NH2 링커로부터의 사량체 펩티드의 연질 절단: 서열식별번호: 17의 펩티드 (102.3 mg, 0.04488 mmol)에 1% TFA (DCM 중) (1.22 mL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 피리딘 (10.6 mg, 0.134 mmol)을 생성된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 물 (4.5 mL)로 세척한 다음, 유기 층을 수집하고, 농축시켜 서열식별번호: 13의 펩티드를 오일로서 수득하였으며; LCMS는 반응이 출발 물질로부터 생성물로의 33% 전환으로 진행되었다는 것을 나타냈다. ESMS m/z 665.40 (M+H+); 687.30 (M+Na+).
HMPA-(AEEA)10-NH2 상에서의 사량체 펩티드 제조:
DMSO (2.5 mL) 중 Fmoc-Gly-OH (522.5 mg, 1.757 mmol)의 용액에 EDC (249.7 mg, 1.609 mmol) 및 에틸 시아노글리옥실레이트-2-옥심 (272.4 mg, 1.898 mmol)을 첨가하였다. 이 용액을 HMPA-(AEEA)2 (0.4143 g, 0.8787 mmol)에 첨가하고, 용액을 실온에서 2시간 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (30 mL)를 첨가하여 오일을 침전시켰다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), 상청액을 경사분리하였다. 이 추출 세척을 3회 수행하고, 매회 경사분리에 의해 상청액으로부터 하부 오일 층을 분리하였다. 상기 커플링 및 세척 과정을 3회 반복하여 반응을 완결시켰다. 침강 오일 층을 DMF (2 mL) 중 10% 피페리딘과 20분 동안 혼합하였다. 이를 MTBE (20 mL)로 세척하고, 상기 기재된 바와 유사한 방식으로 원심분리하였다. 후자의 Fmoc 제거 단계를 한번 더 수행하여 하부 오일 층을 수득하였다.
DMSO (3 mL) 및 아세토니트릴 (1 mL) 중 Fmoc-Glu(OtBu)-OH (0.842 g, 1.980 mmol) 및 PyOxim (1.055 g, 1.980 mmol)의 용액에 DIEA (0.516 g, 4.01 mmol)를 첨가하고, 용액을 1분 동안 혼합하였다. 이 용액을 상기 오일 침전물 (0.504 g, 0.954 mmol)에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (40 mL)를 첨가하여 오일을 침전시켰다. 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), 상청액을 경사분리하였다. 이 추출 세척을 2회 수행하고, 상청액을 경사분리하여 매회 하부 오일 층으로부터 분리하였다. 커플링 및 세척 단계를 1회 더 반복하였다. 10% 피페리딘/DMF (2 mL)를 오일 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. 이를 상기 기재된 바와 유사한 방식으로 세척하여 하부 오일 층을 남겼다.
DMSO (3 mL) 및 아세토니트릴 (1 mL) 중 Fmoc-Aib-OH (970 mg, 2.98 mmol) 및 PyOxim (1.57 g, 2.92 mmol)의 용액에 DIEA (782 μL, 4.48 mmol)를 첨가하고, 용액을 1분 동안 혼합하였다. 이 용액을 상기 오일 침전물 (1.001 g, 1.402 mmol)에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 혼합한 다음, 혼합물을 MTBE로 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 10% 피페리딘/DMF (2 mL)를 오일 침전물에 첨가하고, 15분 동안 혼합하였다. 혼합물을 MTBE로 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 후자의 Fmoc- 제거 단계를 한번 더 수행하여 하부 오일 층을 수득하였다.
DMSO (3 mL) 및 아세토니트릴 (1 mL) 중 Boc-Tyr(tBu)-OH (1.63 g, 4.83 mmol) 및 PyOxim (2.55 g, 4.74 mmol)의 용액에 DIEA (1.13 mL, 6.48 mmol)를 첨가하고, 용액을 1분 동안 혼합하였다. 이 용액을 상기 오일 침전물 (1.289 g, 1.613 mmol)에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 혼합한 다음, 이를 MTBE로 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 커플링 및 MTBE 세척 단계를 1회 더 반복하여 서열식별번호: 18의 펩티드를 오일로서 수득하였다. ESMS m/z 1118.50 (M+H+); 1140.50 (M+Na+).
HMPA-(AEEA)2-NH2 링커로부터의 사량체 펩티드의 연질 절단: 서열식별번호: 18의 펩티드 (50 mg, 0.045 mmol)에 DCM (0.8 mL) 중 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (200 μL, 1.91 mmol)의 혼합물을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. ACN (2 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. ACN 첨가 및 농축 단계를 2회 반복하였다. 잔류물을 상기 조건 (1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 및 DCM 중에서 20분 동안 교반하고, 이어서 ACN을 첨가하고, 농축시킴)으로 2회 처리하여 서열식별번호: 13의 펩티드를 오일로서 수득하였으며; LCMS는 반응이 출발 물질로부터 생성물로의 8% 전환으로 진행되었다는 것을 나타냈다. ESMS m/z 664.40 (M+).
실시예 29 - 링크 링커-(AEEA)6-NH2를 사용한 서열식별번호: 22의 펩티드의 액체-상 단편-기반 제조
액체-상 단편-기반 접근법을 통한 서열식별번호: 22의 펩티드의 합성이 본원에 기재된다.
링크-(AEEA)6-NH2 상에서의 서열식별번호: 19의 펩티드의 제조: 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, Fmoc-Ser(tBu)-OH를 0.05 mmol의 링크-(AEEA)6-NH2 상에 커플링시키는 것으로 출발하여, Fmoc 탈보호로 이어지는 액체 상 펩티드 합성에 의해 서열식별번호: 19의 펩티드를 수득하였다. 나머지 Fmoc-보호된 아미노산 (tBu로 보호된 측쇄 -OH 기)을 서열식별번호: 19에 주어진 바와 같이 C-말단에서 N-말단으로의 순서로 커플링/탈보호하였다.
ESMS m/z 1095.7 (M+2H+/2), 731.0 (M+3H+/3).
서열식별번호: 19의 펩티드 상에서의 서열식별번호: 7의 펩티드의 커플링: 반응 용매로서 DMSO를 사용하여, 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같은 커플링 절차를 이용하여 서열식별번호: 7의 펩티드를 서열식별번호: 19의 펩티드 상에 커플링시켜 서열식별번호: 20의 펩티드를 수득하였다. 반응물을 1분 반응 시간 후에 샘플링하고, LCMS에 의해 분석하였으며, 이는 반응이 완결되었다는 것을 나타냈다.
ESMS m/z 1835.90 (M+2H+/2), 1224.20 (M+3H+/3). 반응 용매로서 DMSO를 사용하여, 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같은 탈보호 절차를 사용하여 N-말단 Fmoc 기를 서열식별번호: 20의 펩티드로부터 제거하여 서열식별번호: 21의 펩티드를 수득하였다:
ESMS m/z 1724.9 (M+2H+/2), 1150.20 (M+3H+/3)
서열식별번호: 21의 펩티드 상에서의 서열식별번호: 10의 펩티드의 커플링: 반응 용매로서 DMSO를 사용하여, 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같은 커플링 절차를 사용하여 서열식별번호: 10의 펩티드 (0.06 mmol)를 서열식별번호: 21의 펩티드 상에 커플링시킨 다음, DMSO 중 30% 피페리딘을 사용하여, 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같은 탈보호 절차를 사용하여 Fmoc 기를 제거하여 서열식별번호: 22의 펩티드를 수득하였다.
ESMS m/z = 1820.1 (M+3H+/3), 1365.3 (M+4H+/4).
실시예 30
단편-기반 접근법을 사용한 링크-(AEEA)10-NH2를 갖는 서열식별번호: 23의 펩티드의 제조
DMSO (2 mL) 중 Fmoc-P-P-P-S(tBu)-OH (서열식별번호: 24, 0.2291 g, 0.3395 mmol)의 용액에 PyBOP (0.1781 g, 0.3422 mmol) 및 DIEA (54.186 μL, 0.311 mmol)를 첨가하였다. 이를 1분 동안 혼합하고, 링크-(AEEA)10-NH2 (0.500 g, 0.338 mmol)에 첨가하고, 60분 동안 혼합하고, 이어서 MTBE (12 mL)를 첨가하여 유성 침전물을 수득하였다. 혼합물을 실온에서 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), 상청액을 경사분리하였다. 이 세척을 1회 더 반복하였다. 유성 침전물을 유사한 방식으로 이소프로필 아세테이트 (2회, 매회 10 mL)로 세척하였다. 커플링을 2회 더 반복하였다. 오일 층을 DMF (2 mL) 중 20% 피페리딘과 20분 동안 혼합하고, 유사한 방식으로 MTBE (12 mL) 및 이소프로필 아세테이트로 세척하여 유성 침전물을 수득하였다.
DMSO (2 mL) 중 Fmoc-S(tBu)-S(tBu)-G-A-OH (서열식별번호: 25, 0.2262 g, 0.3454 mmol)의 용액에 PyBOP (0.180 g, 0.346 mmol) 및 DIEA (60.34 μL, 0.346 mmol)를 첨가하였다. 용액을 1분 동안 혼합한 다음, 이전 단계로부터의 유성 침전물 (0.5073 g, 0.2303 mmol)에 첨가하고, 60분 동안 혼합하였다. MTBE (12 mL)를 첨가하여, 오일을 침전시키고, 혼합물을 원심분리하고 (3000 rpm x 3분), 상청액을 경사분리하였다. 유성 침전물을 상기 기재된 바와 같이 MTBE 및 이소프로필 아세테이트로 2회 세척하였다. 커플링 반응을 2회 더 반복하였다. 오일 층을 DMF (2 mL) 중 20% 피페리딘과 20분 동안 혼합하고, 침전시키고, 유사한 방식으로 MTBE (12 mL) 및 이소프로필 아세테이트로 세척/원심분리하여 유성 침전물을 수득하였다.
본질적으로 이전 커플링 및 탈보호에 대해 기재된 바와 같은 방식으로, 하기를 이전 단계에서 단리된 유성 침전물 상에 순차적으로 커플링시켰다:
1. Fmoc-A-G-G-P-OH (서열식별번호: 26),
2. Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-L-I-OH (서열식별번호: 27),
3. 
4. Fmoc-K-I-A-Q(Trt)-OH (서열식별번호: 29)
5. Fmoc-I-Aib-L-D(tBu)-OH (서열식별번호: 30)
6. Fmoc-S(tBu)-D(tBu)-Y(tBu)-S(tBu)-OH (서열식별번호: 31)
서열식별번호: 31의 펩티드를 커플링시킨 후, 피페리딘/DMF 탈보호 단계를 수행하고, MTBE/이소프로필 아세테이트 세척/원심분리 절차 후에 서열식별번호: 23의 펩티드를 오일로서 수득하였다. ESMS m/z 1756.50 (M+4H+/4).
서열 목록
Claims (50)
- 하기 화학식의 화합물:
여기서 "m"은 0 내지 20이고, "n"은 1 내지 50이고, "Z"는 링커 화합물이다. - 제1항에 있어서, Z가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
.
- 제2항에 있어서,
인 화합물.
- 제2항에 있어서,
인 화합물.
- 제2항에 있어서,
인 화합물.
- 제2항에 있어서,
인 화합물.
- 제2항에 있어서,
인 화합물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, "m"이 0, 1, 2, 또는 3이고, "n"이 1 내지 50인 화합물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, "m"이 0, 1, 2, 또는 3이고, "n"이 1 내지 10인 화합물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, "m"이 1이고, "n"이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10인 화합물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 상 합성에 사용되는 화합물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 상 합성이 액체 상 펩티드 합성 (LPPS)인 화합물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성인 화합물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, "Z"가 임의로 보호된 아미노산에 공유 결합을 형성하는 관능기이고, 이는 다시 하나 이상의 임의로 보호된 아미노산 또는 펩티드에 대한 반복 탈보호 및 커플링 단계를 겪을 수 있고, 이어서 생성된 폴리펩티드 생성물은 화학적 변환을 통해 "Z" 기로부터 유리될 수 있는 것인 화합물.
- 서열식별번호: 1의 펩티드.
- 액체-상 펩티드 합성을 사용하여 서열식별번호: 1의 펩티드를 제조한 다음, 제조된 서열식별번호: 1의 펩티드를 산으로 처리하여 서열식별번호: 2의 펩티드를 수득하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 2의 펩티드의 제조 방법.
- 서열식별번호: 3의 펩티드.
- 액체-상 펩티드 합성을 사용하여 서열식별번호: 3의 펩티드를 제조한 다음, 제조된 서열식별번호: 3의 펩티드를 산으로 처리하여 서열식별번호: 4의 펩티드를 수득하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 4의 펩티드의 제조 방법.
- 서열식별번호: 5의 펩티드.
- 서열식별번호: 6의 펩티드.
- 액체-상 펩티드 합성을 사용하여 서열식별번호: 6의 펩티드를 제조한 다음, 제조된 서열식별번호: 6의 펩티드를 산으로 처리하여 서열식별번호: 7의 펩티드를 수득하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 7의 펩티드의 제조 방법.
- 서열식별번호: 8의 펩티드.
- 서열식별번호: 9의 펩티드.
- 액체-상 펩티드 합성을 사용하여 서열식별번호: 9의 펩티드를 제조한 다음, 제조된 서열식별번호: 1의 펩티드를 산으로 처리하여 서열식별번호: 10의 펩티드를 수득하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 10의 펩티드의 제조 방법.
- 서열식별번호: 11의 펩티드.
- 서열식별번호: 12의 펩티드.
- 서열식별번호: 14의 펩티드.
- 서열식별번호: 15의 펩티드.
- 서열식별번호: 16의 펩티드.
- 서열식별번호: 17의 펩티드.
- 서열식별번호: 18의 펩티드.
- 액체-상 펩티드 합성을 사용하여 서열식별번호: 11, 12, 14, 15, 16, 17, 또는 18의 펩티드를 제조한 다음, 제조된 서열식별번호: 11, 12, 14, 15, 16, 17, 또는 18의 펩티드를 산으로 처리하여 서열식별번호: 13의 펩티드를 수득하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 13의 펩티드의 제조 방법.
- 서열식별번호: 19의 펩티드.
- 서열식별번호: 20의 펩티드.
- 서열식별번호: 21의 펩티드.
- 서열식별번호: 22의 펩티드.
- 서열식별번호: 23의 펩티드.
- 액체 상 합성을 사용하여 화합물을 제조하는 것을 포함하고, 여기서 액체 상 합성은 AEEA 함유 분자를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물에 커플링시키는 것을 포함하는 것인, 하기 화학식의 화합물을 제조하는 방법:
.
- 제38항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a. Fmoc-AEEA-OH를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 링커 화합물 상에 커플링시키고, 생성된 생성물을 염기를 사용하여 탈보호시키는 단계;
b. 제2 Fmoc-AEEA-OH를 단계 a.로부터의 생성물 상에 커플링시키고, 생성된 생성물을 염기를 사용하여 탈보호시키는 단계;
c. Fmoc-Glu-OtBu를 단계 b.의 생성물 상에 커플링시키고, 생성된 생성물을 염기를 사용하여 탈보호시키는 단계;
d. 20-(tert-부톡시)-20-옥소이코산산을 단계 c.의 생성물 상에 커플링시키는 단계; 및
e. 단계 d.의 생성물로부터 링커 화합물을 산으로 제거하는 단계. - 제38항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a. Fmoc-(AEEA)2-OH를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 링커 화합물 상에 커플링시키고, 생성된 생성물을 염기를 사용하여 탈보호시키는 단계;
b. Fmoc-Glu-OtBu를 단계 a.의 생성물 상에 커플링시키고, 생성된 생성물을 염기를 사용하여 탈보호시키는 단계;
c. 20-(tert-부톡시)-20-옥소이코산산을 단계 b.의 생성된 생성물 상에 커플링시키는 단계; 및
d. 단계 c.의 생성물로부터 링커 화합물을 산으로 제거하는 단계. - 제38항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a. Fmoc-(AEEA)2-OH를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 링커 화합물 상에 커플링시키고, 생성된 생성물을 염기를 사용하여 탈보호시키는 단계;
b. O1-tert-부틸 O5-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) (2S)-2-[(20-tert-부톡시-20-옥소-이코사노일)아미노]펜탄디오에이트를 단계 a.의 생성된 생성물 상에 커플링시키는 단계; 및
c. 단계 b.의 생성물로부터 링커 화합물을 산으로 제거하는 단계. - 인 화합물.
- 인 화합물.
- 인 화합물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 사용하여 액체-상 펩티드 합성에 의해 펩티드 서열의 일부 또는 전부를 제조하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 32의 펩티드를 제조하는 방법.
- 서열식별번호: 19의 펩티드를 서열식별번호: 7의 펩티드와 커플링시키는 것을 포함하는, 서열식별번호: 20의 펩티드를 제조하는 방법.
- 서열식별번호: 21의 펩티드를 서열식별번호: 10의 펩티드와 커플링시키는 것을 포함하는, 서열식별번호: 22의 펩티드를 제조하는 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 서열식별번호: 32의 펩티드를 제조하는 방법:
a. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 사용하여 액체-상 펩티드 합성에 의해 서열식별번호: 19의 펩티드를 제조하는 단계;
b. 서열식별번호: 19의 펩티드를 서열식별번호: 7의 펩티드에 커플링시켜 서열식별번호: 20의 펩티드를 생성하는 단계;
c. 서열식별번호: 20의 펩티드를 탈보호시켜 서열식별번호: 21의 펩티드를 생성하는 단계;
d. 서열식별번호: 10의 펩티드를 서열식별번호: 21의 펩티드에 커플링시키는 단계; 및
e. 단계 d.로부터의 펩티드를 탈보호시켜 서열식별번호: 22의 펩티드를 생성하는 단계. - 제48항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
f. 단계 e.로부터의 서열식별번호: 22의 펩티드를 개별 아미노산, 펩티드 단편 또는 그의 혼합물을 커플링시킴으로써 연장시키는 단계;
g. 생성된 펩티드를 산으로 처리하는 단계; 및
h. 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 서열식별번호: 32의 펩티드를 제조하는 방법:
a. 서열식별번호: 24의 펩티드를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화합물에 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계;
b. 단계 a.로부터의 펩티드를 서열식별번호: 25의 펩티드에 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계;
c. 단계 b.로부터의 펩티드를 서열식별번호: 26의 펩티드와 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계;
d. 단계 c.로부터의 펩티드를 서열식별번호: 27의 펩티드와 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계;
e. 단계 d.로부터의 펩티드를 서열식별번호: 28의 펩티드와 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계;
f. 단계 e.로부터의 펩티드를 서열식별번호: 29의 펩티드와 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계;
g. 단계 f.로부터의 펩티드를 서열식별번호: 30의 펩티드와 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계; 및
h. 단계 g.의 펩티드를 서열식별번호: 31의 펩티드와 커플링시키고, 생성된 펩티드를 탈보호시키는 단계.
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