JP2022545200A - インクレチン類似体を作製する方法 - Google Patents

インクレチン類似体を作製する方法 Download PDF

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Abstract

インクレチン類似体を作製するための中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩が開示される。さらに、ハイブリッド液相・固相合成またはネイティブケミカルライゲーションを介して本発明の中間体化合物のうちの２～４つをカップリングすることによって、インクレチン類似体を作製するための方法が開示される。【選択図】なし

Description

本開示は、広義には生物学、化学および医学に関し、より具体的には、ハイブリッド液相・固相合成（ＨＬＳＰＳ）を介して、１つ以上のグルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）およびグルカゴン（ＧＣＧ）受容体において活性を有するインクレチン類似体を合成する方法に関する。
過去数十年間、糖尿病の有病率は上昇し続けている。２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は、すべての糖尿病の約９０％を占める、糖尿病の最も一般的な形態である。Ｔ２ＤＭは、インスリン耐性によって引き起こされる高い血糖値を特徴とする。Ｔ２ＤＭの現在の標準的な治療法としては、食事療法および運動、ならびにＧＬＰ－１受容体アゴニスト、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１二重受容体アゴニスト、さらにはＧＩＰ／ＧＬＰ－１／ＧＣＧ（ＧＧＧ）三重受容体アゴニストなどのインクレチンベースの治療剤を含む、経口血糖降下療法剤、および／または注射可能な血糖降下療法剤による治療が挙げられる。
国際特許出願である国際公開第２０１９／１２５９３８号および第２０１９／１２５９２９号は、広義における、ＧＧＧ三重受容体アゴニストとして作用するインクレチン類似体および標準的な固相ペプチド合成を介するその合成方法を記載している。また、国際特許出願である国際公開第２０１４／０４９６１０号、第２０１５／０６７７１６号、第２０１６／１９８６２４号、第２０１７／１１６２０４号、第２０１７／１５３５７５号および第２０１８／１００１３５号を参照されたい。同様に、国際特許出願である国際公開第２０１３／１６４４８３号および第２０１６／１１１９７１号は、ＧＬＰ－１およびＧＩＰ活性を有するといわれる化合物を記載している。また、国際特許出願である国際公開第２０２０／０２３３８６号は、ＧＩＰおよびＧＬＰ１の受容体のアゴニスト活性を有するペプチドを記載している。
しかしながら、産業的に所望の純度で薬学的に好ましい製造を可能にするためには、かかるインクレチン類似体およびその中間体を製造する代替的方法が必要である。同様に、より少ない精製ステップでインクレチン類似体を効率的に提供するための、効率的な方法および安定な中間体が必要である。
このニーズに応えるために、本開示では、ＨＬＳＰＳまたはネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）を介した、インクレチン類似体を作製する方法を記載し、かかる方法では、中間体化合物のうち２～４つを使用してインクレチン類似体を作製する。
第１の実施形態では、インクレチン類似体は、アミノ酸配列：
ＹＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ１３ＬＤＫＸ１７ＡＸ１９Ｘ２０ＡＦＩＥＹＬＬＸ２８Ｘ２９ＧＰＳＳＸ３４ＡＰＰＰＳ、（式中、Ｘ２は、Ａｉｂであり、Ｘ１３は、ＬまたはαＭｅＬであり、Ｘ１７は、コンジュゲートに利用可能な官能基を有する任意のアミノ酸であり、官能基は、Ｃ１６－Ｃ２２脂肪酸にコンジュゲートされ、Ｘ１９は、ＱまたはＡであり、Ｘ２０は、Ａｉｂ、αＭｅＫ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ２８は、ＥまたはＡであり、Ｘ２９は、ＧまたはＡｉｂであり、Ｘ３４は、ＧまたはＡｉｂ（配列番号４）であり、Ｃ末端アミノ酸は、任意選択的にアミド化されている）、またはその薬学的に許容される塩を含むことができる。特定の例では、インクレチン類似体は、アミノ酸配列：
Ｙ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＩ（αＭｅＬ）ＬＤＫＫＡＱ（Ａｉｂ）ＡＦＩＥＹＬＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５）、（式中、Ｃ末端アミノ酸は任意選択的にアミド化されている）、またはその薬学的に許容される塩を有することができる。
いくつかの例では、Ｃ１６－Ｃ２２脂肪酸は、構造：
２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）ａ－（γＧｌｕ）ｂ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｃ－ＣＯ２Ｈ（式中、ａは０、１または２であり、ｂは１または２、ｃは１６または１８である）を有するリンカーを介して、インクレチン類似体に結合することができる。
特定の例では、インクレチン類似体は、以下の配列：
Ｙ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＩ（αＭｅＬ）ＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）－（γＧｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ（Ａｉｂ）ＡＦＩＥＹＬＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号６）、またはその薬学的に許容される塩を有することができ、これは、以下の構造を有するものとして描写することができる。
Figure 2022545200000001
ＨＬＳＰＳを介して配列番号６のインクレチン類似体を作製する方法に関して、方法は、４つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号７、８、９および１０に記載されるような構造、またはその薬学的に許容される塩を有する。
あるいは、方法は、４つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号７、１１、１２および１０に記載されるような構造、またはそれらの薬学的に許容される塩を有する。
あるいは、方法は、４つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号７、１３、１４および１０に記載されるような構造、またはそれらの薬学的に許容される塩を有する。
他の例では、方法は、３つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号７、１３および１５に記載されるような構造、またはその薬学的に許容される塩を有する。
あるいは、方法は、３つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号１６、１７および１０に記載されるような構造、またはそれらの薬学的に許容される塩を有する。
あるいは、方法は、３つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号１８、１２および１０に記載されるような構造、またはそれらの薬学的に許容される塩を有する。
あるいは、方法は、３つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号７、４５および１０に記載されるような構造、またはそれらの薬学的に許容される塩を有する。
あるいは、方法は、３つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号７、１１および２０に記載されるような構造、またはそれらの薬学的に許容される塩を有する。
他の例では、方法は、２つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号１９および１５に記載されるような構造、またはその薬学的に許容される塩を有する。
あるいは、方法は、２つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号１８および２０に記載されるような構造、またはその薬学的に許容される塩を有する。
上記の方法はまた、カップリングのステップの前に２～４つの中間体化合物を合成するステップを含むことができる。
したがって、上記の方法では、中間体化合物を、互いに化学的にカップリングまたは酵素的にカップリングすることにより、配列番号６のインクレチン類似体を得ることができる。
上記の方法では、Ｃ１６－Ｃ２２脂肪酸部分および任意選択のリンカーは、様々な中間体化合物を結合する前に１つの中間体化合物にカップリングさせることができる（すなわち、完全なインクレチン類似体合成の前にアシル化することができる）。あるいは、様々な中間体化合物をカップリングさせた後、脂肪酸部分をインクレチン類似体にカップリングさせることができる（すなわち、完全なインクレチン類似体合成の後にアシル化することができる）。例えば、その方法は、２つの中間体化合物をカップリングさせるステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号２１および１８に記載されるような構造、またはその薬学的に許容される塩を有し、その後、以下の構造の脂肪酸部分とカップリングさせる。
Figure 2022545200000002
あるいは、上記方法は、以下の２つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号２２および１９に記載の構造を有し、その後、以下の構造を有する脂肪酸部分とカップリングさせる。
Figure 2022545200000003
上記に加えて、代わりに、ＮＣＬを使用して、配列番号６のインクレチン類似体を作製することができ、この方法は、２つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、
配列番号２３および２４、
配列番号３９および２４、
配列番号２５および２６、
配列番号４０および２６、ならびに
配列番号２７および２６から選択される構造を有することができる。
別の実施形態では、インクレチン類似体は、アミノ酸配列：
Ｙ（Ａｉｂ）ＥＧＴ（αＭｅＦ（２Ｆ））ＴＳＤ（４Ｐａｌ）ＳＩ（αＭｅＬ）ＬＤ（Ｏｒｎ）Ｋ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ（Ａｉｂ）ＥＦＩ（Ｄ－Ｇｌｕ）（αＭｅＹ）ＬＩＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号２９）、またはその薬学的に許容される塩を含むことができ、これは、以下の構造を持つものとして表される：
Figure 2022545200000004
ＨＬＳＰＳを介して、配列番号２９のインクレチン類似体を作製する方法に関して、この方法は、以下の中間体化合物のうちの少なくとも１つを別の中間体化合物にカップリングするステップを少なくとも含むことができ、かかる化合物は、配列番号３０、３１、３２、３４、３５、３６および／または３７、またはそれらの薬学的に許容される塩を有する。
配列番号２９のインクレチン類似体を作製する方法が提供され、この方法は、
ハイブリッド液相・固相合成を介して、
ａ．配列番号７、６２、４２および３１、
ｂ．配列番号４３、および４４からなる群から選択される中間体化合物をカップリングすることを含む。
上記の方法に加えて、本発明の実施形態はまた、中間体化合物自体（例えば、配列番号７から２８および３０から４１）、ならびにそれを含む組成物を包含する。
本発明の類似体の利点は、それらが真性糖尿病、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および肥満、ならびにＧＬＰ－１、および／またはＧＩＰ、および／またはグルカゴンの調節に関連する他の障害または症状に対する効果的な治療として使用できることである。
本発明の方法の利点としては、例えば、最初にＳＰＰＳを介して生成される短いフラグメントが、ＨＬＳＰＳを介することで一般に高い純度および高い収率が可能になるなどの、いくつかのプロセス上の改善が挙げられる。
本発明の方法の利点としては、ＳＰＰＳでのカップリングの効率が、化学的変換に関与する実際の残基に依存するのみならず、樹脂に付着した構造によっても影響を受けていることが挙げられる（すなわち、特定の作業工程における溶解性／凝集の問題が公知である）。フラグメントが短いほど、複雑なアミノ酸残基のカップリング経路の柔軟性が高まり、フラグメント構造を再設計してより困難な変換に対処できるようになる。
本発明の方法の利点としては、合成中の不純物の制御ストラテジーが改善されていることが挙げられ、これにより、粗ペプチドの最終不純物プロファイルが改善され、クロマトグラフィーの負担が単純化／低減し、コスト削減がもたらされる。
本発明の方法の利点としては、ＳＰＰＳを介した短いフラグメントの合成により、洗浄サイクルの短縮、試薬量の削減、およびプロセス質量強度（ＰＭＩ）の削減につながるより環境に優しい溶媒の使用が可能になることが挙げられる。
本発明の方法の利点としては、短いフラグメントで、直鎖状の長い分子の構築における典型的な失敗リスクが大幅に減少することが挙げられる。
本発明の方法の利点としては、液相および固相合成の組み合わせが、新しい製造プラットフォームおよび他の革新的技術の導入に、より適していることが挙げられる。
本発明の方法の利点としては、いくつかの独立したフラグメントを使用することによる、製造プロセスのサプライチェーンおよびロジスティクスにおける柔軟性が挙げられる。
本発明の方法の利点としては、フラグメントの並列的な製造を使用することにより、フラグメントの並列処理による製造サイクルの短縮が可能となることが挙げられる。
本発明の方法の利点としては、現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）の収束的なステップを、特殊な機器を必要とせずに標準的な施設で実施できることが挙げられる。
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、インクレチン類似体、医薬組成物、および方法の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料は、本明細書に記載されている。
また、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈が１つおよび１つのみの要素があることを明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
略語および定義
特定の略語は次のように定義される：「ＡＥＥＡ」は２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチルを指し、「Ｄ－Ｇｌｕ」または「ｅ」はＤ－グルタミン酸を指し、「ｅ」はアミノ酸配列はＤ－グルタミン酸を指し、「Ａｉｂ」はα－アミノイソブチル酸を指し、「αＭｅＬ」はα－メチルロイシンを指し、「αＭｅＫ」はα－メチルリジンを指し、「Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルを指し、「Ｂｕ」はブチルを指し、「ｔ－Ｂｕ」はｔｅｒｔ－ブチルを指し、「ＣＴＣ」はクロロトリチルクロリドを指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、「ＤＩＣ」はジイソプロピルカルボジイミドを指し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「Ｆｍｏｃ」はフルオレニルメチルオキシカルボニルクロリドを指し、「ｈｒ」は時間を指し、「ＩＰＡ」はイソプロパノールを指し、「ＩＰＡｃ」は酢酸イソプロピルを指し、「ｍｉｎ」は分を指し、「Ｍｅ」はメチルを指し、「ＭＴＢＥ」はメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルを指し、「ｏｘｙｍａ」はシアノヒドロキシイミノ酢酸エチルを指し、「ＰＧ」は保護基を指し、「Ｐｉｐ」はピペリジンを指し、「ＳＰＰＳ」は固相ペプチド合成を指し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し、「ＴＩＰＳ」はトリイソプロピルシランを指し、「Ｔｒｔ」はトリチルを指す。
本明細書で使用されるとき、「約」とは、例えば、記載された濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度、または体積などの値（複数可）の統計的に有意な範囲内を意味する。そのような値または範囲は、所与の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらにより典型的には５％以内の規模以内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究での特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。
本明細書で使用される場合、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１またはグルカゴンの受容体のうちの１つ以上に関して、「活性」、「活性化する」、「活性化すること」などは、以下に記載されるインビトロアッセイなどの当該技術分野で公知のアッセイを使用して測定されるように、受容体に結合し、受容体における応答を誘導する、本明細書に記載されるインクレチン類似体などの化合物の能力を意味する。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲートに利用可能な官能基を有するアミノ酸」とは、例えば、リンカーによって脂肪酸にコンジュゲートされ得る官能基を有する任意の天然または非天然アミノ酸を意味する。そのような官能基の例としては、アルキニル基、アルケニル基、アミノ基、アジド基、ブロモ基、カルボキシル基、クロロ基、ヨード基、およびチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。かかる官能基を含む天然アミノ酸の例としては、Ｌｙｓ／Ｋ（アミノ）、Ｃｙｓ／Ｃ（チオール）、Ｇｌｕ／Ｅ（カルボキシル）およびＡｓｐ／Ｄ（カルボキシル）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「類縁体」は、標的受容体を活性化し、その受容体の天然アゴニストによって誘発される少なくとも１つのインビボまたはインビトロ効果を誘導する、合成のペプチドまたはポリペプチドなどの化合物を意味する。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１６～Ｃ２２脂肪酸」とは、１６～２２個の炭素原子を有するカルボン酸を意味する。本明細書での使用に好適なＣ１６－Ｃ２２脂肪酸は、飽和一酸または飽和二酸であり得る。本明細書で使用される場合、「飽和」とは、脂肪酸が炭素－炭素二重結合または三重結合を含まないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「二重受容体活性」とは、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１およびグルカゴンの１つ以上の受容体においてアゴニスト活性を有するインクレチン類似体であって、特に、過剰な活性に関連する望ましくない副作用を回避しつつ、その受容体のアゴニズムの利点を提供するように、１つ以上の受容体においてバランスのとれた十分な活性を示す類似体によるものを意味する。また、二重アゴニスト活性を有するインクレチン類似体は、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１およびグルカゴンの受容体の１つ以上で長期間の作用を発揮し、これは１日１回、週３回、週２回、または週１回の低頻度で投与することを可能にするため有利である。
本明細書で使用される場合、「グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド」または「ＧＩＰ」は、グルコースの存在下で膵臓β細胞からのインスリン分泌を刺激することによってグルコースホメオスタシスにおいて生理学的役割を果たすペプチド、特にヒトＧＩＰ（配列番号１）を意味する。
本明細書で使用される場合、「グルカゴン様ペプチド－１」または「ＧＬＰ－１」は、グルコース依存性インスリン分泌を刺激し、糖尿病患者における高血糖を予防することが示されているペプチド、特にヒトＧＬＰ－１（配列番号２）を意味する。
本明細書で使用される場合、「グルカゴン」または「ＧＣＧ」は、肝細胞上のグルカゴン受容体と結合および活性化し、グリコーゲンの形で貯蔵されたグルコースを、グリコーゲン分解と称するプロセスを介して肝臓から放出させることによって、血中グルコースを維持するのを補助するペプチド、特にヒトＧＣＧ、（配列番号３）を意味する。
本明細書で使用される場合、「インクレチン類似体」とは、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、およびＧＣＧの各々、特にヒトＧＩＰ（配列番号１）、ヒトＧＬＰ－１（配列番号２）、およびヒトＧＣＧ（配列番号３）との構造的類似性を有するが、複数の相違を有する化合物を意味する。本明細書に記載されるインクレチン類似体は、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、およびグルカゴン受容体の１つ以上に対する親和性および活性（すなわち三重アゴニスト活性）を有する化合物となるためのアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される緩衝液」は、当業者に知られている標準的な医薬緩衝液のいずれかを意味する。
本明細書で使用される場合、「三重受容体活性」とは、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１およびグルカゴンの受容体の各々において活性を有するインクレチン類似体であって、特に、過剰な活性に関連する望ましくない副作用を回避しつつ、その受容体のアゴニズムの利点を提供するように、受容体においてバランスのとれた十分な活性を示す類似体によるものを意味する。また、三重アゴニスト活性を有するインクレチン類似体は、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、およびグルカゴン受容体の１つ以上で長期間の作用を有し、これは１日１回、週３回、週２回、または週１回の低頻度で投与することを可能にするため有利である。
組成物
本明細書に記載されるインクレチン類似体の構造的特徴により、化合物は、ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、およびグルカゴン受容体の１つ以上での十分な活性（すなわち、三重アゴニスト活性）を有することにより、１つ以上の受容体での活性の好ましい効果をもたらすものとなり、いずれか１つの受容体の活性が他の２つの受容体の活性を圧倒するものでもなく、または、３つすべての受容体の活性をもたらすために十分な用量で投与された場合に望ましくない副作用をもたらすものでもなくなる。
また、本明細書に記載されるインクレチン類似体の構造的特徴により、化合物は、水溶液中の類似体の可溶性の改善、製剤安定性の化学的および物理的改善、薬物動態プロファイルの長時間化、ならびに免疫原性を有する可能性の最小化など、治療的処置としてのそれらの開発可能性に関連する多くの他の有益な特性を有するものとなる。
前述の構造的特徴リストは、包括的なものではなく、例示的なものであり、本明細書に記載される例示的な類似体の有益な特性の組み合わせは、単独での任意の修飾の結果ではなく、代わりに本明細書に記載される構造的特徴の新規組み合わせを通して達成されることが留意されるべきである。加えて、前述の修飾リストの上記効果は、これらの修飾の多くが、以下に記載されるように、本明細書に記載される化合物の特性にとって重要な他の効果も有するので、排他的ではない。
本明細書のインクレチン類似体のアミノ酸配列は、標準的な１または３文字コード（例えば、Ｌ／Ｌｅｕ＝ロイシン）、ならびに天然アミノ酸のα－メチル置換残基（例えば、（αＭｅＬ、αＭｅＫ、αＭｅＹ、αＭｅＦ（２Ｆ））、およびＡｉｂ、オルニチン、４－Ｐａｌなどの特定の他の非天然アミノ酸を含有する。これらのアミノ酸の構造を以下に示す。
Figure 2022545200000005
上記のように、本明細書に記載されるインクレチン類似体は、コンジュゲートに利用可能な官能基を有する天然または非天然のアミノ酸に対して、例えばリンカーによってコンジュゲートされる脂肪酸部分を含む。そのようなコンジュゲートは、アシル化と称されることもある。特定の例では、コンジュゲートに利用可能な官能基を有するアミノ酸は、Ｋ、Ｃ、ＥおよびＤ、特に配列番号５または配列番号２９の１７位のＫであり得、ここで、コンジュゲートは、Ｋ側鎖のε－アミノ基に対するものである。脂肪酸部分は、アルブミン結合剤として機能し、長時間作用型化合物としての利用可能性を提供する。
本明細書に記載されるインクレチン類似体は、直接結合またはリンカーのいずれかによってアミノ酸の官能基に化学的にコンジュゲートされた、Ｃ１６－Ｃ２２脂肪酸を利用する。脂肪酸の長さおよび組成は、インクレチン類似体の半減期、インビボ動物モデルにおけるそれらの効力、ならびにそれらの可溶性および安定性に影響を与える。Ｃ１６－Ｃ２２飽和脂肪酸（一酸または二酸）へのコンジュゲートは、望ましい半減期、インビボ動物モデルにおける望ましい効力、ならびに望ましい可溶性および安定性の特性を示すインクレチン類似体をもたらす。
本明細書での使用のための飽和Ｃ１６－Ｃ２２脂肪酸の例としては、限定されないが、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）（Ｃ１６一酸）、ヘキサデカン二酸（Ｃ１６二酸）、マルガリン酸（ヘプタデカン酸）（Ｃ１７一酸）、ヘプタデカン二酸（Ｃ１７二酸）、ステアリン酸（Ｃ１８一酸）、オクタデカン二酸（Ｃ１８二酸）、ノナデシル酸（ノナデカン酸）（Ｃ１９一酸）、ノナデカン二酸（Ｃ１９二酸）、アラカジン酸（エイコサン酸）（Ｃ２０一酸）、エイコサン二酸（Ｃ２０二酸）、ヘンエイコシル酸（ヘンエイコサン酸）（Ｃ２１一酸）、ヘンエイコサン酸（Ｃ２１二酸）、ベヘン酸（ドコサン酸）（Ｃ２２一酸）、ドコサン二酸（Ｃ２２二酸）が挙げられ、またそれらの分岐および置換誘導体を含む。
特定の例では、Ｃ１６－Ｃ２２脂肪酸は、飽和Ｃ１８一酸、飽和Ｃ１８二酸、飽和Ｃ１９一酸、飽和Ｃ１９二酸、飽和Ｃ２０一酸、飽和Ｃ２０二酸、ならびにそれらの分岐および置換誘導体とすることができる。
いくつかの例では、リンカーは、１～４つのアミノ酸、アミノポリエチレングリコールカルボキシレート、またはそれらの混合物を有することができる。特定の例では、アミノポリエチレングリコールカルボキシレートは、以下の構造を有し、
Ｈ－｛ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－［Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２］ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ｝ｎ－ＯＨ，
式中、ｍは、１～１２の任意の整数であり、ｎは、１～１２の任意の整数であり、ｐは、１または２である。
特定の例では、リンカーは、任意選択的に１～４つのアミノ酸と組み合わされた、１つ以上の（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）部分を有することができる。
リンカーが少なくとも１つのアミノ酸を含む例では、アミノ酸は、１～４つのＧｌｕまたはγＧｌｕアミノ酸残基であり得る。いくつかの例では、リンカーは、そのＤ形態を含む、１つまたは２つのＧｌｕまたはγＧｌｕアミノ酸残基を含むことができる。例えば、リンカーは、１つまたは２ついずれかのγＧｌｕアミノ酸残基を含むことができる。あるいは、リンカーは、最大３６個の（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）部分との組み合わせで使用される１～４つのアミノ酸残基（例えば、ＧｌｕまたはγＧｌｕアミノ酸など）を含むことができる。具体的には、リンカーは、１～４つのＧｌｕまたはγＧｌｕアミノ酸と１～４つの（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）部分との組み合わせであり得る。他の例では、リンカーは、１つまたは２つのγＧｌｕアミノ酸と１つまたは２つの（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）部分との組み合わせであり得る。
特定の例では、本明細書に記載されるインクレチン類似体は、以下の式の構造を有するリンカーおよび脂肪酸成分を有し、
（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）ａ－（γＧｌｕ）ｂ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｃ－ＣＯ２Ｈ、
式中、ａは、０、１、または２であり、ｂは、１または２であり、ｃは、１６または１８である。
特定の例では、ａは２であり、ｂは１であり、ｃは１６であり、その構造を以下に示す。
Figure 2022545200000006
特定の例では、ａは１であり、ｂは２であり、ｃは１８であり、その構造を以下に示す。
Figure 2022545200000007
特定の例では、ａは０であり、ｂは２であり、ｃは１８であり、その構造を以下に示す。
Figure 2022545200000008
特定の例では、ａは１であり、ｂは１であり、ｃは１８であり、その構造を以下に示す。
Figure 2022545200000009
特定の例では、インクレチン類似体の全体的な構造は、配列番号６である。
特定の例では、インクレチン類似体の全体的な構造は、配列番号２９である。
ＧＩＰ、ＧＬＰ－１、およびグルカゴンの受容体の各々に対する本明細書に記載されるインクレチン類似体の親和性は、例えば、以下の実施例に記載されるものなどの、受容体結合レベルを測定するための当該技術分野で公知の技法を使用して測定され得、一般的には阻害定数（Ｋｉ）値として表される。受容体の１つ以上での本明細書に記載されるインクレチン類似体の活性はまた、例えば、以下に記載されるインビトロ活性アッセイを含む、当該技術分野で公知の技法を使用して測定され得、一般的には有効濃度５０（ＥＣ５０）値として表され、これは、化合物の、用量応答曲線において最大半量のシミュレーションを生じさせる濃度である。
本明細書に記載されるインクレチン類似体は、非経口経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮）によって投与できる医薬組成物として製剤化することができる。かかる医薬組成物およびそれを調製するための手法は、当該技術分野において周知である。例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（Ｔｒｏｙ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２１ｓｔ ｅｄ．２００６）’を参照されたい。
本明細書に記載されるインクレチン類似体は、いくつかの無機および有機酸／塩基のいずれかと反応して、薬学的に許容される酸／塩基付加塩を形成し得る。薬学的に許容される塩およびそれらを調製するための一般的な手法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ”（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ ２ｎｄ ｅｄ．２０１１）を参照されたい）。本明細書での使用のための薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、および／または酢酸塩が含まれる。
本開示はまた、新規中間体化合物、および本発明のインクレチン類似体またはその薬学的に許容される塩を合成する方法を提供し、したがって、包含する。本発明の中間体化合物およびインクレチン類似体は、当該技術分野で公知の様々な技法によって調製することができる。例えば、２つ以上の中間体化合物のための標準的な固相ペプチド合成、およびそれに続くそのＨＬＳＰＳを使用する方法が、以下の実施例に示されている。記載される経路の各々についての具体的な合成ステップを様々な方法で組み合わせて、本発明のインクレチン類似体を調製し得る。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。
本明細書に記載される特定のインクレチン類縁体は、一般に、広い投与量範囲にわたって有効である。例えば、週１回投与の投与量は、約０．０１～約３０ｍｇ／人／週の範囲内、約０．１～約１０ｍｇ／人／週の範囲内、またはさらに約０．１～約３ｍｇ／人／週の範囲内に含まれ得る。よって、本明細書に記載されるインクレチン類似体は、１日１回、週３回、週２回、または週１回投与され、特に週１回投与され得る。
本明細書に記載されるインクレチン類似体は、様々な症状、障害、疾患、または徴候を治療するために使用され得る。特に、個人におけるＴ２ＤＭを治療するための方法が提供され、かかる方法は、かかる治療を必要とする個人に、有効量の、本発明のインクレチン類似体、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを少なくとも含む。
方法
中間体化合物の標準的な固相ペプチド合成：
本明細書のインクレチン類似体は、当技術分野で公知の任意の数の標準的なペプチド合成方法、特にＳＰＰＳを介して作製することができる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）による構築は、自動ペプチド合成装置による連続的カップリングを利用した標準的なＦｍｏｃペプチド化学技術を使用して実施される。ＳＰＰＳの方法は当技術分野に周知であり、本明細書で網羅的に説明する必要はない。一般論については、”Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｃｈａｎ ＆ Ｗｈｉｔｅ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２０００）、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５４を参照されたい。
脱保護のためには、樹脂をＤＭＦで膨潤させた後、２０％ Ｐｉｐ／ＤＭＦを使用して脱保護する（３×３０分）。その後のＦｍｏｃ脱保護では、２０％ Ｐｉｐ／ＤＭＦ（１×５～２０分間、１×２０～３０分間）処理を用い、その際、１×５～２０分間、１×２０分間および１×３０分間の連続処理が、より困難な脱保護のために用いられる。
脱保護後、樹脂を１０体積のＤＭＦ洗浄液で５×２分間、洗浄する。アミノ酸の予備活性化では、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ ＤＭＦ溶液を室温で３０分間使用する。活性化されたアミノ酸の樹脂結合ペプチドへのカップリングは、個々のアミノ酸ごとに特定の時間で行う。各カップリングの後、１０体積のＤＭＦによる溶媒洗浄を５×２分間行う。
最終生成物を単離するためには、樹脂結合生成物を１０体積のＤＣＭで５×２分間洗浄し、ＤＭＦを除去する。樹脂を１０体積のＩＰＡで２×２分間洗浄してＤＣＭを除去し、１０体積のメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で５×２分間洗浄し、その後、生成物を４０℃で真空乾燥する。樹脂結合した生成物を冷凍保存（－２０℃）する。
分析のためには、ペプチドを、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ／ＤＴＴを比率（０．９３ｖ／０．０４ｖ／０．０３ｖ／０．０３ｗ）で含む酸性カクテルを使用して、樹脂から切断する。樹脂をＤＣＭで膨潤させ（４～５ｖｏｌ、３×３０分間）、ドレインする。事前に膨潤させた樹脂に切断カクテル（４～５ｖｏｌ）を添加し、懸濁液を室温で２時間撹拌する。溶液を濾過し、次に樹脂を少量のＤＣＭで洗浄し、切断溶液と混合する。得られた溶液を７～１０体積の冷却した（０℃の）ＭＴＢＥに注ぐ。懸濁液を０℃で３０分間エージングさせ、得られた沈殿物を遠心分離し、透明な溶液をデカントする。残留物を同量のＭＴＢＥに懸濁し、得られた懸濁液を再度遠心分離してデカントする。デカントした後、沈殿したペプチドの透明なＭＴＢＥ溶液を４０℃で一晩真空乾燥させる。
インクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成：
上記のようにＳＰＰＳを介して調製された中間体化合物を組み合わせて、配列番号６または２９のインクレチン類似体を得ることができる。ＨＬＳＰＳの方法は当技術分野に周知であり、本明細書で網羅的に説明する必要はない。一般論については、米国特許出願公開第２０１１／００４６３４９号、ならびにＡｌｂｅｒｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３１３－３３６、Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２：５８７－５９３、Ｄａｌｃｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７５７５－６０：７５８１、Ｇａｕｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｅｔｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２：５７７－５８０、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．１１：７４４－７５３、Ｓｍｉｔｈ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ４ｔｈ ｅｄ．２０１６）、およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１２：１０１－１１０を参照されたい。
簡潔には、ＨＬＳＰＳは、独立した中間体化合物の合成および化合物のカップリングを含む。ここで適用される、配列番号６のインクレチン類似体を作製する１つの方法は、以下の４つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含み、かかる化合物は、配列番号７、８、９および１０に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号７～配列番号８～配列番号９～配列番号１０の順序で結合することができる。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
配列番号６のインクレチン類似体を作製する別の方法は、少なくとも以下の４つの中間体化合物をカップリングするステップを含み、かかる化合物は、配列番号７、１１、１２および１０に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号７～配列番号１１～配列番号１２～配列番号１０の順序で結合される。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
配列番号６のインクレチン類似体を作製する別の方法は、少なくとも以下の４つの中間体化合物をカップリングするステップを含み、かかる化合物は、配列番号７、１３、１４および１０に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号７～配列番号１３～配列番号１４～配列番号１０の順序で結合される。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
あるいは、配列番号６のインクレチン類似体を作製する１つの方法は、以下の３つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含み、かかる化合物は、配列番号７、１３および１５に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号７～配列番号１３～配列番号１５の順序で結合される。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
配列番号６のインクレチン類似体を作製する別の方法は、少なくとも以下の３つの中間体化合物をカップリングするステップを含み、かかる化合物は、配列番号１６、１７および１０に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号１６～配列番号１７～配列番号１０の順序で結合される。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
配列番号６のインクレチン類似体を作製する別の方法は、少なくとも以下の３つの中間体化合物をカップリングするステップを含み、かかる化合物は、配列番号１８、１２および１０に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号１８～配列番号１２～配列番号１０の順序で結合される。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
配列番号６のインクレチン類似体を作製する別の方法は、少なくとも以下の３つの中間体化合物をカップリングするステップを含み、かかる化合物は、配列番号７、４５および１０に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号７～配列番号４５～配列番号１０の順序で結合される。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
配列番号６のインクレチン類似体を作製する別の方法は、少なくとも以下の３つの中間体化合物をカップリングするステップを含み、かかる化合物は、配列番号７、１１および２０に記載される構造を有する。
いくつかの例では、フラグメントは、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）配列番号７～配列番号１１～配列番号２０の順序で結合される。他の例では、適切な保護基を用いるストラテジーを用いて、フラグメントを異なる順序で結合できる。
あるいは、配列番号６のインクレチン類似体を作製する１つの方法は、以下の２つの中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含み、かかる化合物は、配列番号１９および１５に記載される構造を有する。
配列番号６のインクレチン類似体を作製する別の方法は、少なくとも以下の２つの中間体化合物をカップリングするステップを含み、かかる化合物は、配列番号１８および２０に記載される構造を有する。
あるいは、配列番号６のインクレチン類似体を作製する他の方法は、上記と同じ切断を用いるが、代わりに、最初に骨格としてすべてのアミノ酸フラグメントを結合し、次に最後の化学的変換として脂肪酸側部分を導入し、続いて全体を脱保護する。ここで、例えば、対応するＰＧは、Ｌｙｓ１７に設けることができ、これは、他のＰＧ（例えば、Ｂｏｃ、ｔＢｕおよび／またはＴｒｔ）の存在下で選択的に除去することができる。いくつかの例では、配列番号６のインクレチン類似体を作製する方法は、以下の中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含み、かかる化合物は、配列番号２１および１８、ならびに以下に記載される構造を有する。
Figure 2022545200000010
いくつかの例では、配列番号６のインクレチン類似体を作製する方法は、以下の中間体化合物をカップリングするステップを少なくとも含み、かかる化合物は、配列番号２２および１９、ならびに以下に記載される構造を有する。
Figure 2022545200000011
あるいは、配列番号６のインクレチン類似体を作製する他の方法は、ＮＣＬアプローチを介して脱保護された化合物中間体（例えば、チオエステルフラグメントおよびアミドフラグメント）をカップリングするステップを少なくとも含む。ここで、例えば、Ａｌａ２１をＣｙｓの天然エナンチオマーで置換し、ライゲーションステップを完了した後、配列番号６は、Ｃｙｓを脱硫して必要なＡｌａ２１を以下の中間体化合物とともに有させることによって得られ、かかる化合物は、配列番号２３および２４に記載される構造を有する。
あるいは、チオエステル（配列番号２３）を中間体化合物で置換することができ、そこでは、Ｃ末端の－Ｃ－Ｐ－ＯＲエステル（ＣＰＥ）の部分がマスクされたチオエステルとして機能し、配列番号３９および２４に記載される構造を有する化合物のライゲーションステップを容易にすることができる。
他の例では、Ａｌａ１８をＣｙｓで置換し、以下の中間体化合物のネイティブケミカルライゲーション後に脱硫することができ、かかる化合物は、配列番号２５および２６に記載される構造を有する。
あるいは、チオエステル（配列番号２５）を中間体化合物で置換することができ、そこでは、－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－ＯＲエステル（ＣＰＥ）の部分がマスクされたチオエステルとして機能し、配列番号４０および２６に記載される構造を有する化合物のライゲーションステップを容易にすることができる。
あるいは、配列番号５のインクレチン類似体を作製する他の方法は、ＮＣＬアプローチを介して以下の中間体化合物（例えば、非アシル化チオエステルフラグメントおよびアミドフラグメント）をカップリングするステップを少なくとも含み、かかる化合物は、配列番号２７および２６に記載される構造を有する。
あるいは、チオエステル（配列番号２７）を中間体化合物で置換することができ、そこでは、－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－ＯＲエステル（ＣＰＥ）の部分がマスクされたチオエステルとして機能し、配列番号４１および２６に記載される構造を有する化合物のライゲーションステップを容易にすることができる。
別の実施形態では、配列番号２９は、配列番号４３と配列番号４４をカップリングし、次いで、脱保護することによって、配列番号２９に合成することができる。
別の実施形態では、配列番号４８は、配列番号２０および配列番号１８を使用することによって、合成することができる。配列番号４８を脱保護し、配列番号６が生成する。
別の実施形態では、配列番号５３は、配列番号５１および配列番号５２を使用して、ＮＣＬによって合成することができる。
別の実施形態では、配列番号５３は、配列番号５２および配列番号５４を使用して、ＮＣＬによって合成することができる。
配列番号９、１２、１４、１５、１７、２０、２３および２５の化合物中間体を効果的に調製するために、脂肪側鎖
Figure 2022545200000012
 および脂肪側鎖に結合したＦｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ－ＯＨアミノ酸を使用して、以下を合成する。
Figure 2022545200000013
ＳＰＰＳの純度および効率を改善するために、以下の二量体、三量体および四量体を使用して、配列番号１０、１５、２０、２１、２２、２３、２５および２７を調製することができ、以下の構造は、アミノ酸ビルディングブロックを使用し、ＳＰＰＳまたは液相合成を介して合成することができる：
Figure 2022545200000014
他の方法／使用：
本明細書のインクレチン類似体は、多くの治療用途で使用することができる。例えば、インクレチン類似体は、個人における肥満を治療するための方法において使用することができ、かかる方法は、かかる治療を必要とする個人に、有効量の、本明細書に記載されるインクレチン類似体、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを少なくとも含む。
加えて、インクレチン類似体は、個人における非治療的な減量を誘導するための方法において使用することができ、かかる方法は、かかる治療を必要とする個人に、有効量の、本明細書に記載されるインクレチン類似体、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを少なくとも含む。
加えて、本発明のインクレチン類似体は、個人におけるメタボリックシンドロームを治療するための方法において使用することができ、かかる方法は、かかる治療を必要とする個人に、有効量の、本明細書に記載されるインクレチン類似体、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを少なくとも含む。
加えて、本発明のインクレチン類似体は、個人におけるＮＡＳＨを治療するための方法において使用することができ、かかる方法は、かかる治療を必要とする個人に、有効量の、本明細書に記載されるインクレチン類似体、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを少なくとも含む。
加えて、本発明のインクレチン類似体は、個人におけるＮＡＦＬＤを治療するための方法において使用することができ、かかる方法は、かかる治療を必要とする個人に、有効量の、本明細書に記載されるインクレチン類似体、またはその薬学的に許容される塩を投与するステップを少なくとも含む。
これらの方法において、インクレチン類似体の有効性は、例えば、血中グルコースの有意な減少を観察すること、インスリンの有意な増加を観察すること、ＨｂＡ１ｃの有意な減少を観察すること、および／または体重の有意な減少を観察することによって評価することができる。
あるいは、本発明のインクレチン類似体またはその薬学的に許容される塩は、それを必要とする個人における骨強度を改善するために使用され得る。いくつかの例では、それを必要とする個体は、骨化機能低下症もしくは類骨組織形成機能低下症を有するか、または骨折、関節筋力回復術、人工装具インプラント、歯科インプラント、および／もしくは脊椎固定から治癒している。インクレチン類似体はまた、パーキンソン病またはアルツハイマー病などの他の障害を治療するために使用され得る。
以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。
ペプチドおよびポリペプチドの合成
実施例１：中間体化合物１の固相ペプチド合成
中間体化合物１（配列番号７）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000015
Ｆｍｏｃの脱保護、フラグメントの切断および分離：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上のフラグメントを、１０Ｖの２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０～３０分間２回撹拌し、次に１０ＶのＤＭＦで６回洗浄する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上のＦｍｏｃｅｄフラグメントを、１０ＶのＤＣＭを使用して１０～２０分間、２回膨潤させる。樹脂を入れた反応器を約１５℃に冷却し、２０Ｖの５％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に投入し、次に窒素下で約１５℃に温度を維持しながら２時間撹拌する。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液は一緒に混合する。得られた溶液から減圧下でＤＣＭを除去しつつ、内部温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥ（２５Ｖ）を溶液に入れ、ＤＣＭ／ＭＴＢＥ溶媒を減圧下で再び除去しつつ、内部温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥの添加／蒸留の操作を、上澄み中のフラグメントの残留濃度が＜０．１１ｗｔ％に達しないまで繰り返す。次に、得られたスラリーを約１５℃に保温しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約３５℃で乾燥させる。
実施例２：中間体化合物２の固相ペプチド合成
中間体化合物２（配列番号８）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表２に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000016
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。１０Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃で１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと添加することにより直ちに中和し、次に５ＶのＤＭＳＯを濾液に添加する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液および洗浄液を合わせる。フラグメント溶液を真空下で６～１０Ｖに濃縮し、温度を≦３５℃（残留ＤＣＭ濃度≦１５％）に維持する。フラグメントのＤＭＳＯ中溶液を約２５℃で２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて１１～１５ＶのＨ２Ｏに添加する。沈殿したフラグメントにより形成されたスラリーを、約２５℃で３０～４０分間撹拌し、次に濾過する。得られた固体を約２５℃で８～１２ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例３：中間体化合物３の固相ペプチド合成
中間体化合物３（配列番号９）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表３に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000017
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦Ｘ％）その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例４：中間体化合物４の固相ペプチド合成
中間体化合物４（配列番号１０）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表４に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000018
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を４５分間使用して１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。２ＶのＤＭＳＯを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦５％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＤＭＳＯ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて７～９ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を４０℃で乾燥させる。
実施例５：中間体化合物５の固相ペプチド合成
中間体化合物５（配列番号１１）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表５に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000019
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を４５分間使用して１回膨潤させる。１０Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃で１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと添加することにより直ちに中和し、次に５ＶのＤＭＳＯを濾液に添加する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液および洗浄液を合わせる。フラグメント溶液を真空下で６～１０Ｖに濃縮し、温度を≦３５℃（残留ＤＣＭ濃度≦１５％）に維持する。フラグメントのＤＭＳＯ中溶液を約２５℃で２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて１１～１５ＶのＨ２Ｏに添加する。沈殿したフラグメントにより形成されたスラリーを、約２５℃で３０～４０分間撹拌し、次に濾過する。得られた固体を約２５℃で８～１２ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例６：中間体化合物６の固相ペプチド合成
中間体化合物６（配列番号１２）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表６に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000020
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦１５％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例７：中間体化合物７の固相ペプチド合成
中間体化合物７（配列番号１３）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表７に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000021
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。１０Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、２５℃で１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと添加することにより直ちに中和し、次に５ＶのＤＭＳＯを濾液に添加する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液および洗浄液を合わせる。フラグメント溶液を真空下で６～１０Ｖに濃縮し、温度を≦３５℃（残留ＤＣＭ濃度≦１５％）に維持する。フラグメントのＤＭＳＯ中溶液を約２５℃で２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて１１～１５ＶのＨ２Ｏに添加する。沈殿したフラグメントにより形成されたスラリーを、約２５℃で３０～４０分間撹拌し、次に濾過する。得られた固体を約２５℃で８～１２ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例８：中間体化合物８の固相ペプチド合成
中間体化合物８（配列番号１４）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表８に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000022
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦１５％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例９：中間体化合物９の固相ペプチド合成
中間体化合物９（配列番号１５）、または薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表９に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000023
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦１５％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例１０：中間体化合物１０の固相ペプチド合成
中間体化合物１０（配列番号１６）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１０に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000024
Ｆｍｏｃの脱保護、フラグメントの切断および分離：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上のフラグメントを、１０Ｖの２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０～３０分間２回撹拌し、次に１０ＶのＤＭＦで６回洗浄する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上の脱Ｆｍｏｃされたフラグメントを、１０ＶのＤＣＭを使用して１０～２０分間にわたり２回膨潤させる。樹脂を含む反応器を約１５℃に冷却する。２０Ｖの５％ ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、窒素下で２時間撹拌し、温度を約１５℃に維持する。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液は一緒に混合する。得られた溶液から減圧下でＤＣＭを除去しつつ、内部温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥ（２５Ｖ）を溶液に入れ、ＤＣＭ／ＭＴＢＥ溶媒を減圧下で再び除去しつつ、温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥの添加／蒸留の操作を、上澄み中のフラグメントの残留濃度が＜０．１１ｗｔ％に達しないまで繰り返す。次に、得られたスラリーを約１５℃に保温しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、スラリーを約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約３５℃で乾燥させる。
実施例１１：中間体化合物１１の固相ペプチド合成
中間体化合物１１（配列番号１７）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－２－ＣＴＣ樹脂（０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１１に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000025
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦Ｘ％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例１２：中間体化合物１２の固相ペプチド合成
中間体化合物１２（配列番号１８）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１２に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000026
Ｆｍｏｃの脱保護、フラグメントの切断および分離：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上のフラグメントを、１０Ｖの２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０～３０分間２回撹拌し、次に１０ＶのＤＭＦで６回洗浄する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上の脱Ｆｍｏｃされたフラグメントを、１０ＶのＤＣＭを使用して１０～２０分間にわたり２回膨潤させる。樹脂を含む反応器を約１５℃に冷却する。２０Ｖの５％ ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、窒素下で２時間撹拌し、温度を約１５℃に維持する。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液は一緒に混合する。得られた溶液から減圧下でＤＣＭを除去しつつ、内部温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥ（２５Ｖ）を溶液に入れ、ＤＣＭ／ＭＴＢＥ溶媒を減圧下で再び除去しつつ、温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥの添加／蒸留の操作を、上澄み中のフラグメントの残留濃度が＜０．１１ｗｔ％に達しないまで繰り返す。次に、得られたスラリーを約１５℃に保温しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、スラリーを約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約３５℃で乾燥させる。
実施例１３：中間体化合物１３の固相ペプチド合成
中間体化合物１３（配列番号１９）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１３に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000027
Ｆｍｏｃの脱保護、フラグメントの切断および分離：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上のフラグメントを、１０Ｖの２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０～３０分間２回撹拌し、次に１０ＶのＤＭＦで６回洗浄する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上の脱Ｆｍｏｃされたフラグメントを、１０ＶのＤＣＭを使用して１０～２０分間にわたり２回膨潤させる。樹脂を含む反応器を約１５℃に冷却する。２０Ｖの５％ ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、窒素下で２時間撹拌し、温度を約１５℃に維持する。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液は一緒に混合する。得られた溶液から減圧下でＤＣＭを除去しつつ、温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥ（２５Ｖ）を溶液に入れ、ＤＣＭ／ＭＴＢＥ溶媒を減圧下で再び除去しつつ、温度を≦２０℃に維持し、２２．５Ｖの残留体積とする。ＭＴＢＥの添加／蒸留の操作を、上澄み中のフラグメントの残留濃度が＜０．１１ｗｔ％に達しないまで繰り返す。次に、得られたスラリーを約１５℃に保温しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、スラリーを約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約３５℃で乾燥させる。
実施例１４：中間体化合物１４の固相ペプチド合成
中間体化合物１４（配列番号２０）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡単に説明すると、ＳＰＰＳは、Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１４に示す条件で実施される。
Figure 2022545200000028
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦Ｘ％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例１５：中間体化合物１５の固相ペプチド合成
中間体化合物（配列番号２１）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１５に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000029
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液と洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦Ｘ％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、約０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例１６：中間体化合物１６の固相ペプチド合成
中間体化合物１６（配列番号２２）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１６に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000030
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭ（５Ｖ）を使用して４５分間にわたり１回膨潤させる。５Ｖの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に充填し、得られた樹脂の懸濁液を、窒素下、約２５℃に温度を維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに２回繰り返す。樹脂を３ＶのＤＣＭで洗浄し、１０～１５分間撹拌する。すべての濾液および洗浄液を合わせ、得られた混合物を≦２０℃に冷却する。フラグメント溶液を真空下で２～４Ｖに濃縮し、温度を≦２０℃に維持する。５ＶのＡＣＮを溶液に添加し、残留ＤＣＭを真空下で除去し（残留ＤＣＭ濃度≦Ｘ％）、その際、温度を≦２０℃に維持する。フラグメントのＡＣＮ中溶液を、０℃に温度を維持しながら２～６時間（＜１Ｌ／分）かけて５ＶのＨ２Ｏに添加する。得られたフラグメントにより形成されたスラリーを、約０℃で３０～４０分間撹拌し、次に０℃で濾過する。得られた固体を約２５℃で３～５ＶのＨ２Ｏに懸濁し、１０～１５分間撹拌し、次に濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた固形物を約４０℃で乾燥させる。
実施例１７：中間体化合物１７のハイブリッド液相・固相ペプチド合成
中間体化合物１７（配列番号２３）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡単に説明すると、ＳＰＰＳは、Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－２－ＣＴＣ－ヒドラジン樹脂（負荷率０．６－０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１７に示す条件で実施される。
Figure 2022545200000031
樹脂上のフラグメントを、フィルター反応器を使用してＤＣＭ（３×１０Ｖ）で膨潤させる。脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、０．３重量ＶのＤＴＴを混合して調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを樹脂に添加し、得られたスラリーを室温で３時間撹拌する。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（２×３Ｖ）で洗浄する。次に、得られた濾液を合わせて約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
粗ペプチドのヒドラジドを３０Ｖのライゲーション緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基緩衝液、ｐＨ３．３５）に溶解させ、約－１５℃に冷却させる。１Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液（５．０～１０．０当量）をヒドラジド溶液に添加し、約－１５℃で１０分間撹拌する。１０分後、２，２，２－トリフルオロエタンチオール（２０．０当量、ｐＨ７．０）を、ペプチドヒドラジドの酸化から生成されたペプチジルアジドに添加する。反応混合物のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で約７．０に調整する。ペプチジルアジドのチオール分解を１時間実施し、得られたペプチドチオエステルをライゲーション化学反応で直接使用するか、または逆相クロマトグラフィーで精製する（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ７０：２９５１－２９５５を参照）。
実施例１８：中間体化合物１８の固相ペプチド合成
中間体化合物１８（配列番号２４）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表１８に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000032
切断および脱保護：樹脂上のフラグメントを、フィルター反応器を使用してＤＣＭ（３×１０Ｖ）で膨潤させる。脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、０．３重量ＶのＤＴＴを混合して調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを樹脂に添加し、得られたスラリーを室温で３時間撹拌する。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（２×３Ｖ）で洗浄する。次に、得られた濾液を合わせて約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、生成物を白色の固体として得る。
実施例１９：中間体化合物１９のハイブリッド液相・固相ペプチド合成
中間体化合物１９（配列番号２５）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、以下の表１９に示す条件において、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（ｔ－ＢｕＯＯＣ－（ＣＨ２）１８－ＣＯＯ－γ－Ｌ－Ｇｌｕ－ＡＥＥＡ）－Ｌｙｓ－２－ＣＴＣ－ヒドラジン樹脂（負荷率０．６－０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用し、ＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000033
樹脂上のフラグメントを、フィルター反応器を使用してＤＣＭ（３×１０Ｖ）で膨潤させる。脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、０．３重量ＶのＤＴＴを混合して調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを樹脂に添加し、得られたスラリーを室温で３時間撹拌する。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（２×３Ｖ）で洗浄する。次に、得られた濾液を合わせて約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
粗ペプチドのヒドラジドを３０Ｖのライゲーション緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基緩衝液、ｐＨ３．３５）に溶解させ、約－１５℃に冷却させる。１Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液（５．０～１０．０当量）をヒドラジド溶液に添加し、約－１５℃で１０分間撹拌する。１０分後、２，２，２－トリフルオロエタンチオール（２０．０当量、ｐＨ７．０）を、ペプチドヒドラジドの酸化から生成されたペプチジルアジドに添加する。反応混合物のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で約７．０に調整する。ペプチジルアジドのチオール分解を１時間実施し、得られたペプチドチオエステルをライゲーション化学反応で直接使用するか、または逆相クロマトグラフィーで精製する（Ｈｕａｎｇ（２０１４）を参照）。
実施例２０：中間体化合物２０の固相ペプチド合成
中間体化合物２０（配列番号２６）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表２０に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000034
切断および脱保護：樹脂上のフラグメントを、フィルター反応器を使用してＤＣＭ（３×１０Ｖ）で膨潤させる。脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、０．３重量ＶのＤＴＴを混合して調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを樹脂に添加し、得られたスラリーを室温で３時間撹拌する。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（２×３Ｖ）で洗浄する。次に、得られた濾液を合わせて約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
実施例２１：中間体化合物２１のハイブリッド液相・固相ペプチド合成
中間体化合物２１（配列番号２７）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－２－ＣＴＣヒドラジン樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表２１に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000035
樹脂上のフラグメントを、フィルター反応器を使用してＤＣＭ（３×１０Ｖ）で膨潤させる。脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、０．３重量ＶのＤＴＴを混合して調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを樹脂に添加し、得られたスラリーを室温で３時間撹拌する。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（２×３Ｖ）で洗浄する。次に、得られた濾液を合わせて約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
粗ペプチドのヒドラジドを３０Ｖのライゲーション緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基緩衝液、ｐＨ３．３５）に溶解させ、約－１５℃に冷却させる。１Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液（５．０～１０．０当量）をヒドラジド溶液に添加し、約－１５℃で１０分間撹拌する。１０分後、２，２，２－トリフルオロエタンチオール（２０．０当量、ｐＨ７．０）を、ペプチドヒドラジドの酸化により生成されたペプチジルアジドに添加する。反応混合物のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で約７．０に調整する。ペプチジルアジドのチオール分解を１時間実施し、得られたペプチドチオエステルをライゲーション化学反応で直接使用するか、または逆相クロマトグラフィーで精製する（Ｈｕａｎｇ（２０１４）を参照）。
実施例２２：中間体化合物２２の固相ペプチド合成
中間体化合物２２（配列番号２８）、またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表２２に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000036
切断および脱保護：ＣＴＣ樹脂上のテトラマーをＤＣＭ（５～１０Ｖ）を使用して２×３０分間膨潤させる。３．５Ｖの１％ ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に投入し、得られた樹脂の懸濁液を窒素下で約２５℃に維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに４回繰り返す。樹脂を３．５ＶのＤＣＭで洗浄し、５～１０分間撹拌する。すべての濾液および洗浄液を合わせる。フラグメント溶液を真空下で１．５Ｖに濃縮し、温度を≦３５℃に維持する。５ＶのＩＰＡｃを溶液に添加し、残留ＩＰＡｃ／ＤＣＭ溶媒を真空下で１．５Ｖとなるまで除去し、温度を≦４０℃に維持する。５ＶのＩＰＡｃの添加および真空下での蒸留を繰り返し、３．５Ｖの最終フラグメント溶液を生成する。次に、この溶液を３×２Ｖの５．０％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、次にＩＰＡｃを減圧下で１．５Ｖとなるまで除去し、温度を≦４０℃に維持する。４～５Ｖのヘプタンを４０℃で溶液に添加する。次に、温度を約１５℃に低下させ、得られたスラリーを３０分間撹拌する。ＩＰＡｃ／ヘプタン溶媒を、減圧下で３．５Ｖとなるまで除去し、温度を≦４０℃に維持する。ヘプタンの投入および蒸留を繰り返し、得られた沈殿フラグメントのスラリーを約２０℃に冷却し、濾過し、２Ｖのヘプタンで洗浄し、得られた固体を約３５℃で乾燥させる。
実施例２３：中間体化合物２３の固相ペプチド合成
中間体化合物２３
Figure 2022545200000037
 またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～０．９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表２３に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000038
切断および脱保護：ＣＴＣ樹脂上のテトラマーをＤＣＭ（５～１０Ｖ）を使用して２×３０分間膨潤させる。３．５Ｖの１％ ＴＦＡ／ＤＣＭを反応器に投入し、得られた樹脂の懸濁液を窒素下で約２５℃に維持しながら１０～１５分間撹拌する。濾液を除去し、１．０５当量のピリジンをゆっくりと加えることにより直ちに中和する。樹脂処理を１％ＴＦＡ／ＤＣＭにより処理し、続いて濾液の中和をさらに４回繰り返す。樹脂を３．５ＶのＤＣＭで洗浄し、５～１０分間撹拌する。すべての濾液および洗浄液を合わせる。フラグメント溶液を真空下で１．５Ｖに濃縮し、温度を≦３５℃に維持する。５ＶのＩＰＡｃを溶液に添加し、残留ＩＰＡｃ／ＤＣＭ溶媒を真空下で１．５Ｖとなるまで除去し、温度を≦４０℃に維持する。５ＶのＩＰＡｃの添加および真空下での蒸留を繰り返し、３．５Ｖの最終フラグメント溶液を生成する。次に、この溶液を３×２Ｖの５．０％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＩＰＡｃを減圧下で１．５Ｖとなるまで除去し、温度を≦４０℃に維持する。４～５Ｖのヘプタンを約４０℃で溶液に添加する。次に、温度を約１５℃に低下させ、得られたスラリーを３０分間撹拌する。ＩＰＡｃ／ヘプタン溶媒を、減圧下で３．５Ｖとなるまで除去し、温度を≦４０℃に維持する。ヘプタンの投入および蒸留を繰り返し、得られた沈殿フラグメントのスラリーを約２０℃に冷却し、濾過し、２Ｖのヘプタンで洗浄し、得られた固体を約３５℃で乾燥させる。
実施例２４：中間体化合物２４の液相ペプチド合成
中間体化合物２４
Figure 2022545200000039
 またはその薬学的に許容される塩は、溶液中での標準的なカップリング化学反応を用いる、Ｈ－Ｌ－２－Ｍｅ－ＬｅｕとＦｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－ＯＨとのカップリング、ならびにそれに続く後処理および単離によって合成することができる。
実施例２５：脂肪酸部分の固相ペプチド合成（化合物２５）
化合物２５
Figure 2022545200000040
 またはその薬学的に許容される塩は、標準的なＳＰＰＳによって合成することができる。簡潔には、Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ－２－ＣＴＣ樹脂（負荷率０．６～１．１ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、以下の表２４に示す条件でＳＰＰＳを実施する。
Figure 2022545200000041
実施例２６：化学的コンジュゲートを介した、４つの中間体化合物からのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
カップリングプロトコル：配列番号６のインクレチン類似体は、ＨＬＳＰＳを介して配列番号７、８、９および１０をカップリングすることによって作製することができる。簡潔には、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の、配列番号７（１．０５～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液および配列番号８（１．００ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．３０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００～５．００ｍｍｏｌ）を用いて室温でカップリングさせる。混合物を室温で２～４時間撹拌する。次に、１０当量のＤＥＡを添加し、混合物を４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
次に、カップリングした配列番号７＋８（１．００ｍｍｏｌ）の溶液と、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の配列番号９（１．０５～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、以下を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．３０－２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００－５．００ｍｍｏｌ）使用して室温でカップリングさせる。混合物を室温で２～４時間撹拌する。次に、１０当量のＤＥＡを添加し、混合物を２～４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
次に、カップリングした配列番号７＋８＋９（１．００ｍｍｏｌ）の溶液と、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の配列番号１０（１．２０～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、以下を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．５０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００～５．００ｍｍｏｌ）を使用して室温でカップリングさせる。混合物を室温で３～４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、生成物を白色の固体として得る。
全体的な脱保護：脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、２ＶのＤＣＭ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、および０．３重量ＶのＤＴＴを混合することによって調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを約１５℃に冷却し、次に固体の、カップリングした配列番号７＋８＋９＋１０を添加し、得られた反応混合物を室温に加温し、室温で３時間撹拌する。混合物を約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、生成物の配列番号６を白色の固体として得る。
実施例２７：化学的コンジュゲートを介した、４つの中間体化合物からのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
ここで、配列番号６のインクレチン類似体は、配列番号７、８、９、１０をカップリングするための実施例２６に本質的に記載されるように、収束固相ペプチド合成（ＣＳＰＰＳ）を介して、配列番号７、１１、１２および１０をカップリングすることによって作製される。
実施例２８：化学的コンジュゲートを介した４つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
ここで、配列番号６のインクレチン類似体は、配列番号７、８、９および１０をカップリングするための実施例２６に本質的に記載されるように、本質的にＣＳＰＰＳを介して配列番号７、１３、１４および１０をカップリングすることによって作製される。
実施例２９：化学的コンジュゲートを介した３つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
配列番号６のインクレチン類似体は、ＣＳＰＰＳを介して配列番号７、１３および１５をカップリングすることによって作製することができる。簡潔には、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の、配列番号７（１．０５～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液および配列番号１３（１．００ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．３０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００～５．００ｍｍｏｌ）を用いて室温でカップリングさせる。混合物を室温で２～４時間撹拌する。次に、１０当量のＤＥＡを添加し、混合物を４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
次に、カップリングした配列番号７＋１３（１．００ｍｍｏｌ）の溶液と、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の配列番号１５（１．２０～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、以下を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．５０－２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００－５．００ｍｍｏｌ）使用して室温でカップリングさせる。混合物を室温で２～４時間撹拌する。次に、１０当量のＤＥＡを添加し、混合物を２～４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
全体的な脱保護：脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、２ＶのＤＣＭ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、および０．３重量ＶのＤＴＴを混合することによって調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを約１５℃に冷却し、次に固体の、カップリングした配列番号７＋１３＋１５を添加し、得られた反応混合物を室温に加温し、室温で３時間撹拌する。混合物を約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、生成物の配列６を白色の固体として得る。
実施例３０：化学的コンジュゲートを介した３つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
配列番号６のインクレチン類似体は、ＣＳＰＰＳを介して配列番号１６、９および１０をカップリングすることによって作製することができる。簡潔には、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の、配列番号１６（１．００ｍｍｏｌ）の溶液および配列番号９（１．０５～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．３０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００～５．００ｍｍｏｌ）を用いて室温でカップリングさせる。混合物を室温で３～４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
次に、カップリングした配列番号１６＋９（１．００ｍｍｏｌ）の溶液と、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の配列番号１０（１．２０～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、以下を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．５０－２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００－５．００ｍｍｏｌ）使用して室温でカップリングさせる。混合物を室温で２～４時間撹拌する。次に、１０当量のＤＥＡを添加し、混合物を２～４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
全体的な脱保護：脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、２ＶのＤＣＭ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、および０．３重量ＶのＤＴＴを混合することによって調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを約１５℃に冷却し、次に固体の、カップリングした配列番号１６＋９＋１０を添加し、得られた反応混合物を室温に加温し、室温で３時間撹拌する。混合物を約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、生成物の配列６を白色の固体として得る。
実施例３１：化学的コンジュゲートを介した３つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
ここで、配列番号６のインクレチン類似体は、配列番号１６、９および１０をカップリングするための実施例３０に本質的に記載されるように、本質的にＣＳＰＰＳを介して配列番号１８、１２および１０をカップリングすることによって作製される。
実施例３２：化学的コンジュゲートを介した２つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
配列番号６のインクレチン類似体は、ＣＳＰＰＳを介して配列番号１９および１５をカップリングすることによって作製することができる。簡潔には、３０～４０ＶのＤＭＳＯ／ＡＣＮ（７０：３０）中の、配列番号１８（１．００ｍｍｏｌ）の溶液および配列番号１５（１．２０～１．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵまたはＰｙＯＸｉｍ試薬（１．５０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．００～５．００ｍｍｏｌ）を用いて室温でカップリングさせる。混合物を室温で２～４時間撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。
全体的な脱保護：脱保護カクテルを、１０ＶのＴＦＡ、２ＶのＤＣＭ、０．４ＶのＴＩＰＳ、０．４ＶのＨ２Ｏ、および０．３重量ＶのＤＴＴを混合することによって調製し、均一になるまで撹拌する。カクテルを約１５℃に冷却し、次に固体のカップリングした配列番号１９＋１５を添加し、得られた反応混合物を室温に加温し、室温で３時間撹拌する。混合物を約－１０℃に冷却し、７５ＶのＭＴＢＥをゆっくりと添加する。得られたスラリーを濾過し、２×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、生成物の配列番号６を白色の固体として得る。
実施例３３：化学的コンジュゲートを介した２つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
ここで、配列番号６のインクレチン類似体は、配列番号１５および１９のカップリングのための実施例３２に本質的に記載されるように、本質的にＣＳＰＰＳを介して配列番号１８および２０をカップリングすることによって作製される。
実施例３４：化学的コンジュゲートを介した２つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
ここで、配列番号６のインクレチン類似体は、配列番号１５および１９をカップリングするために本質的に実施例３２に記載されるように、本質的にＣＳＰＰＳを介して配列番号２１および１８または配列番号２２および１９をカップリングすることによって作製されるが、ただし、２つのフラグメントのカップリング後、Ｌｙｓ１７の保護基を化学的変換によって選択的に除去し（条件は基の性質によって異なる）、脂肪酸側鎖で選択的にアシル化した後、全体的に脱保護する点で異なる。
実施例３５：ネイティブケミカルライゲーションによる２つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
配列番号６のインクレチン類似体は、ネイティブケミカルライゲーションを介して配列番号２３および２４をカップリングすることによって作製することができる。簡潔には、配列番号２３のペプチドチオエステルを、３０～５０Ｖのライゲーション緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基緩衝液、ｐＨ７．０４）に溶解させる。Ｎ末端システイン含有ペプチドフラグメントの配列番号２４（０．９～０．９５当量）をチオエステル溶液に添加する。４０当量の２，２，２－トリフルオロエタンチオール（ｐＨ７．１６）および２０当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ｐＨ７．０）を反応混合物に添加し、ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整する。反応物を室温で２４時間撹拌し、得られた溶液を直接逆相精製に使用する。
実施例３６：ネイティブケミカルライゲーションによる２つの中間体フラグメントからのインクレチン類似体のハイブリッド液相・固相合成
ここで、配列番号６のインクレチン類似体は、配列番号２３および２４のカップリングのための実施例３５に本質的に記載されるように、本質的にＣＳＰＰＳを介して配列番号２５および２６をカップリングすることによって作製することができる。
実施例３６：化合物３５の合成
Figure 2022545200000042
 ジクロロメタン（７．５Ｌ、１５．０ｖｏｌ．）を１５～３０℃の２０Ｌの４口フラスコに添加し、１８－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－１８－オキソオクタデカン酸（５００．５ｇ、１．０当量、１．３５ｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１８５．６ｇ、１．２当量、１．６１ｍｏｌ）を１５～３０℃で添加し、懸濁液を得る。反応混合物を０～１０℃に冷却し、Ｎ－エチル－Ｎ’－カルボジイミドを一度に添加し（３３８．４ｇ、１．３当量、１．７７ｍｏｌ）を溶液を得る。反応混合物を８体積の半飽和ブラインで３回洗浄する。化合物３５は、次のステップで化合物３６を作成するために直接使用する。
化合物３５の代替的方法
１８－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－１８－オキソオクタデカン酸（２０ｇ、５３．４３１ｍｍｏｌ、９９質量％）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（１．２当量、６４．１１７ｍｍｏｌ、９９．６質量％）および４－ジメチルアミノピリジン（０．２当量、１．３１ｇ、１０．７ｍｍｏｌ、１００ｍａｓｓ％）を、オーバーヘッドアジテーターを備えた１０００ｍＬのバッフル付きジャケット付き反応器に充填する。酢酸エチル（８００ｍＬ、４０体積）を添加し、得られたスラリーを周囲温度（１８℃～２３℃）で一晩（１８～２４時間）撹拌する。２４時間後、粗製サンプルの１Ｈ－ＮＭＲは、一般的に９７～９９％の反応の完了を示す。バッチを脱イオン水（３×８２ｍＬ）で抽出する。有機層を真空中で約１６０ｍｌとなるまで濃縮する。酢酸エチル（２００ｍＬ）を反応に添加し、粗反応溶液を５０℃で真空中で約１８０ｍＬとなるまで減少させる。溶液をジャケット付きフィルターに移し、撹拌しながらゆっくりと３℃に冷却する。次に、反応を３～５℃で１時間保持する。固体を濾過し、冷酢酸エチル（１８ｍＬ）で洗浄し、真空下（７インチＨｇ）で乾燥させて、化合物３５を固体として得る（２２．６ｇ、９０．５％収率、ＨＰＬＣ－ＣＡＤで９９．１７％）。
実施例３７：ｔ－ＢｕＯ－Ｃ１８－Ｇｌｕ－１－ＯｔＢｕ（化合物３６）の合成
Figure 2022545200000043
 １５～３０℃において、２０Ｌの４口フラスコ中、ジクロロメタン（２．５Ｌ、５．０ｖｏｌ．）中の（４Ｓ）－４－アミノ－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－５－オキソ－ペンタン酸（Ｈ－Ｇｌｕ－１－ＯｔＢｕ）（２８９ｇ、１．１４当量、１ｍｏｌ）の溶液に、化合物３５を添加する。次に、反応器にジイソプロピルエチルアミン（２３０ｇ、１．５当量、１．７８ｍｏｌ）を１５～３０℃で添加して溶液を得る。調製１が＜０．５％になったとき、次のステップで反応を継続させる。有機相を、ＫＨＳＯ４の２％水溶液（４ｇ／ｇ×３）で洗浄し、１～２ｖｏｌ．となるまで、Ｔ＜５０℃および＜－０．０８ＭＰａの真空下で濃縮する。アセトニトリル（８ｖｏｌ．）を反応器に入れ、＜６０℃で１～２ｖｏｌ．に濃縮する。アセトニトリル（８ｖｏｌ．）を再び反応器に入れ、＜６０℃で５～６ｖｏｌ．に濃縮する。濃縮物を４０～５０℃に冷却し、０．５～１時間撹拌し、次に２～４時間にわたり１５～３０℃に冷却する。スラリーを濾過し、アセトニトリル（３ｖｏｌ．）で洗浄し、Ｎ２下で乾燥させて、化合物３６を固体として得る（６５９．５ｇ、収率８６．３％、ＬＣＡＰ９９．１％）。
化合物３６の代替的方法
化合物３５（５０ｇ、１０４．８ｍｍｏｌ、９８質量％）、（４Ｓ）－４－アミノ－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－５－オキソ－ペンタン酸Ｈ－Ｇｌｕ－１－ＯｔＢｕ（Ｈ－Ｇｌｕ－１－ＯｔＢｕ）（２５．７ｇ、１２６ｍｍｏｌ、９９．３ｍａｓｓ％）を、オーバーヘッドアジテーターおよび熱電対を備えた１Ｌのバッフル付きジャケット付きリアクターに充填する。アセトニトリル（５００ｍＬ、１０Ｖ）を使用して、固形物を漏斗から反応容器に洗い流す。次に、ジイソプロピルエチルアミン（２２ｍＬ、１２６ｍｍｏｌ、９９．７５質量％）を反応に添加する。反応物を４０℃に加熱し、１８時間撹拌する。１Ｈ－ＮＭＲ／ＨＰＬＣ－ＣＡＤで反応の完了を確認した後、酢酸（７．２ｍＬ、１３０ｍｍｏｌ、１００質量％）および水（２１５ｍＬ、１１９３４．６ｍｍｏｌ、１００質量％）を反応液に入れ、３０～３５℃で１時間撹拌する。バッチを、オーバーヘッドアジテーターを備えたジャケット付きフィルターに移し、－２０℃に冷却する。固体は、Ｔｒ＝２℃およびＴｊ＝－９℃で溶液から結晶化し始める。固体をこの温度で１時間維持する。次に、脱イオン水（８．６Ｖ、４６０ｍＬ）をこのバッチに注ぎ、フィルターを０℃に加温する。固体を濾過し、４０℃の高真空下で乾燥させて、化合物３６を固体として得る（５５．５ｇ、９５．３％収率、ＨＰＬＣ－ＣＡＤで９９．６２％）。
実施例３８：ｔ－ＢｕＯ－Ｃ１８－Ｇｌｕ－１－ＯｔＢｕ－５－ＯＮＳｕ（化合物３７）の合成
Figure 2022545200000044
 アセトニトリル（１２．０ｖｏｌ．）を１５～３０℃で２０Ｌの４口フラスコに添加する。化合物３６（５００．４ｇ、１．０当量、０．９０ｍｏｌ）およびＮ、Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（２７８．５ｇ、１．２当量、１．０９ｍｏｌ）を１５～３０℃でフラスコに添加し、懸濁液を得る。４－ジメチルアミノピリジン（１１．０ｇ、０．１当量０．０９ｍｏｌ）を一度に加えて溶液を得る。水（１．６Ｋｇ）を０．５～１時間かけて添加する。混合物を０～１０℃に１～２時間にわたり冷却し、濾過し、アセトニトリル（２ｖｏｌ．、０～１０℃）で洗浄し、Ｎ２下で乾燥させて、化合物３７を固体として得た（５３６．０ｇ、９１．３％収率、ＬＣＡＰで１００．０％）。
化合物３７の代替的合成
化合物３６（５５ｇ、９８．９６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（３１ｇ、１２１ｍｍｏｌ、９９．６質量％）、４－ジメチルアミノピリジン（１．２２ｇ、９．８９ｍｍｏｌ、９９質量％）を１Ｌのバッフル付き、ジャケット付きの、オーバーヘッドアジテーターおよび熱電対を備えた反応器に充填する。アセトニトリル（６６０ｍＬ、１２Ｖ）を反応容器に添加する。反応物を２４℃で４時間撹拌する。１Ｈ－ＮＭＲ／ＨＰＬＣ－ＣＡＤで反応の完了を確認した後、反応液を１０００ｍＬビーカーに移し、マグネチックスターラーを備えたビーカーに脱イオン水（１８０ｍＬ）を添加する。溶液を撹拌し、反応液中で固体を崩壊させる。反応スラリーを冷蔵庫（２～１０℃）で一晩冷却する。固形物を濾過し、フィルターケーキを１２５ｍＬの冷却（２～１０℃）アセトニトリルで洗浄する。固体を高真空下、４０℃で２４時間乾燥して、化合物３７（５９．３ｇ、９１．８％収率、９９．６１％ＨＰＬＣ－ＣＡＤ）を形成させる。
実施例３９：ｔ－ＢｕＯ－Ｃ１８－Ｇｌｕ－１－ＯｔＢｕ－５－（ＡＥＥＡ）２（化合物３８）の合成
Figure 2022545200000045
 ジクロロメタン（７．５Ｌ、１５．０ｖｏｌ．）を２０Ｌの４つ口フラスコに１５～３０℃で一度に添加し、続いて（ＡＥＥＡ）２（２６１ｇ、１．１当量、０．８５ｍｏｌ）、化合物３７（５０１ｇ、１．０当量、０．７７ｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１．５当量）を、１５～３０℃で添加する。化合物３７が０．５％未満になったとき、反応を次のステップで継続させる。次に、反応混合物をＴ＜３０℃、Ｐ＜－０．０８ＭＰａの真空下で５～６ｖｏｌ．に濃縮する。酢酸エチルを粗生成物（５ｖｏｌ．）に添加し、真空下、Ｔ＜５０℃、Ｐ＜－０．０８ＭＰａで濃縮する。酢酸エチル（１０ｖｏｌ．）を濃縮物に添加し、２％ＫＨＳＯ４水溶液（５ｇ／ｇ×５～６）で洗浄し、Ｔ＜４０℃およびＰ＜－０．０８ＭＰａの真空下で１．２ｖｏｌ．に濃縮する。ジメチルホルムアミドを濃縮物（３ｇ／ｇｖｏｌ．）に添加し、生成物化合物３８を淡黄色の溶液として得る（２．４Ｋｇ、９２．７％収率、９８．７％ＬＣＡＰ）。
化合物３８の代替的合成
（ＡＥＥＡ）２（２７．６ｇ、１．１当量、８５．０ｍｍｏｌ、９５質量％）、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルアセトアミド（３０ｍＬ、２当量、２００ｍｍｏｌ、９０質量％）および酢酸エチル（２３０ｍＬ）を、熱電対およびマグネチックスターラーを備えた５００ｍＬフラスコに添加する。反応物を１８～２３℃で３時間撹拌する。３時間後、化合物３７（５０ｇ、７６．５８ｍｍｏｌ、１００質量％）および酢酸エチル（１３０ｍＬ）を反応フラスコに添加し、１８～２３℃で２時間撹拌する。１Ｈ－ＮＭＲ／ＨＰＬＣ－ＣＡＤで反応の完了を確認した後、反応液を分液漏斗に移し、有機層を２％ＫＨＳＯ４溶液（１００ｍＬ×３）および２％ＮａＣｌ溶液（１００ｍＬ×６）で洗浄する。有機層を濃縮し、得られた油状物を高真空下、５０℃で２４時間乾燥させて、化合物３８を－２０℃でワックス状固体として得る（６６．３２ｇ、Ｑ－ＮＭＲによる力価９４．９％、ＨＰＬＣ－ＣＡＤで９９．５３％）。
実施例４０：ネイティブケミカルライゲーション
Figure 2022545200000046
 化合物３９の合成
Ｆｍｏｃ－ヒドラジン－２－クロロトリチル樹脂（１．１６ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｘ合成装置で２×１０ｍＬのＤＭＦを使用してそれぞれ２０分間膨潤させる。Ｆｍｏｃ脱保護は、３ｘ１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間行う。次に、樹脂を５×１０ｍＬのＤＭＦで洗浄する。
（２Ｓ）－６－［［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－４－［（１８－ｔｅｒｔ－ブトキシ－１８－オキソ－オクタデカノイル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（化合物３８、２．１３ｇ、１．７８ｍｍｏｌ、２．１当量）およびＴＮＴＵ（０．７１５ｇ、１．９６ｍｍｏｌ、２．３１当量）を約２０．５ｍＬのＤＭＦに溶解させ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．５７ｍＬ、３．２７ｍｍｏｌ、３．８５当量）を溶液に添加する。ロータリーミキサーで１５分間混合する。１５分後、事前に活性化された化合物３８の溶液を樹脂に添加し、カップリングを８時間実施する。次に、樹脂を５×１０ｍＬのＤＭＦ、５×１０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、合成装置上で８時間乾燥させる。樹脂の負荷率は、定量的ＮＭＲにより０．４５ｍｍｏｌ／ｇと測定される。
実施例４１：化合物４０（配列番号５８）の合成
それぞれ約１．１０ｇの化合物３９（負荷値：０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を２つの４０ｍＬ反応容器に添加し、２×２０ｍＬのＤＭＦでそれぞれ２０分間膨潤させる。配列番号５８は、標準的なＳＰＰＳプロトコルを使用して合成される。
脱保護：ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピペリジン４ｘ９ｍＬ、各３０分。
カップリング：３当量のアミノ酸、３当量のＯＸＹＭＡおよび３．３当量のＤＩＣをアミノ酸カップリングに使用する。
ＳＰＰＳの際、各カップリングおよび脱保護の最終の反復後に、１分間、Ｎ２と混合しながら５×９ｍＬのＤＭＦで樹脂を洗浄する。ペプチドヒドラジド合成後に、Ｎ２混合とともにＤＣＭで樹脂を洗浄する。樹脂を合成装置上で乾燥させる。
全体的な脱保護および切断
２．５％ｗ／ｖジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５％ｖ／ｖ水、２．５％ｖ／ｖトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および９２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で調製された４５ｍＬの切断カクテルを、５００ｍＬの３つ口丸底フラスコ中の乾燥した樹脂（４．２ｇ）に添加し、約３時間撹拌する。樹脂を濾過し、２ｘ２．５ｍＬのＴＦＡで洗浄する。濾液を３５０ｍＬの冷却ＭＴＢＥに注ぎ、ペプチドを直ちに沈殿させる。濾過フラスコを２×２．０ｍＬのＴＦＡで洗浄し、冷却ＭＴＢＥに注ぐ。－２０℃まで３０分冷却した後、遠心分離する。次いで、ペプチド沈殿物を３００ｍＬのＭＴＢＥで２回洗浄し、遠心分離する。ペプチド沈殿物を２７℃の真空オーブン内で１４時間乾燥させる。２．７５ｇの粗製の化合物４０を乾燥後に得る［予測値（質量＋２Ｈ＋）／２＝１３５６．２２５７，観察値（質量＋２Ｈ＋）／２＝１３５６．２２４５］。
実施例４２：化合物４１（配列番号５９）の合成
約０．５０ｍｍｏｌの化合物４１（配列番号５９）は、化合物４０、配列番号５８の合成と同様の標準的なＳＰＰＳプロトコルによって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で合成される。
脱保護および切断：５％ｗ／ｖジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５％ｖ／ｖ水、２．５％ｖ／ｖトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で調製された２５ｍＬの切断カクテルを、乾燥した樹脂（２．２１ｇ）に添加し、ロータリーミキサーで３時間混合する。樹脂を濾過し、２ｘ２．０ｍＬのＴＦＡで洗浄する。濾液を１７５ｍＬの冷却ＭＴＢＥに注ぎ、ペプチドを直ちに沈殿させる。濾過フラスコを２ｘ２ｍＬのＴＦＡで洗浄し、冷ＭＴＢＥに注ぐ。－２０℃まで３０分にわたり冷却した後、遠心分離する。ペプチド沈殿物を１５０ｍＬのＭＴＢＥで２回洗浄し、遠心分離する。ペプチド沈殿物を２７℃の真空オーブン内で１４時間乾燥させる。乾燥後、約１．３５１ｇの粗製の化合物４１（配列番号５８）を得る。それを、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８ １０μｍカラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）で、ＲＰ－ＨＰＬＣにより、最初の３分間の１０％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）の後、２３分間の１５～３５％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）、および３～５分間の１０～１５％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）の直線勾配で精製する。約６５０ｍｇの精製された化合物４１が得られる［予測値（質量＋２Ｈ＋）／２＝１１３８．５４８６、観察値（質量＋２Ｈ＋）／２＝１１３８．５４５８］。
実施例４３：化合物４２（配列番号６０）の合成
化合物４２（チオエステル合成）、配列番号６０
粗ペプチドヒドラジド（化合物４０；配列番号５８、１１８．２ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのライゲーション緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．３Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基性、ｐＨ約３．５）に溶解させる。溶液をアセトン氷浴で－１５℃に冷却する。０．３ｍＬの１Ｍの亜硝酸ナトリウム溶液（２０．７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、６．８当量）をペプチドヒドラジド溶液に添加し、－１５℃で１５分間撹拌する。一方、０．２ｍＬのチオフェノールをライゲーション緩衝液（ｐＨ約７．０）で１．１ｍＬに希釈する。１５分後、１．１ｍＬのトリフェノール混合物をペプチドヒドラジド溶液に添加して、調製物４０から生成されたペプチジルアジドのｉｎ－ｓｉｔｕチオール開裂を生じさせる。
反応混合物のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で約７．０に調整する。ペプチジルアジドのチオール開裂を１５分間行い、化合物４２を得る（配列番号６０）。
実施例４４：化合物４３、配列番号６１（チオエステル化合物４２とのネイティブケミカルライゲーション）：
化合物４１（配列番号５９（７５．４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ））をシンチレーションバイアル中のライゲーション緩衝液（ｐＨ約７．０）２ｍＬに溶解させ、溶液を粗製のチオエステル溶液の化合物４２（配列番号６０）に添加する。バイアルを１ｍＬのライゲーション緩衝液（ｐＨ７．０）ですすぎ、リンス液を反応混合物に添加する。１．５ｍＬのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、ライゲーション緩衝液中０．２５Ｍ、ｐＨ約７．０）および１．０ｍＬのアスコルビン酸溶液（ライゲーション緩衝液中０．５３Ｍ、ｐＨ約７．０）を反応混合物に添加する。反応混合物のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨ溶液で約７．１に調整し、溶液を透明にする。反応は９～１０時間で完了し、配列番号６１を得る。
実施例４５：配列番号６２（化合物４４）の合成
Figure 2022545200000047
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭを使用して２回膨潤させる。樹脂を入れた反応器を約１５℃に冷却し、２％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（４ｍｌ／ｇ樹脂）を反応器に入れ、窒素下で１５分間撹拌する。次に、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４ｍｌ／ｇ樹脂）を充填し、１５分間撹拌し、濾過後、これを繰り返す。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液を合わせ、ＤＩＰＥＡで中和する。得られた溶液からＤＣＭを除去し、ブラインを添加してフラグメント２を沈殿させる。次に、得られたスラリーを約１５℃に保温しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られた淡黄色の固体を約３５℃で乾燥させる。
実施例４６：配列番号４２（化合物４５）の合成
Figure 2022545200000048
Figure 2022545200000049
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭを使用して２回膨潤させる。樹脂を入れた反応器を約１５℃に冷却し、２０％ ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（８ｍｌ／ｇ樹脂）を反応器に入れ、窒素下で６０分間撹拌する。次に、２０％ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（４ｍｌ／ｇ樹脂）を充填し、６０分間撹拌する。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液を合わせ、生成物からＤＣＭとＨＦＩＰを除去し、ヘプタンおよびエーテルを添加してフラグメント３を沈殿させる。次に、得られたスラリーを約１５℃に保温しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られたオレンジ色の固体を約３５℃で乾燥させる。
実施例４７：配列番号３１（化合物２８）の合成
Figure 2022545200000050
フラグメントの切断および分離：ＣＴＣ樹脂上のフラグメントを、ＤＣＭを使用して２回膨潤させる。樹脂を入れた反応器を約１５℃に冷却し、２％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（４ｍｌ／ｇ樹脂）を反応器に入れ、窒素下で１５分間撹拌する。次に、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４ｍｌ／ｇ樹脂）を充填し、１５分間撹拌し、濾過後、これを繰り返す。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液を合わせ、ＤＩＰＥＡで中和する。得られた溶液からＤＣＭを除去し、ブラインを添加してフラグメント２を沈殿させる。次に、得られたスラリーを約１５℃に保温しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られたオフホワイトの固体を約３５℃で乾燥させる。
実施例４８：配列番号４３（化合物４６）の合成
Figure 2022545200000051
フラグメントの切断および分離：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上のフラグメントを、１０ＶのＤＣＭを使用して１０～２０分間にわたり２回膨潤させる。樹脂を入れた反応器を約１５℃に冷却し、６％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍｌ／ｇ樹脂）で１５分間、３％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍｌ／ｇ樹脂）で１５分間、１％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（１０ｍｌ／ｇ樹脂）で５分間、１％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍｌ／ｇ樹脂）で３分間、１％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（２．５ｍｌ／ｇ樹脂）で３分間、順次洗浄する。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液は一緒に混合する。得られた溶液から減圧下でＤＣＭを除去し、ＥｔＯＡｃで再構成する。ヘプタンを溶液に添加し、得られたスラリーを約１５℃の温度に維持しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られたオフホワイトの固体を約３５℃で乾燥させる。
実施例４９：配列番号４４（化合物４７）の合成
Figure 2022545200000052
フラグメントの切断および分離：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上のフラグメントを、１０ＶのＤＣＭを使用して１０～２０分間にわたり２回膨潤させる。樹脂を入れた反応器を約１５℃に冷却し、６％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍｌ／ｇ樹脂）で１５分間、３％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍｌ／ｇ樹脂）で１５分間、１％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（１０ｍｌ／ｇ樹脂）で５分間、１％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍｌ／ｇ樹脂）で３分間、１％ ＴＦＡ／ＤＣＭ（２．５ｍｌ／ｇ樹脂）で３分間、順次洗浄する。樹脂を濾過し、３×１０ＶのＤＣＭで洗浄する。すべての濾液は一緒に混合する。得られた溶液から減圧下でＤＣＭを除去し、ＥｔＯＡｃで再構成する。ヘプタンを溶液に添加し、得られたスラリーを約１５℃の温度に維持しながら濾過する。ケーキに新鮮なＭＴＢＥを１４Ｖ添加し、約１５℃で３０分間撹拌した後、濾過する。もう一度洗浄を繰り返し、得られたオフホワイトの固体を約３５℃で乾燥させる。
実施例５０：配列番号２９の調製：
化学的コンジュゲートを介した４つの中間体フラグメントからの配列番号２９のハイブリッド液相・固相合成。
配列番号２９は、ＨＬＳＰＳを介して配列番号７、４２、３１および６２をカップリングすることによって作製することができる。配列番号７および６２をカップリングして配列番号４３を生成させる。配列番号４２および３１をカップリングして配列番号４４を生成させる。配列番号４３および配列番号４４をカップリングして配列番号２９を生成させる。
簡潔には、１０ＶのＤＭＳＯ中の配列番号７（１．００ｍｍｏｌ）の溶液および配列番号６２（１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ、ＤＥＰＢＴまたはＥＤＣ／ＨＯＮＢ試薬（１．３０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２ｍｍｏｌ）を使用して、室温でカップリングする。反応がＨＰＬＣによって完了したとみなされるまで、混合物を室温で撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、配列番号４３をオフホワイトの固体として得る。
次に、ｘＶのＤＭＳＯ中の配列番号３１（１．００ｍｍｏｌ）の溶液および配列番号４２（１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ、ＤＥＰＢＴまたはＥＤＣ／ＨＯＮＢ試薬（１．３０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２ｍｍｏｌ）を使用して、室温でカップリングする。反応がＨＰＬＣによって完了したとみなされるまで、混合物を室温で撹拌する。混合物を２０Ｖの１５～２０％ブライン溶液でクエンチし、次にさらに１０Ｖの水を添加し、１０分間撹拌する。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させて、配列番号４４をオフホワイトの固体として得る。
最後に、１７ＶのＴＨＦ中の配列番号４３（１．００ｍｍｏｌ）の溶液および配列番号４４（１．０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＥＰＢＴ試薬（１．３０～２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）を使用して室温でカップリングする。反応がＨＰＬＣによって完了したとみなされるまで、混合物を室温で撹拌する。混合物を２０Ｖの水でクエンチする。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０Ｖの水で洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物を白色の固体として得る。得られたペプチドを、出発物質１ｇあたり、１０ｍｌのＴＦＡ：ＴＩＰＳ：ＤＴＴ：水（９２．５：２．５：２．５：２．５）のカクテルで脱保護する。室温で３時間撹拌した後、温度を３０℃未満に保ちながら、カクテル１ｍＬあたり４ｍＬの２０％ヘプタン／ＭＴＢＥで生成物を沈殿させる。得られたスラリーを濾過し、固体を３×１０ＶのＭＴＢＥで洗浄する。固体を真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、生成物をオフホワイトの固体として得る。
実施例５１：配列番号７の代替的合成
合成では、０．８０ｍｍｏｌ／ｇの負荷でＦｍｏｃ－Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。
Figure 2022545200000053
配列番号７に結合した樹脂（５４ｇ、約２４．０ｍｍｏｌ）を、２×３００ｍＬ（各３０分）の２０％Ｐｉｐ／ＤＭＦで処理する。２）６×３００ｍＬのＤＭＦ、続いて５×３００ｍＬのＤＣＭで洗浄する。３）５００ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ（５／９５、ｖ／ｖ）を添加し、２時間撹拌する。４）混合物を濾過し、１０００ｍＬのＤＣＭで洗浄し、濾液の総量を５００ｍＬにする。５）約２５０ｍＬに濃縮する。６）２５０ｍＬのＭＴＢＥを添加する。７）手順５～６を５～６回繰り返す。８）湿ったケーキを濾過して回収し、３３℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、配列番号７（１８．３ｇ、７５％の収率）の白色の固体を生成させる。ＵＰＬＣを使用した分離固体の分析（９４．４面積％）。ＬＣ－ＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋）：１０２０．５８。
実施例５２：配列番号４５（化合物４８）の合成
合成では、０．８０ｍｍｏｌ／ｇの負荷で２－ＣＴＣ樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。
Figure 2022545200000054
Figure 2022545200000055
配列番号４５のソフト切断：
１）配列番号４５に結合した樹脂（４．０ｇ、約１．３４ｍｍｏｌ）を添加し、４０ｍＬの切断カクテルＴＦＡ／ＤＣＭ（１／９９、ｖ／ｖ／ｖ）を添加する。２）室温で１０分間撹拌する。３）濾過し、濾液を回収する。４）濾液を０．４４ｍＬのピリジン（１／１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）で中和する。５）手順１～４をさらに３回繰り返す。６）合わせた濾液を濃縮乾固する。７）スラリーを１０ｍＬのＤＭＳＯで溶解させる。８）ＤＭＳＯ溶液をゆっくりと１００ｍＬの冷水に撹拌しながら添加する。９）濾過し、沈殿物を回収する。１０）５０ｍＬの水で２回再スラリー化する。１１）真空中で一晩乾燥させて、配列番号４５（２．５ｇ、５８％の収率）の白色固体を生成させる。ＵＰＬＣを使用した分離固体の分析（９５．０面積％）。ＬＣ－ＭＳ（［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２）：１６０４．９７。
実施例５３：配列番号１０の代替的合成
合成では、０．８０ｍｍｏｌ／ｇの負荷でＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ２－ＣＴＣ樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。
Figure 2022545200000056
ソフト切断：１）配列番号１０に結合した樹脂（６０ｇ、約４０ｍｍｏｌ）を添加し、６００ｍＬの切断カクテルＴＦＡ／ＤＣＭ（１／９９、ｖ／ｖ／ｖ）を添加する。２）室温で１０分間撹拌する。３）濾過し、濾液を回収する。４）濾液を６．６ｍＬのピリジン（１／１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）で中和する。５）手順１～４をさらに３回繰り返す。６）合わせた濾液を濃縮乾固する。７）６０ｍＬのＤＭＳＯでスラリーを溶解させる。８）ＤＭＳＯ溶液をゆっくりと６００ｍＬの冷水に撹拌しながら添加する。９）濾過して濾液を回収する。１０）３００ｍＬの水で２回再スラリー化する。１１）真空中で一晩乾燥させて、配列番号１０（５６．４ｇ、１２５％の収率）を湿った固体として生成させる。ＵＰＬＣを使用した分離固体の分析（９３．１面積％）。ＬＣ－ＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋）：２３４１．５２。
実施例５４：ＬＰＰＳによる配列番号４６（化合物４９）の合成：
２０ｍＬのガラス製のシンチレーションバイアルに、配列番号７（２５０ｍｇ、７７．９μｍｏｌ）、配列番号４５（１０３ｍｇ、９０．７μｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ（５ｍＬ）を添加する。この溶液にＤＩＥＡ（８１μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＰｙＡＯＰ（７－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（１００ｍｇ、１９２μｍｏｌ）を添加する。反応を４時間撹拌し、３５ｍＬの冷水をゆっくりと添加する。沈殿した生成物を濾過によって回収し、続いて水（２ｘ３５ｍＬ）で洗浄する。湿ったケーキを真空下で乾燥させて、配列番号４６（化合物４９）を白色の固体として得る（１９９ｍｇ、６１％の収率）。ＵＰＬＣ：４６．２面積％。
実施例５５：ＬＰＰＳによる配列番号４７（化合物５０）の合成：
２０ｍＬのガラス製のシンチレーションバイアルに、配列番号４６（５００ｍｇ、１２０μｍｏｌ）、続いて２ｍＬのＭｅＣＮ（２ｍＬ）を添加する。Ｅｔ２ＮＨ（０．５ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を添加し、４時間撹拌する。溶液を濃縮して乾固させる。５ｍＬのＭｅＣＮを添加し、再び濃縮乾固する。ＭｅＣＮの添加および乾燥をさらに２～３回繰り返す。１ｍＬのＭｅＣＮを添加してスラリーを溶解させ、次に反応溶液を１５ｍＬの冷却ＭＴＢＥ中に撹拌しながらゆっくりと添加する。沈殿物を濾過して回収し、１０ｍＬのＭＴＢＥで２回再スラリー化する。湿ったケーキを真空下で乾燥させて、配列番号４７（化合物５０）を白色の固体として得る（２００ｍｇ、４２％の収率）。ＵＰＬＣ：７５．３面積％。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋／３：１３３１．６０。
実施例５６：ＬＰＰＳによる配列番号４８（化合物５１）の合成：
２０ｍＬのガラス製のシンチレーションバイアルに、配列番号１０（７５ｍｇ、３２．１μｍｏｌ）、配列番号４７（１００ｍｇ、２５．０μｍｏｌ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ；５ｍｇ、３６．８μｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ（２ｍＬ）を添加する。この溶液にＤＩＥＡ（３０μＬ、１７３μｍｏｌ）を添加し、続いてＰｙＡＯＰ（３３ｍｇ、６３μｍｏｌ）を添加する。反応を５時間撹拌し、１５ｍＬの冷水をゆっくりと添加する。沈殿した生成物を濾過によって回収し、続いて水（３×１０ｍＬ）で洗浄する。湿ったケーキを真空下で乾燥させて、配列番号４８（化合物５１）を白色の固体として得る（１２０ｍｇ、７６％の収率）。ＵＰＬＣ：５３．６面積％。
実施例５７：全体的な脱保護による配列番号６の合成
１ｍＬの切断カクテル溶液ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ／ＤＴＴ（０．９２５／０．０２５／０．０２５／０．０２５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を添加し、次に配列番号４８のサンプル（７６ｍｇ、１２．０μｍｏｌ）をこの混合物に添加し、溶液を得る。混合物を周囲温度で３時間撹拌する。反応混合物を－１５℃のＭＴＢＥ（１０ｍＬ）に注ぎ、得られた懸濁液を約３０分間撹拌する。フィルターで濾過し、湿ったケーキをＭＴＢＥ（２×１０ｍＬ）で洗浄する。湿ったケーキを真空中で３５℃で乾燥させて、配列番号６（８０ｍｇ、４４．８面積％、１４０％の粗収率）を湿った固体として得る。ＵＰＬＣ：４４．８面積％。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋／３：１１８３．２０。
実施例５８：配列番号１１の代替的合成
合成では、０．８３５ｍｍｏｌ／ｇの負荷でＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＣＴＣ樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。
Figure 2022545200000057
ソフト切断：１）配列番号１１に結合した樹脂（１０．０ｇ、約４．４ｍｍｏｌ）を添加し、１００ｍＬの切断カクテルＴＦＡ／ＤＣＭ（１／９９、ｖ／ｖ）を添加する。２）室温で１０分間撹拌する。３）濾過し、濾液を回収する。４）濾液を１．１ｍＬのピリジン（１／１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）で中和する。５）手順１～４をさらに３回繰り返す。６）合わせた濾液を濃縮乾固する。７）２０ｍＬのＤＭＳＯでスラリーを溶解させる。８）ＤＭＳＯ溶液をゆっくりと１００ｍＬの冷水に撹拌しながら添加する。９）濾過し、沈殿物を回収する。１０）１００ｍＬの水で２回再スラリー化する。１１）真空中で一晩乾燥させて、配列番号１１（４．０１ｇ、６２％収率）の白色固体を生成させる。ＵＰＬＣを使用した分離固体の分析（９７．６面積％）。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：１４４５．７８。
実施例５９：配列番号１８の代替的合成
合成では、０．７１ｍｍｏｌ／ｇの負荷でＦｍｏｃ－Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。
Figure 2022545200000058
Figure 2022545200000059
ソフト切断：１）最後の２×３０分間の脱Ｆｍｏｃサイクルの後、配列番号１８（８．２ｇ、約３．１ｍｍｏｌ）に結合した樹脂を４０ｍＬの切断カクテルＴＦＡ／ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（１／２５／７４、ｖ／ｖ／ｖ）を添加し、２５℃で５分間撹拌する。２）濾液を濾過して回収し、濾液を０．４４ｍＬのピリジン（１／１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）で中和する。３）切断プロセスをさらに２回繰り返す。４）合わせた濾液を濃縮乾固する。５）スラリーを１０ｍＬのＤＭＳＯで溶解させ、ＤＭＳＯ溶液を撹拌しながらゆっくりと２００ｍＬのＭＴＢＥに添加する。６）濾過し、沈殿物を回収する。７）４０ｍＬのＭＴＢＥでさらに２回再スラリー化し、沈殿物を濾過する。８）粗製物質を真空中で一晩乾燥させ、ＨＰＬＣにより、９２．５％の純度で２．７６ｇの粗製物（４１．４％の収率）を得る。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２：１１１３．９０。
実施例６０：配列番号２０の代替的合成
合成では、０．８０ｍｍｏｌ／ｇの負荷で２－ＣＴＣ樹脂を使用する。一般的なＳＰＰＳ手順を、以下の変更を加えて使用する。
Figure 2022545200000060
Figure 2022545200000061
ソフト切断：１）配列番号２０に結合した樹脂（５．７ｇ、約１０ｍｍｏｌ）を添加し、６０ｍＬの切断カクテルＴＦＡ／ＤＣＭ（１／９９、ｖ／ｖ／ｖ）を添加する。２）室温で１０分間撹拌する。３）濾過し、濾液を回収する。４）濾液を６．６ｍＬのピリジン（１／１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）で中和する。５）手順１～４をさらに３回繰り返す。６）合わせた濾液を濃縮乾固する。７）３０ｍＬのＤＭＳＯでスラリーを溶解させる。８）ＤＭＳＯ溶液をゆっくりと３００ｍＬの冷水に撹拌しながら添加する。９）濾過し、沈殿物を回収する。１０）２００ｍＬの水で２回再スラリー化する。１１）真空中で一晩乾燥させて、配列番号２０（４．５ｇ、６３．４％収率）の白色固体を生成させる。ＵＰＬＣを使用した分離固体の分析（９９．４面積％）。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２：２０５３．３９。
実施例６１：ＬＰＰＳによる配列番号４９（化合物５２）の合成：
２０ｍＬのガラス製のシンチレーションバイアルに、配列番号１１（１．０当量、１４５ｍｇ）、配列番号７（１．１当量、１２５ｍｇ）、およびＤＭＳＯ／ＭｅＣＮ（５ｍＬ、４／１、ｖ／ｖ）を添加し、すべての材料を溶解させる。ＤＩＥＡ（３．０当量、０．０５５ｍＬ）、続いてＰｙＯｘｉｍ（１．５当量、８０ｍｇ）を反応混合物に添加する。反応物を４時間撹拌し、次に撹拌しながら４０ｍｌの水をゆっくりと添加する。沈殿した生成物を濾過によって回収し、続いて水（２×４０ｍＬ）で洗浄する。湿ったケーキを真空下で乾燥させて、ＨＰＬＣにより純度８９．５％の白色固体（１８０ｍｇ、収率７３．２％）として粗製の固体の配列番号４９を得る。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２：１２２５．２。
実施例６２：ＬＰＰＳによる配列番号１８の合成：
２０ｍＬのガラス製のシンチレーションバイアルに、配列番号４９（７００ｍｇ）、続いて８ｍＬのＤＭＳＯ（２ｍＬ）を添加する。Ｅｔ２ＮＨ（２．０ｍＬ）を添加し、４時間撹拌する。溶液を濃縮して乾固させる。６０ｍＬの冷却ＭＴＢＥを撹拌しながら添加する。沈殿物を濾過して回収し、６０ｍＬのＭＴＢＥで２回再スラリー化する。湿ったケーキを真空下で乾燥させて、ＨＰＬＣにより、純度８２．３％の白色固体（５２０ｍｇ、収率８２％）として配列番号１８を得る。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２：１１１３．８。
実施例６３：ＬＰＰＳによる配列番号４８の合成：
２０ｍＬのガラス製のシンチレーションバイアルに、配列番号２０（１．０当量、８４ｍｇ）、配列番号１８（１．１当量、５０ｍｇ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、１．０当量、３ｍｇ）、およびＤＭＳＯ（２ｍＬ）を添加し、すべての材料を溶解させる。この溶液にＤＩＥＡ（６当量、２１μＬ）を添加し、続いてＰｙＡＯＰ（２．５当量、２２ｍｇ）を添加し、６時間混合する。追加のＰｙＡＯＰ（１．０当量、９ｍｇ）およびＤＩＥＡ（２．５当量、９μＬ）を添加し、１２時間混合する。追加のＰｙＡＯＰ（１．０当量、９ｍｇ）およびＤＩＥＡ（２．５当量、９μＬ）を添加し、６時間混合する。撹拌しながら反応溶液をゆっくりと冷水に添加する。沈殿した生成物を濾過により回収し、続いて水で３回（３×１０ｍｌ）洗浄する。生成物を真空下で乾燥させて、白色の固体の配列番号４８（９０ｍｇ、６９．８％の収率）を得る。ＵＰＬＣ：８１．９面積％。
実施例６４：配列番号６を生成させるための配列番号４８の全体的な脱保護
全体的な脱保護は、以下の手順を使用して実施する：１）４ｍＬの切断カクテルのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ／ＤＴＴ（０．９２５／０．０２５／０．０２５／０．０２５）をＲ１に添加し、続いて配列番号４８（１８０ｍｇ）を添加する。２）２０～３０℃で３時間撹拌する。３）溶液を冷却したＭＴＢＥ（３０ｍＬ）に注ぐ。懸濁液を０．５時間撹拌する。４）フィルターで濾過した後、ＭＴＢＥによる洗浄（３０ｍＬ）を２回行う。５）湿ったケーキを、一定重量になるまで減圧下で乾燥させる。６）ＨＰＬＣにより純度６６．３％で乾燥した粗生成物１８０ｍｇを得る。
実施例６５：ネイティブケミカルライゲーション
樹脂化合物５３の合成：
Figure 2022545200000062
Ｆｍｏｃ－ヒドラジン－２－クロロトリチル樹脂（３０．０６ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を３００ｍＬのＤＣＭで１５分間膨潤させる。２×４００ｍＬＤＭＦでそれぞれ１５分間膨潤させる。Ｆｍｏｃ脱保護は、３×４００ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間行う。次に、樹脂を５×４００ｍＬＤＭＦで洗浄する。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（ａｌｌｏｃ）－ＯＨ（３４．６３ｇ、７６．５ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＨＢＴＵ（２９．１７ｇ、７６．９ｍｍｏｌ、３．０２当量）を４００ｍＬのＤＭＦに溶解させる。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２７ｍＬ、１５５ｍｍｏｌ、６．０８当量）をアミノ酸溶液に添加する。次に、溶液を樹脂調製物ＸＸに添加し、６時間撹拌する。樹脂を５×４００ｍＬ ＤＭＦ、次に５×３００ｍＬ ＤＣＭで洗浄し、樹脂を３５℃の真空オーブンで約１６時間乾燥させる。樹脂の負荷率は、定量的ＮＭＲにより０．５２ｍｍｏｌ／ｇと測定される。
実施例６６：ペプチドヒドラジド配列番号５０（化合物５４）の合成
約１２．１９ｇの樹脂化合物５３（５．４ｍｍｏｌ、負荷値：０．４４ｍｍｏｌ／ｇ）を３×１２０ｍＬ ＤＭＦでそれぞれ１５分間膨潤させる。ペプチドヒドラジド（配列番号５０）を、前述のように標準ＳＰＰＳを使用して合成する。
脱保護：ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピペリジンで４×１００ｍＬ、各２０分。
カップリング：３当量のアミノ酸、３当量のＯＸＹＭＡおよび３．３当量のＤＩＣをアミノ酸カップリングに使用する。
ＳＰＰＳの際、各カップリングおよび脱保護の最終の反復後に、５分間、Ｎ２と混合しながら５×１２０ｍＬのＤＭＦで樹脂を洗浄する。
ペプチドヒドラジド合成後に、Ｎ２混合とともにＤＣＭで樹脂を洗浄する。樹脂を合成装置上で乾燥させる。
Ａｌｌｏｃの脱保護および側鎖のカップリング：
樹脂を５×１２０ｍＬのＤＣＭで５分間撹拌しながら洗浄する。パラジウムテトラキス（５００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、０．１当量）およびフェニルシラン（０．７ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ、１．０２当量）の溶液を７５ｍＬのＤＣＭ中に調製する。それを樹脂に添加し、２０分間撹拌する。５×１２０ｍＬＤＣＭで洗浄し、それぞれ５分間撹拌する。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４およびＰｈＳｉＨ３によるＡｌｌｏｃ脱保護を２回繰り返す。
樹脂を５×１２０ｍＬＤＭＦで洗浄し、それぞれ５分間撹拌する。ＴＮＴＵ（３．９５ｇ、１０．８２ｍｍｏｌ、２当量）を（Ｓ）－１３－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－３６，３６－ジメチル－１０，１５，３４－トリオキソ－３，６，３５－トリオキサ－９，１４－ジアザヘプタトリアコンタン酸（化合物２５、２７ｍＬ、０．２９ｇ／ｍＬ、７．８７３ｇ、１０．８ｍｍｏｌ、２当量）のＤＭＦ溶液に溶解させ、この溶液をＤＭＦで７５ｍＬとする。３．８ｍＬのＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３．８ｍＬ、２１．８２ｍｍｏｌ、４．０ｍｍｏｌ）を化合物２５の溶液に添加し、１０分間撹拌する。次にそれを樹脂に添加し、１４時間撹拌する。次に、樹脂を５×１２０ｍＬ ＤＭＦ（５分間撹拌）、および５×１２０ｍＬ ＤＣＭ（５分間撹拌）で洗浄する。樹脂を真空オーブンで３５℃で約１６時間乾燥させる。
全体的な脱保護および切断：
２．５％ｗ／ｖジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５％ｖ／ｖ水、２．５％ｖ／ｖトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および９２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で調製された２５０ｍＬの切断カクテルを、５００ｍＬの３つ口丸底フラスコ中の乾燥した樹脂（２２．２ｇ）に添加し、約２．５時間撹拌する。樹脂を濾過し、２×７．５ｍＬのＴＦＡで洗浄する。濾液を１．４０Ｌの冷却ＭＴＢＥに注ぎ、ペプチドを直ちに沈殿させる。濾過フラスコを２×５ｍＬのＴＦＡで洗浄し、冷却ＭＴＢＥに注ぐ。－２０℃まで３０分冷却した後、遠心分離する。次いで、ペプチド沈殿物を３００ｍＬのＭＴＢＥで２回洗浄し、遠心分離する。ペプチド沈殿物を２７℃の真空オーブン内で１６時間乾燥させる。乾燥後、約９．９ｇの粗製の配列番号５０を得る。
実施例６７：チオエステル配列番号５１（化合物５５）の合成：
粗製のペプチドヒドラジド（配列番号５０、３．６５ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬのライゲーション緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基性、ｐＨ約７．０）に溶解させる。５Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨを約３．３に調整し、溶液をアセトン氷浴中で－１５℃に冷却する。２．５ｍＬの４．３１Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液（７４２．７ｍｇ、１０．８ｍｍｏｌ、７．６当量）をペプチドヒドラジド溶液に添加し、－１５℃で１５分間撹拌する。一方、４－メルカプトフェノール（１．０５２ｇ、８．３４ｍｍｏｌ）を３ｍＬのライゲーション緩衝液に懸濁し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液でｐＨを約７．０に調整し、ライゲーション緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基性、ｐＨ約７．０）で１０ｍＬとする。１５分後、７．５ｍＬの４－メルカプトエタノールをペプチドヒドラジド溶液に添加して、配列番号５０から生成されたペプチジルアジドのｉｎ－ｓｉｔｕチオール開裂を生じさせる。
反応混合物のｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で約６．５に調整する。ペプチジルアジドのチオール開裂を１５分間実施し、粗製のチオエステル混合物を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ １０μｍカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ）で、周囲温度で、５％酢酸アンモニウムを一定にしつつ、最初の３分間は１０％アセトニトリル／水、３分～５分間は１０～３０％アセトニトリル／水、次に３０～５５％アセトニトリル／水の直線勾配で２５分間にわたり、ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製する。これにより、約０．４１５ｇのペプチドチオエステル（配列番号５１）を得る。［予測値（質量＋２Ｈ＋）／２＝１３４２．７０５２、観察値（質量＋２Ｈ＋）／２＝１３４２．６９５８］。
実施例６８：配列番号５３を合成するためのネイティブケミカルライゲーション
６Ｍの塩酸グアニジンおよび０．１Ｍのリン酸水素二ナトリウム一塩基（ｐＨ７．０）の水溶液は、ネイティブケミカルライゲーションで使用されるライゲーション緩衝液である。緩衝液を窒素ガスで１５分間脱気する。４－メルカプトフェノール（１９３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１０当量）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、６５６．６ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ、１５．３当量）およびアスコルビン酸（２６９ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１０当量）を３口の丸底フラスコに添加する。フラスコを窒素ガス下に置く。４１ｍＬのライゲーション緩衝液を添加し、丸底フラスコ内の試薬を溶解させる。溶液のｐＨを、５Ｎ ＮａＯＨ溶液で約７．０に調整する。ペプチドチオエステル配列番号５１（４０６．８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＮ末端システインフラグメント配列番号５２（化合物５６）（３２６．５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）を上記の溶液に添加する。ｐＨを５Ｎ ＮａＯＨ溶液で約７．０に調整する。反応混合物を窒素下で約１０時間撹拌する。チオエステル配列番号５１の大部分が消費された後、反応混合物を－２０℃の冷凍庫に約１４時間保存する。配列番号５３を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ １０μｍカラム（３０ｍｍ×２５０ｍｍ）で、周囲温度で、５％酢酸アンモニウムを一定にしつつ、最初の３分間は２０％アセトニトリル／水、３分～５分間は２０～３０％アセトニトリル／水、次に３０～５０％アセトニトリル／水の直線勾配で２５分間にわたり、ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製する。これにより、約０．５２ｇのペプチドチオエステル（配列番号５３）を得る。［予測値（質量＋３Ｈ＋）／３＝１５８７．８２１９、観察値（質量＋３Ｈ＋）／３＝１５８７．８１９８］。
光脱硫：３Ｍ塩酸グアニジンおよび０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基性（ｐＨ約７．０）の水性緩衝液を新たに調製する。７．６４ｍＭトリス（２，２’－ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）六水和物（２．８６ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）の０．５ｍＬ溶液を緩衝液で調製する。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、６４．３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を緩衝液に懸濁させ、５Ｎ ＮａＯＨ溶液でｐＨを約７．０に調整する。これを緩衝液で２ｍＬに希釈する。配列番号５３（１０ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ）を、７ｍＬのシンチレーションバイアル中の４ｍＬの緩衝液に溶解させる。トリフェニルホスフィン－３，３’，３’’－トリスルホン酸三ナトリウム塩（ＴＰＰＴＳ、２３１．２ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ、１９４当量）および２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮａ、３２．６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、９５当量）を配列番号６の溶液に添加する。２８μＬのトリス（２，２’－ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）六水和物（０．０００２１ｍｍｏｌ、０．１当量）および２０μＬのＴＣＥＰ溶液（０．００２２ｍｏｌ、１．０当量）を反応混合物に添加する。バイアルをＰｅｎｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏａｔｉｎｇｓフォトリアクターｍ１に配置し、ＬＥＤ強度９１％で４５９ＲＰＭで撹拌する。反応混合物の加熱を防ぐために、ファンを３５６４ＲＰＭで作動させる。約３．５時間後、ＴＣＥＰ（０．４０ｍｇ、０．７当量）をさらに添加し、反応混合物を光反応器中で１６時間撹拌する。１６時間後、反応は完了し、配列番号５３の９５％以上が配列番号６に変換される。
金属フリーの脱硫：６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム一塩基性（ｐＨ７．０）の水溶液が、この反応に使用される緩衝液である。緩衝液を窒素ガスで１時間以上完全にパージする。配列番号５３（４０．３ｍｇ、０．００８５ｍｍｏｌ）、２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩（２７．７ｍｇ、０．０８５７ｍｍｏｌ、１０．１当量）、Ｌ－グルタチオン還元（Ｌ－ＧＳＨ、２５．９ｍｇ、０．０８４３ｍｍｏｌ、１０当量）およびトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、３６．５ｍｇ、０．１２７３ｍｍｏｌ、１５．０当量）を４ｍＬの緩衝液に溶解させる。反応混合物を再び窒素ガスで約２分間脱気し、５Ｎ ＮａＯＨでｐＨを約７．０に調整する。溶液を窒素下、４５℃で１２時間、次に室温で８時間撹拌する。２０時間後、配列番号５３のほとんどが配列番号６に変換される。［予測値（質量＋３Ｈ＋）／３＝１６０４．５１５３、観察値（質量＋３Ｈ＋）／３＝１５７７．１５８１］。
実施例６９：システイニルプロリルエステル（ＣＰＥ）を使用し、配列番号５２および５４を使用した、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）による配列番号５３（化合物５７）の合成。
３Ｍ緩衝液：塩酸グアニジン（２．８６ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、リン酸二水素ナトリウム（０．２４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）および塩酸トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン［ＴＣＥＰ］（０．０１６６ｇ、０．０５７９ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬの遠心分離チューブで秤量し、脱イオン水に溶解させ、約９．５ｍＬとする。必要に応じて、５Ｎ ＮａＯＨを添加し、緩衝液のｐＨを約８．３に調整する。ｐＨがオーバーシュートした場合は、１Ｎ ＨＣｌを添加して約８．３に再調整する。
ライゲーションの一般的な手順：
１ｍＬの緩衝液を、予め秤量した配列番号５４［ＣＰＥ－ペプチド類似体］（０．０１ｇ、０．００３ｍｍｏｌ、９４．６９質量％）および配列番号５２［Ｃｙｓ－ペプチド］（０．００７３ｇ、０．００３２ｍｍｏｌ、９６．９質量％）を含む５ｍＬのシンチレーションバイアルに添加する。ペプチドフラグメントを、超音波処理によって３Ｍ緩衝液に完全に溶解させる。溶液のｐＨを記録し、５Ｎ ＮａＯＨを加えることでｐＨ約８．３０に再調整する。ｐＨがオーバーシュートした場合は、１Ｎ ＨＣｌを添加してｐＨ約８．３に再調整する。次に、溶液をＨＰＬＣバイアルに移し、３７℃（３２℃の内部温度）でＥＬＴＩＶＯにより様々な時点でサンプルをモニターする。配列番号５３類似体への完全な変換（Ｑ－Ｔｏｆで最大６９％）は、一般に１８時間後に観察される。
５Ｍ緩衝液：塩酸グアニジン（４．７８ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）、リン酸二水素ナトリウム（０．２４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）および塩酸トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン［ＴＣＥＰ］（０．０１６６ｇ、０．０５７９ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬの遠心分離チューブで秤量し、脱イオン水に溶解させ、約９．５ｍＬとする。必要に応じて、５Ｎ ＮａＯＨを添加し、緩衝液のｐＨを約８．３に調整する。ｐＨがオーバーシュートした場合は、１Ｎ ＨＣｌを添加して約８．３に再調整する。
ライゲーションの一般的な手順：
３ｍＬの緩衝液を、予め秤量した配列番号５４［ＣＰＥ－ペプチド類似体］（０．０１ｇ、０．００３ｍｍｏｌ、９４．６９質量％）および配列番号５２［Ｃｙｓ－ペプチド］（０．００７３ｇ、０．００３２ｍｍｏｌ、９６．９質量％）を含む５ｍＬのシンチレーションバイアルに添加する。ペプチドフラグメントを、超音波処理によって５Ｍ緩衝液に完全に溶解させる。溶液のｐＨを記録し、５Ｎ ＮａＯＨを加えることでｐＨ約８．３０に再調整する。ｐＨがオーバーシュートした場合は、１Ｎ ＨＣｌを添加してｐＨ約８．３に再調整する。チオール［例えば、ＭｅＳＮａ、チオフェノール、ヒドロキシチオフェノール］（５当量）を反応溶液に添加する。ｐＨを再度モニターし、必要に応じて１Ｎ ＮａＯＨまたは１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨ約８．３にさらに調整する。次に、溶液をＨＰＬＣバイアルに移し、サンプルを様々な時点で３７℃（３２℃の内部温度）でＨＰＬＣによりモニターする。配列番号５３への完全な変換は、一般に約１７時間後に観察される（ＨＰＬＣによる）。
実施例７０：Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｐｒｏ－グリコール酸－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ（化合物５８）の合成
Figure 2022545200000063
 ステップ１（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨカップリング）：
最初のカップリングの前に、Ｆｍｏｃ－ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（０．７４ｇ／ｍｍｏｌ、１．３５ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を反応容器に添加する。樹脂を３×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１５分間膨潤させた後、３×１０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）で３０分間脱保護し、それぞれ、５×１０ｍｌのＤＭＦで１分間洗浄する。（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－メチル－ブタン酸（１．０１８ｇ、３．００ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．７４ｇ、３．３０ｍｍｏｌ、６０質量％）の１０ｍｌのＤＭＦ中溶液を調製する。この溶液にＮ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（０．５２ｍＬ、３．３０ｍｍｏｌ）を添加し、対応する溶液を膨潤した樹脂を含む反応容器に添加する。反応物を周囲温度で１時間混合し、次に液体をドレインする。樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、次にステップ２に移行する。
ステップ２（グリコール酸カップリング）：
Ｆｍｏｃ基は、ステップ１の樹脂を３×１０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分間処理し、５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄することによって除去される。グリコール酸（２２８ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（３５３ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の１０ｍｌ ＤＭＦ中の溶液を調製する。この溶液にＮ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（０．５２ｍＬ、３．３０ｍｍｏｌ）を添加し、対応する溶液を各反応器に添加する。反応物を周囲温度で５時間混合し、次に液体をドレインする。樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦで１分間洗浄し、次にステップ３に移行する。
ステップ３（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｐｒｏ－ＯＨカップリング）：
（２Ｒ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル）ピロリジン－２－カルボン酸（１．０１２ｇ、３．００ｍｍｏｌ）、（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．２５ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．８７ｍＬ、５．００ｍｍｏｌ）の１０ｍｌのＤＭＦ中の溶液を調製する。溶液を数分間振とうした後、樹脂が入っている反応容器に移す。反応物を周囲温度で１６時間混合し、次に液体をドレインする。樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦで１分間、そして５×１０ｍｌのジクロロメタンで２分間洗浄し、次に一定の重量になるまで乾燥させ、樹脂上に１．７１９ｇの表題化合物を得る。
ペプチドの５０ｍｇサンプルを、９２．５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシラン、２．５％水、および２．５％ジチオスレイトール（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）からなる２．０ｍＬの溶液で樹脂から切断する。混合物をロータリーミキサーで１．５時間撹拌し、１６ｍｌの８０：２０ＤＭＳＯ／アセトニトリル（ｖ／ｖ）で希釈し、濾過して樹脂を除去する。濾液をＬＣ／ＭＳで分析したところ、７５．５面積％の所望のトリペプチドおよび１６．８％の複数のグリコール酸アダクトを含む生成物が含まれていることが示される。
実施例７１：Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｐｒｏ－グリコール酸－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨの代替的合成
ステップ１（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨカップリング）：
最初のカップリングの前に、ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（０．７４ｇ／ｍｍｏｌ、１．３５ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を反応容器に添加する。各樹脂を３×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ２０分間膨潤させた後、３×１０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）で３０分間脱保護し、それぞれ、５×１０ｍｌのＤＭＦで１分間洗浄する。（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－メチル－ブタン酸（１．０１８ｇ、３．００ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（３５３ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ質量％）の１０ｍｌのＤＭＦ中溶液を調製する。この溶液にＮ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（５１７μＬ、３．３０ｍｍｏｌ）を添加し、対応する溶液を膨潤した樹脂を含む反応容器に添加する。反応物を周囲温度で４時間混合し、次にドレインする。樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、次のステップに移行する。
ステップ２（Ｆｍｏｃ－グリコール酸カップリング）：
Ｆｍｏｃ基は、３×１０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分間処理し、５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄することによって除去される。２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルオキシ）酢酸（８９４．９ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（３５３ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の１０ｍｌのＤＭＦ中の溶液を調製する。この溶液にＮ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（５１７μＬ、３．３０ｍｍｏｌ）を添加し、対応する溶液を樹脂を含む反応器に添加する。反応物を周囲温度で１６時間混合し、液体をドレインする。樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、次のステップに移行する。
ステップ３（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｐｒｏ－ＯＨカップリング）：
Ｆｍｏｃ基は、３×１０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分間処理し、５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄することによって除去される。（２Ｓ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル）ピロリジン－２－カルボン酸（１．０１２ｇ、３．００ｍｍｏｌ）、（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．２５ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（８７０μＬ、５．００ｍｍｏｌ）の１０ｍｌのＤＭＦ中の溶液を調製する。対応する溶液を、樹脂を含む反応器に添加する。反応物を周囲温度で８時間混合し、次にドレインする。樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間、そして５×１０ｍｌのジクロロメタンで１分間洗浄し、次に一定の重量になるまで乾燥させ、樹脂上に１．６２２ｇの表題化合物を得る。
ペプチドの５０ｍｇサンプルを、９２．５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシラン、２．５％水、および２．５％ジチオスレイトール（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）からなる２．０ｍＬの溶液で樹脂から切断する。混合物をロータリーミキサーで１．５時間撹拌し、１６ｍｌの８０：２０ＤＭＳＯ／アセトニトリル（ｖ／ｖ）で希釈し、濾過して樹脂を除去する。濾液をＬＣ／ＭＳで分析したところ、８４．９３面積％の所望のトリペプチドを含み、検出可能な複数のグリコール酸の添加がないことが示される。
実施例７２：２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルオキシ）酢酸（Ｆｍｏｃ－グリコール酸）の合成（化合物５９）
Figure 2022545200000064
 ステップ１（ｔｅｒｔ－ブチル２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルオキシ）アセテート）：
５００ｍＬの丸底フラスコ中の１２０ｍｌのジクロロメタン中の２－ヒドロキシ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１０．００ｇ、７１．９０ｍｍｏｌ、９５質量％）の溶液に、磁気的に撹拌しながら、ピリジン（６０ｍＬ、７４２．０ｍｍｏｌ）を一度に添加する。得られた溶液を氷浴中で０～５℃に冷却する。この溶液に、６０ｍｌのジクロロメタン中の９－フルオレニルメチルクロロホルメート（２０．００ｇ、７７．３０ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下漏斗を介して３０分かけて滴下して添加する。添加が完了するまでに、反応中に沈殿物が形成された。氷浴を取り除き、反応混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。追加の撹拌時間の間に、より多くの沈殿物が形成される。反応混合物を減圧下で固体状～油状の残留物となるまで濃縮し、ほとんどのピリジンおよびジクロロメタンを除去し、次いで、２００ｍｌのジクロロメタンに再溶解させる。この溶液を２×１００ｍｌの１Ｍ重硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、続いて２×１００ｍｌの飽和ブライン溶液で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、２７．１３ｇの黄色の油状物となるまで濃縮し、徐々に固化させる。粗生成物を、精製せずに次のステップで処理する。
ステップ２（２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルオキシ）酢酸）：
ステップ１からのｔｅｒｔ－ブチル２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルオキシ）アセテート（２６．０ｇ、７３．４０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させる。溶液に、磁気的に撹拌しながらトリフルオロ酢酸（５２ｍＬ）を添加し、続いてトリイソプロピルシラン（１３ｍＬ）を添加する。得られた黒色の溶液を周囲温度で３時間撹拌する。溶液を減圧下で濃縮して、ジクロロメタンおよびほぼすべてのトリフルオロ酢酸を除去する。得られた粘稠な残留物を１０００ｍＬの５％重炭酸ナトリウム水溶液で徐々に処理して発泡を防ぎ、水溶液を３×５００ｍｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄して残留トリイソプロピルシランを除去する。水溶液を０～５℃に冷却し、３００ｍｌの酢酸エチルを添加する。二相混合物を、４０％リン酸水溶液で約ｐＨ２に酸性化する際、約７５ｍｌの酸が必要である。層を分離した後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、粘稠な淡黄色の油状物とする。油状物を冷凍庫で－２０℃に冷却すると、材料は完全に固化して白色の固体になる。固体を７５ｍｌの冷却ヘプタンで粉砕し、超音波処理後、均一な白色の懸濁液を形成させる。固体を濾別し、ヘプタンで洗浄し、真空オーブン内で３３℃で一晩乾燥させて、１５．２１ｇ（２段階で６９．５％の収率）の白色固体を得る。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により、目的の生成物が単離されたことを確認する。
実施例７３：Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物６０）の合成
Figure 2022545200000065
 ステップ１
（２Ｓ）－６－［［ジフェニル（ｐ－トリル）メチル］アミノ］－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ａ、１５ｇ、２４．０１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（７．４５ｇ、２９．０ｍｍｏｌ、９９．６ｍａｓｓ％）、４－ジメチルアミノピリジン［ＤＭＡＰ］（０．３ｇ、２ｍｍｏｌ、９９ｍａｓｓ％）を、撹拌棒を備えた２５０ｍＬフラスコに秤量して添加する。次に、酢酸エチル（２２５ｍＬ、２０００ｍｍｏｌ、１００質量％）を添加し、溶液を室温（２１～２４℃）で混合し、溶液を得る。反応液を１８時間、または反応の完了がＬＣＭＳ／ＮＭＲによって確認されるまで撹拌する。反応混合物を分液漏斗に移し、脱イオン水（６０ｍＬ×３）で洗浄し、有機層をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、ステップ１の粗製の化合物を得る。
ステップ２
Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（２０８ｍＬ、２６９０ｍｍｏｌ）中のステップ１の粗製の化合物（１７．３３ｇ、２４．０１ｍｍｏｌ）に、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５．０３ｍＬ、２８．８ｍｍｏｌ）および（２Ｒ）－２－アミノ－３を添加する。－トリチルスルファニル－プロパン酸（９．６ｇ、２６ｍｍｏｌ）を添加する。マグネチックスターラーを用いて室温（２１～２４℃）で１８時間、または反応の完了がＬＣＭＳ／ＮＭＲで確認されるまで、反応液を撹拌する。反応混合物を分液漏斗に移し、１０％クエン酸（１２０ｍＬ×２）で洗浄し、ジクロロメタン（１００ｍＬ×５）で抽出する。有機層を脱イオン水（１００ｍＬ×２）で洗浄し、合わせた有機層を４８～５０℃のロータリーエバポレーターで濃縮乾固して過剰な溶媒を除去する。粗製の化合物６０を超音波処理によりアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解させる。粗製の化合物６０の溶液を、撹拌しながら冷却アセトニトリル：脱イオン水（３：２、７００ｍＬ）に滴下して添加する。スラリーを０℃で一晩撹拌する。固体を濾過し、ヘキサン（７０ｍＬ）で洗浄し、４０℃の真空オーブンで乾燥させて、生成物Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物６０）（２１．０ｇ、Ｑ－ＮＭＲによる力価補正により７６．８％収率）を得る。
実施例７４：Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（ｍｔｔ）－Ｌ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－Ｌ－Ｐｒｏ－グリコール酸－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ（化合物６１）の合成
Figure 2022545200000066
 カップリング反応の前に、上記の実施例７３の樹脂上のＦｍｏｃ－Ｌ－Ｐｒｏ－グリコール酸－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ（１．７１９ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、３×１５ｍｌのＤＭＦでそれぞれ２０分間膨潤させ、次に４×１５ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分間、５×１５ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄する。溶液を、１０ｍｌのＤＭＦ中の（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－６－［［ジフェニル（ｐ－トリル）メチル］アミノ］－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイル］アミノ］－３－トリチルスルファニル－プロパン酸（２．２８ｇ、２．００ｍｍｏｌ、８５．２４質量％）、ヒドロキシ－３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）（０．３７５ｇ、２．３０ｍｍｏｌ、９５質量％）、Ｎ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（０．４１ｍｌ、２．６０ｍｍｏｌ）で調製する。対応する溶液を、樹脂を含む反応器に添加する。反応物を周囲温度で１２時間混合し、液体をドレインする。樹脂を５×１５ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間、そして５×１５ｍｌのジクロロメタンで１分間洗浄し、次に一定の重量になるまで乾燥させ、樹脂上に１．９７３ｇの表題化合物を得る。
ペプチドの５０ｍｇサンプルを、９２．５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシラン、２．５％水、および２．５％ジチオスレイトール（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）からなる２．０ｍＬの溶液で樹脂から切断する。混合物をロータリーミキサーで１．５時間撹拌し、１６ｍｌの８０：２０ＤＭＳＯ／アセトニトリル（ｖ／ｖ）で希釈し、濾過して樹脂を除去する。濾液をＬＣ／ＭＳで分析すると、８１．９３面積％の所望のペンタペプチドが、２．９１面積％のデスプロリンおよび３．８３％のデスバリンとともに含まれていることが示される。
実施例７５：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（配列番号５５）の合成
表題化合物を、標準的な固相合成条件（Ｆｍｏｃ保護アミノ酸／シアノグリオキシル酸エチル－２－オキシム（Ｏｘｙｍａ）／Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ））を使用して、以下に説明するように調製する。
溶媒および試薬の調製：
２０ＬのＤＭＦを溶媒リザーバーに充填する。５Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液を脱保護リザーバーに添加する。Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（４９．９８ｇ、３９６．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦを使用して、６００ｍＬの０．６６０Ｍ ＤＩＣ溶液を調製し、ＤＩＣ／溶媒リザーバーに充填する。シアノグリオキシル酸エチル－２－オキシム（５３．２９ｇ、３７１．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦを使用して、０．７５０Ｍオキシム溶液５００ｍｌを調製し、オキシマ／溶媒リザーバーに充填する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．７１ｍｍｏｌ／ｇ、１４．０９ｇ、１０．００ｍｍｏｌ）を反応器に投入する。以下に示す合成ステップを開始する前に、樹脂を３×１８０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ２０分間膨潤させ、Ｆｍｏｃ基を３×１８０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分間除去する。
アミノ酸溶液の調製：
（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（１１．６８ｇ、３７．５２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、１００ｍＬの０．３７５ＭＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）酢酸（２２．３０ｇ、７５．０１ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、２００ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｇｌｙ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。（２Ｓ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル）ピロリジン－２－カルボン酸（４５．５４ｇ、１３５．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、３６０ｍＬの０．３７５ＭＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｐｒｏ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。（２Ｓ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（４０．２５ｇ、１０５．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液２８０ｍＬを調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
カップリング条件：
Ｐｒｏ：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での６時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×２分間のＤＭＦによる洗浄。
Ａｌａ（Ｐｒｏの後）、Ｇｌｙ（Ｐｒｏの後）：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のオキシマ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での４時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×２分間のＤＭＦによる洗浄。
他のすべてのカップリング：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での４時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による３×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×２分間のＤＭＦによる洗浄。
合成の最後に、樹脂を５×１８０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ２分間洗浄し、続いて５×１８０ｍｌのＭＴＢＥでそれぞれ２分間洗浄する。樹脂を反応器から取り出し、風袋を除いた結晶化皿に移し、４０℃で一定重量になるまで真空乾燥して、樹脂上に２５．１５ｇの表題化合物を得る。樹脂出発物質の質量に基づき、ペプチドの収量は１１．０７ｇ（８９％）である。
樹脂を３×６ｍｌのＤＭＦで１０分間膨潤させ、３×６ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分間処理し、５×６ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、５×６ｍｌのジクロロメタンでそれぞれ１分間洗浄し、一定の重量になるまで乾燥させることにより、樹脂上のペプチドの２５１ｍｇサンプルからＦｍｏｃ基を除去する。
脱保護された生成物サンプルを、ロータリーミキサー上、２０ｍｌのシンチレーションバイアル内で５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＴＴ（［０．９２５ｖ：０．０２５ｖ：０．０２５ｖ］：０．０２５ｗ）溶液と２時間混合することにより、樹脂から切断する。樹脂を濾過し、樹脂の湿ったケーキを２ｍＬの無水ＴＦＡで洗浄する。
得られた粗製のペプチドを３５ｍＬの冷却ＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離し、２×３５ｍｌのＭＴＢＥで洗浄し、３３℃で一晩真空乾燥して、１０５．１ｍｇ（９４．９％）の完全に脱保護されたペプチドを得る。ＵＰＬＣによる分析では、純度９８．６２面積％であり、０．３０面積％を超える関連物質は存在しなかった。樹脂へのペプチドの負荷は０．３７ｍｍｏｌ／ｇとして測定され、また理論上の負荷も０．３７ｍｍｏｌ／ｇである。
実施例７５：Ｈ－Ｃｙｓ－Ｇｌｎ－Ａｉｂ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ＮＨ２配列番号５２（化合物６２）の合成
表題化合物を、標準的な固相合成条件（Ｆｍｏｃ保護アミノ酸／シアノグリオキシル酸エチル－２－オキシム（Ｏｘｙｍａ）／Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ））を使用して、以下に説明するように調製する。
溶媒および試薬の調製：
４０ＬのＤＭＦを溶媒リザーバーに充填する。４Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液を脱保護リザーバーに充填する。Ｎ、Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（４９．９８ｇ、３９６．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦを使用して、６００ｍＬの０．６６０Ｍ ＤＩＣ溶液を調製し、ＤＩＣ／溶媒リザーバーに充填する。シアノグリオキシル酸エチル－２－オキシム（５３．２９ｇ、３７１．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦを使用して、０．７５０Ｍオキシム溶液５００ｍｌを調製し、オキシマ／溶媒リザーバーに充填する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂上の、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［２－［（２Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－２－［［２－［［（１Ｓ）－２－［（２Ｓ）－２－［（２Ｓ）－２－［（２Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－２－アミノ－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシメチル）－２－オキソ－エチル］カルバモイル］ピロリジン－１－カルボニル］ピロリジン－１－カルボニル］ピロリジン－１－イル］－１－メチル－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシメチル）－２－オキソ－エチル］アミノ］－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシメチル）－２－オキソ－エチル］カルバモイル］ピロリジン－１－イル］－２－オキソ－エチル］カルバメート（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ、１．２２ｇ、０．５００ｍｍｏｌ）を、１１個の反応器のそれぞれ（樹脂上の合計５．５ｍｍｏｌのペプチド）に充填する。以下に示す合成ステップを開始する前に、各リアクター内の樹脂を３×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ２０分間膨潤させ、次にＦｍｏｃ基を３×１０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分除去し、樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄する。
アミノ酸溶液の調製：
１．（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（６．６６ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
２．（２Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタン酸（１６．４４ｇ、３８．６３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、１０３ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
３．（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－フェニル－プロパン酸（８．８３ｇ、２２．７９ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、６１ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｐｈｅ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
４．２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）酢酸（６．３６ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｇｌｙ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
５．（２Ｓ、３Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－メチル－ペンタン酸（７．５５ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｉｌｅ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
６．（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－メチルペンタン酸（１３．６５ｇ、３８．６２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、１０３ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｌｅｕ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
７．（２Ｓ）－５－（ｔｅｒｔ－ブチルアミノ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－５－オキソペンタン酸（１３．０５ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、８２ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
８．（２Ｓ）－３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（９．８２ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
９．２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－２－メチル－プロパン酸（６．９６ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）とＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ａｉｂ－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
１０．（２Ｒ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－トリチルスルファニル－プロパン酸（９．６６ｇ、１６．５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、４４ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ溶液を調製し、適切なアミノ酸ボトルに充填する。
カップリング条件：
Ｇｌｎ：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での１８時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。
Ａｉｂ、Ａｌａ、Ｌｅｕ－９：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での１２時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。
Ｐｈｅ、Ｉｌｅ：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での８時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。
Ｃｙｓ：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の活性化なし、周囲温度での８時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。
他のすべてのカップリング：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での４時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による３×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。
合成の最後に、各樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、続いて５×１ｍｌのジクロロメタンでそれぞれ１分間洗浄する。樹脂を一定重量になるまで乾燥させ、合わせて、樹脂上に２４．３９４ｇの表題化合物を得る。樹脂を３×４ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１５分間膨潤させ、３×４ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分間処理し、５×４ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、５×４ｍｌのジクロロメタンでそれぞれ１分間洗浄し、一定の重量になるまで乾燥させることにより、樹脂上のペプチドの９１．８ｍｇサンプルからＦｍｏｃ基を除去する。脱保護された生成物サンプルを、ロータリーミキサー上、２０ｍｌのシンチレーションバイアル内で５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＴＴ（［０．９２５ｖ：０．０２５ｖ：０．０２５ｖ］：０．０２５ｗ）溶液と２時間混合することにより、樹脂から切断する。樹脂を濾過し、樹脂の湿ったケーキを２ｍＬの無水ＴＦＡで洗浄する。得られた粗製のペプチドを３５ｍＬの冷却ＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離し、２×３５ｍｌのＭＴＢＥで洗浄し、３３℃で一晩真空乾燥して４８．２ｍｇの完全に脱保護されたペプチドを得る。ＵＰＬＣによる分析では、純度８８．０２面積％であり、１．０面積％を超える関連物質は存在しなかった。ペプチドの残りの部分は、３口の丸底フラスコ内で１８５ｍＬのトリフルオロ酢酸、５．０ｍＬのトリイソプロピルシラン、５．０ｍＬの水、５．０ｇのジチオスレイトールからなる溶液２００ｍｌ中で周囲温度で２時間機械的に撹拌することによって樹脂から切断する。フリット漏斗で濾過することにより樹脂を除去し、８０ｍｌのＴＦＡで洗浄して総量約２８０ｍＬの溶液を得る。１４００ｍｌの冷却ＭＴＢＥに添加することによりペプチドを沈殿させる。－２０℃で１時間エージングさせた後、スラリーを６本に分けて遠心分離する。遠心分離後に得られた固形物を２つのボトルにまとめ、各固形物を２５０ｍｌの室温ＭＴＢＥで２回洗浄する。得られた白色固体を３３℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、２０．０７ｇの粗製のペプチドを得る。
実施例７６：Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｉｂ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ－αＭｅＬｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｍｔｔ）－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－Ｐｒｏ－グリコール酸－Ｖａｌ－ＮＨ２（配列番号５６、化合物６３）の合成
表題化合物を、標準的な固相合成条件（Ｆｍｏｃ保護アミノ酸／シアノグリオキシル酸エチル－２－オキシム（オキシム）／Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ））を使用して調製する。
溶媒および試薬の調製：
４０ＬのＤＭＦを溶媒リザーバーに充填する。４Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液を脱保護リザーバーに充填する。Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（４９．９８ｇ、３９６．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦを使用して、６００ｍＬの０．６６０Ｍ ＤＩＣ溶液を調製し、ＤＩＣ／溶媒リザーバーに充填する。シアノグリオキシル酸エチル－２－オキシム（５３．２９ｇ、３７１．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦを使用して、０．７５０Ｍオキシム溶液５００ｍｌを調製し、オキシマ／溶媒リザーバーに充填する。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡまたはＳｉｅｂｅｒ樹脂上の［２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－２－メチル－プロピル］アミノ］－２－オキソ－エチル］（２Ｓ）－１－［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－６－［［ジフェニル（ｐ－トリル）メチル］アミノ］－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイル］アミノ］－３－トリチルスルファニル－プロパノイル］ピロリジン－２－カルボキシレート（０．５００ｍｍｏｌ）を、８つの反応器のそれぞれに充填する（樹脂上のペプチドの合計４．０ｍｍｏｌ）。
以下に示す合成ステップを開始する前に、各リアクター内の樹脂を３×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ２０分間膨潤させ、次にＦｍｏｃ基を４×１０ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）でそれぞれ３０分除去し、樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄する。
アミノ酸溶液の調製：
１．２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－２－メチル－プロパン酸（６．９６ｇ、２１．３７ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ａｉｂ－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
２．（２Ｓ）－４－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソ－ブタン酸（１５．８７ｇ、３８．６３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、１０３ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
３．（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－フェニル－プロパン酸（８．２８ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｐｈｅ－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
４．２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）酢酸（６．３６ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｇｌｙ－ＯＨ溶液５７ｍＬを調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
５．（２Ｓ、３Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－メチル－ペンタン酸（７．５５ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｉｌｅ－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
６．（２Ｓ）－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（１０．０２ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｌｙｓ（ｂｏｃ）－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
７．（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－メチルペンタン酸（７．５５ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｌｅｕ－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
８．（２Ｓ）－５－（ｔｅｒｔ－ブチルアミノ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタン酸（１３．０５ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
９．（２Ｓ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（１４．８１ｇ、３８．６３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、１０３ｍＬの０．３７５ＭＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
１０．（２Ｓ、３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（１５．３５ｇ、３８．６３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、１０３ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに添加する。
１１．（２Ｓ）－３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（９．８２ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
１２．（２Ｓ）－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）プロパン酸（７．２１ｇ、２１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＢｏｃＮＨ－Ｌ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
１３．（２Ｒ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－２，４－ジメチル－ペンタン酸（７．８５ｇ、２１．３７ｍｍｏｌ）およびＤＭＦから、５７ｍＬの０．３７５Ｍ ＦｍｏｃＮＨ－Ｌ－αＭｅＬｅｕ－ＯＨ溶液を調製し、次に適切なアミノ酸ボトルに充填する。
カップリング条件：
Ｂｏｃ－Ｔｙｒ、Ｉｌｅ：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での１８時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。
Ａｉｂ、Ｇｌｎ、αＭｅＬｅｕ：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での１２時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による４×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。
他のすべてのカップリング：０．１８Ｍ、３．０当量のアミノ酸、３．０当量のＯｘｙｍａ／３．３当量のＤＩＣ、活性化エステル溶液とする前の３０分間の活性化、周囲温度での４時間のカップリング時間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）による３×３０分間の脱保護、脱保護およびカップリング後の５×１分間のＤＭＦによる洗浄。合成の最後に、各樹脂を５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、続いて５×１ｍｌのジクロロメタンでそれぞれ１分間洗浄する。一定の重量になるまで樹脂を乾燥させ、次のステップに移行する。反応器の１つから得たサンプル（約８０ｍｇ）を、ロータリーミキサー上、２０ｍｌのシンチレーションバイアル内で５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＴＴ（［０．９２５ｖ：０．０２５ｖ：０．０２５ｖ］：０．０２５ｗ）溶液と２時間混合することにより、樹脂から切断する。樹脂を濾過し、樹脂の湿ったケーキを２ｍＬの無水ＴＦＡで洗浄する。得られた粗製のペプチドを３５ｍＬの冷却ＭＴＢＥで沈殿させ、遠心分離し、２×３５ｍｌのＭＴＢＥで洗浄し、３３℃で一晩真空乾燥して完全に脱保護されたペプチドのサンプルを得る。ＵＰＬＣによる分析では、５９．８面積％の純度を示した。
実施例７７：Ｔｙｒ－Ａｉｂ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－ＳＥＲ－ＡＳＰ－Ｔｙｒ－ＳＥＲ－Ｉｌｅ－αＭｅＬｅｕ－ＬＥＵ－ＡＳＰ－Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ２０－ＯＨ）－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－グリコール酸－Ｖａｌ－ＮＨ２（配列番号５７、化合物６４）の合成
ステップ１（ｍｔｔ保護基の脱保護）：
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡまたはＳｉｅｂｅｒ樹脂上の、［２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－２－メチル－プロピル］アミノ］－２－オキソ－エチル］（２Ｓ）－１－［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－４－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ、３Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－４－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ、３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ、３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）プロパノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－５－オキソ－５－（トリチルアミノ）ペンタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－３－フェニル－プロパノイル］アミノ］ブタノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］－３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－メチル－ペンタノイル］アミノ］－２，４－ジメチル－ペンタノイル］アミノ］－４－メチル－ペンタノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイル］アミノ］－６－［［ジフェニル（ｐ－トリル）メチル］アミノ］ヘキサノイル］アミノ］－３－トリチルスルファニル－プロパノイル］ピロリジン－２－カルボキシレート（０．５００ｍｍｏｌ）を、８つの異なるリアクターのそれぞれに充填する。各樹脂を３×１０ｍｌのＤＣＭでそれぞれ１５分間膨潤させた後、３０％の１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール／ジクロロメタン（ｖ／ｖ）（１０ｍＬ、９４．９８ｍｍｏｌ）で処理し、１時間混合する。液体をドレインし、樹脂を再び３０％の１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール／ジクロロメタン（ｖ／ｖ）（１０ｍＬ、９４．９８ｍｍｏｌ）で処理し、１時間混合する。液体を再びドレインし、樹脂を５×１０ｍｌのジクロロメタンでそれぞれ１分間洗浄し、次に５×１０ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間洗浄し、カップリング反応に移行する。
ステップ２（側鎖のカップリング）：
２－［２－［２－［［（４Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－４－［（２０－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２０－オキソ－イコサノイル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］酢酸（６．４１ｇ、８．００ｍｍｏｌ、９１質量％）およびベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（４．１６ｇ、８．００ｍｍｏｌ）を、７２ｍＬのＤＭＦに溶解させる。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．４０ｍＬ、８．００ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を１分間振とうした後、溶液の８分の１を反応容器内の各樹脂に添加し、１６時間混合する。液体をドレインし、樹脂を５×１５ｍｌのＤＭＦでそれぞれ１分間、５×１５ｍｌのジクロロメタンでそれぞれ１分間洗浄し、次に一定の重量になるまで乾燥させ、樹脂上の１５．６６ｇのペプチドを得る。
ステップ３（樹脂からのペプチドの切断および全体的な脱保護）：
ペプチドを、３口の丸底フラスコ内で１４８ｍＬのトリフルオロ酢酸、４．０ｍＬのトリイソプロピルシラン、４．０ｍＬの水、および４．０ｇのジチオスレイトールからなる溶液１６０ｍｌ中で周囲温度で２時間機械的に撹拌することによって樹脂から切断する。フリット漏斗で濾過することにより樹脂を除去し、６４ｍｌのＴＦＡで洗浄して総量約２２４ｍＬの溶液を得る。１１２０ｍｌの冷却ＭＴＢＥに添加することによりペプチドを沈殿させる。－２０℃で１時間エージングさせた後、スラリーを４本に分けて遠心分離する。遠心分離後に得られた固形物を２つのボトルにまとめ、各固形物を２５０ｍｌの室温ＭＴＢＥで２回洗浄する。得られた固体を３３℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、７．８１７ｇの粗製の表題化合物を得る。
実施例７８：配列番号６の精製
粗製の生成物（７６．２３ｇ）を５Ｌの反応器中で３．０５Ｌの２５％ＡＣＮ／水混合液（２５ｇ／Ｌの粗濃度）に溶解し、３０分間撹拌する。２８％水酸化アンモニウムを使用してｐＨ＝９．０に調整し、デプシペプチド異性体を変換し、６０分間撹拌した後、酸性側に戻すよう調整する（ＴＦＡを使用、ｐＨ＝２）。ｐＨ調整後の溶解性を維持するため、最終的なＡＣＮ含有量を３０％にする必要がある。第１のクロマトグラフィーステップの前に、粗製の油状物を濾過する。
第１のクロマトグラフィーステップ：カラム：ＤＡＣ２００、２００ｍｍ×２５０ｍｍ、固定相（ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８、１０ｕｍ、１２ｎｍ）、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：１００％ ＡＣＮ、２３０ｎｍでの検出、注入量：３．５Ｌ（３００ｍｌ／分の流量の注入ポンプ使用）。
Figure 2022545200000067
第２のクロマトグラフィーステップ：等量のＨ２Ｏで希釈し、希釈アンモニアを使用してｐＨを６．５に調整する。カラム：ＤＡＣ２００、２００ｍｍ×２５０ｍｍ、固定相（ＹＭＣＴｒｉａｒｔＣ１８、１０ｕｍ、１２ｎｍ）。移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３。移動相Ｂ：１００％ＡＣＮ；２３０ｎｍでの検出；注入量：７．０Ｌ（３００ｍｌ／ｍｉｎの流量の注入ポンプによる）。
Figure 2022545200000068
ナトリウム塩変換ステップ：２００ｍｌのＨ２Ｏに溶解させた１．７６ｇ（４４．０ｍｍｏｌ）のＮａＯＨを、７．２Ｌの分離画分に滴下し、凍結乾燥させる。３８．０２ｇの精製された生成物（純度：９８．０％）を得る。
実施例７９：配列番号２９の精製
粗製の生成物を、２０ｃｍカラム（４．８ｋｇ Ｄａｉｓｏ Ｃ１８－ＯＤＳ－ＲＰＳ、１０μ、１２０Ａ）および移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：１００％ＡＣＮ、２３０ｎｍでの検出、を使用して精製する。第１の精製ステップ：
Figure 2022545200000069
第２のクロマトグラフィーステップ：第１のステップでのカラムを使用する。移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３、移動相Ｂ：１００％ＡＣＮ、２３０ｎｍでの検出。
Figure 2022545200000070
配列
以下のアミノ酸配列が本開示において言及されており、参照のために以下に示す。
配列番号１－ヒトＧＩＰ
ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ
配列番号２－ヒトＧＬＰ－１（７－３６）アミド
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ－ＮＨ２
配列番号３－ヒトＧＣＧ
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号４－インクレチン類似体
ＹＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ１３ＬＤＫＸ１７ＡＸ１９Ｘ２０ＡＦＩＥＹＬＬＸ２８Ｘ２９ＧＰＳＳＸ３４ＡＰＰＰＳ（式中、Ｘ２はＡｉｂであり、Ｘ１３はＬまたはαＭｅＬであり、Ｘ１７はコンジュゲートに利用可能な官能基を有する任意のアミノ酸であり、官能基はＣ１６－Ｃ２２脂肪酸にコンジュゲートされ、Ｘ１９はＱまたはＡであり、Ｘ２０はＡｉｂ、αＭｅＫ、ＱまたはＨであり、Ｘ２８はＥまたはＡであり、Ｘ２９はＧまたはＡｉｂであり、Ｘ３４はＧまたはＡｉｂであり、Ｃ末端アミノ酸は任意選択的にアミド化される。）
配列番号５－インクレチン類似体
Ｙ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＩ（αＭｅＬ）ＬＤＫＫＡＱ（Ａｉｂ）ＡＦＩＥＹＬＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
配列番号６－インクレチン類似体
Figure 2022545200000071
 配列番号７－中間体化合物１
Figure 2022545200000072
 配列番号８－中間体化合物２
Figure 2022545200000073
 配列番号９－中間体化合物３
Figure 2022545200000074
 配列番号１０－中間体化合物４
Figure 2022545200000075
 配列番号１１－中間体化合物５
Figure 2022545200000076
 配列番号１２－中間体化合物６
Figure 2022545200000077
 配列番号１３－中間体化合物７
Figure 2022545200000078
 配列番号１４－中間体化合物８
Figure 2022545200000079
 配列番号１５－中間体化合物９
Figure 2022545200000080
 配列番号１６－中間体化合物１０
Figure 2022545200000081
 配列番号１７－中間体化合物１１
Figure 2022545200000082
 配列番号１８－中間体化合物１２
Figure 2022545200000083
 配列番号１９－中間体化合物１３
Figure 2022545200000084
 配列番号２０－中間体化合物１４
Figure 2022545200000085
 配列番号２１－中間体化合物１５
Figure 2022545200000086
 配列番号２２－中間体化合物１６
Figure 2022545200000087
 配列番号２３－中間体化合物１７
Figure 2022545200000088
 （式中、Ｒは２，２，２－トリフルオロエチルとすることができる。）
配列番号２４－中間体化合物１８
Figure 2022545200000089
 配列番号２５－中間体化合物１９
Figure 2022545200000090
 （式中、Ｒは２，２，２－トリフルオロエチルであってもよい。）
配列番号２６－中間体化合物２０
Figure 2022545200000091
 配列番号２７－中間体化合物２１
Figure 2022545200000092
 （式中、Ｒは２，２，２－トリフルオロエチルであってもよい。）
配列番号２８－中間体化合物２２
Figure 2022545200000093
 配列番号２９－インクレチン類似体
Figure 2022545200000094
 配列番号３０－中間体化合物２７
Figure 2022545200000095
 配列番号３１－中間体化合物２８
Figure 2022545200000096
 配列番号３２－中間体化合物２９
Figure 2022545200000097
 配列番号３３－中間体化合物３０
ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
配列番号３４－中間体化合物３１
Figure 2022545200000098
 配列番号３５－中間体化合物３２
Figure 2022545200000099
 配列番号３６－中間体化合物３３
Figure 2022545200000100
 配列番号３７－中間体化合物３４
Figure 2022545200000101
 配列番号３８－中間体化合物２３
Figure 2022545200000102
 配列番号３９－中間体化合物２４
Figure 2022545200000103
 Ｒは、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｖａｌ－ＮＨ２である。
配列番号４０－中間体化合物２５
Figure 2022545200000104
 Ｒは、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｖａｌ－ＮＨ２である。
配列番号４１－中間体化合物２６
Figure 2022545200000105
 Ｒは、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－Ｖａｌ－ＮＨ２である。
配列番号４２
Figure 2022545200000106
 配列番号４３
Figure 2022545200000107
 配列番号４４
Figure 2022545200000108
 配列番号４５
Figure 2022545200000109
 配列番号４６
Figure 2022545200000110
 配列番号４７
Figure 2022545200000111
 配列番号４８
Figure 2022545200000112
 配列番号４９
Figure 2022545200000113
 配列番号５０
Figure 2022545200000114
 配列番号５１
Figure 2022545200000115
 配列番号５２
ＣＱ－（Ａｉｂ）－ＡＦＩＥＹＬＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
配列番号５３
Figure 2022545200000116
 配列番号５４
Figure 2022545200000117
 （式中、ＲはＰｒｏ－グリコール酸－ＶａｌまたはＰｒｏ－グリコール酸である。）
配列番号５５
Figure 2022545200000118
 配列番号５６
Figure 2022545200000119
 配列番号５７
Figure 2022545200000120
 配列番号５８
Figure 2022545200000121
 配列番号５９
ＣＱ－（Ａｉｂ）－ＥＦＩ－（Ｄ－Ｇｌｕ）－（α－メチル－Ｔｙｒ）－ＬＩＥＧＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
配列番号６０
Figure 2022545200000122
 配列番号６１
Figure 2022545200000123
 配列番号６２
Figure 2022545200000124

Claims (38)

  1. 配列番号６のインクレチン類似体を作製する方法であって、ハイブリッド液相・固相合成を介して、
    ａ．配列番号７、８、９および１０
    ｂ．配列番号７、１１、１２および１０、ならびに
    ｃ．配列番号７、１３、１４および１０
    からなる群から選択される４つの中間体化合物をカップリングするステップを含む、方法。
  2. 配列番号６のインクレチン類似体を作製する方法であって、ハイブリッド液相・固相合成を介して、
    ａ．配列番号７、１３および１５、
    ｂ．配列番号１６、１７および１０、
    ｃ．配列番号１８、１２および１０、ならびに
    ｄ．配列番号７、４５および１０
    からなる群から選択される３つの中間体化合物をカップリングするステップを含む、方法。
  3. 配列番号６のインクレチン類似体を作製する方法であって、ハイブリッド液相・固相合成を介して、
    ａ．配列番号１５および１９、ならびに
    ｂ．配列番号１８および２０
    からなる群から選択される２つの中間体化合物をカップリングするステップを含む、方法。
  4. 配列番号７を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  5. 配列番号８を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  6. 配列番号９を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  7. 配列番号１０を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  8. 配列番号１１を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  9. 配列番号１２を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  10. 配列番号１３を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  11. 配列番号１４を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  12. 配列番号１５を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  13. 配列番号１６を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  14. 配列番号１７を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  15. 配列番号１８を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  16. 配列番号１９を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  17. 配列番号２０を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  18. 配列番号２１を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  19. 配列番号２２を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される
  20. 配列番号２３を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  21. 配列番号２４を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  22. 配列番号２５を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  23. 配列番号２６を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  24. 配列番号２７を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  25. 配列番号２８を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  26. 配列番号３８を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  27. 配列番号３９を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  28. 配列番号４０を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  29. Ｂｏｃ－Ｙ（Ａｉｂ）ＥＧＴ（αＭｅＦ（２Ｆ））ＴＳＤ（４Ｐａｌ）ＳＩ（αＭｅＬ）Ｌ（配列番号３０）を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  30. 配列番号３１を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  31. Ｑ（Ａｉｂ）ＥＦＩ（Ｄ－Ｇｌｕ）（αＭｅＹ）ＬＩＥＧ（配列番号３２）を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  32. ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３３）を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  33. Ｂｏｃ－Ｙ（Ａｉｂ）ＥＧＴ（αＭｅＦ（２Ｆ））ＴＳ（配列番号３４）を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  34. Ｑ（Ａｉｂ）ＥＦＩ（Ｄ－Ｇｌｕ）（αＭｅＹ）ＬＩＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号３５）を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  35. ＥＦＩ（Ｄ－Ｇｌｕ）（αＭｅＹ）ＬＩＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号３６）を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  36. ＣＱ（Ａｉｂ）ＥＦＩ（Ｄ－Ｇｌｕ）（αＭｅＹ）ＬＩＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号３７）を含む中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  37. 配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２からなる群から選択される中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩。
  38. 配列番号２９のインクレチン類似体を作製する方法であって、ハイブリッド液相・固相合成を介して、
    ａ．配列番号７、６２、４２および３１、
    ｂ．配列番号４３、および４４
    からなる群から選択される中間体化合物をカップリングするステップを含む、方法。
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