KR20220035199A - 인크레틴 유사체의 제조 방법 - Google Patents
인크레틴 유사체의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220035199A KR20220035199A KR1020227005160A KR20227005160A KR20220035199A KR 20220035199 A KR20220035199 A KR 20220035199A KR 1020227005160 A KR1020227005160 A KR 1020227005160A KR 20227005160 A KR20227005160 A KR 20227005160A KR 20220035199 A KR20220035199 A KR 20220035199A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- mod
- res
- resin
- xaa
- Prior art date
Links
- 0 CCCC(C1)I1OC([C@](CCC(NCCOCCOCC(O)=O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O*C)=O)=O)=O Chemical compound CCCC(C1)I1OC([C@](CCC(NCCOCCOCC(O)=O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O*C)=O)=O)=O 0.000 description 16
- JTOVMMPSILRQQJ-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)OC(CCCCCCCCCCCCCCCCC(ON(C(CC1)=O)C1=O)=O)=O Chemical compound CC(C)(C)OC(CCCCCCCCCCCCCCCCC(ON(C(CC1)=O)C1=O)=O)=O JTOVMMPSILRQQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSDWSTMVNUMOFC-LJAQVGFWSA-N CC(C)C(COCCOCCNC(CC[C@@H](C(O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O)=O)=O)=O Chemical compound CC(C)C(COCCOCCNC(CC[C@@H](C(O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O)=O)=O)=O PSDWSTMVNUMOFC-LJAQVGFWSA-N 0.000 description 1
- DDLLMZLQXGIPDX-UPVQGACJSA-N CC(C)[C@@H](C(N)=O)NC(COC([C@H](CCC1)N1C(OCC1c2ccccc2-c2c1cccc2)=O)=O)=O Chemical compound CC(C)[C@@H](C(N)=O)NC(COC([C@H](CCC1)N1C(OCC1c2ccccc2-c2c1cccc2)=O)=O)=O DDLLMZLQXGIPDX-UPVQGACJSA-N 0.000 description 1
- JFBRTKMECUPDDY-HTIIIDOHSA-N CCCCC(C)OC([C@H](CCC(NCCOCCOCC(O)=O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(OC(C)(C)C)=O)=O)=O Chemical compound CCCCC(C)OC([C@H](CCC(NCCOCCOCC(O)=O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(OC(C)(C)C)=O)=O)=O JFBRTKMECUPDDY-HTIIIDOHSA-N 0.000 description 1
- FIAJWUJTSBFEHO-BNLBYEDMSA-N CCCCCOC([C@H](CCC(NCCOCCOCC(NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(OCC1c2ccccc2-c2ccccc12)=O)=O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(OC(C)(C)C)=O)=O)=O Chemical compound CCCCCOC([C@H](CCC(NCCOCCOCC(NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(OCC1c2ccccc2-c2ccccc12)=O)=O)=O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(OC(C)(C)C)=O)=O)=O FIAJWUJTSBFEHO-BNLBYEDMSA-N 0.000 description 1
- CANARFMTUKMTTO-UHFFFAOYSA-N OC(COC(OCC1c2ccccc2-c2c1cccc2)=O)=O Chemical compound OC(COC(OCC1c2ccccc2-c2c1cccc2)=O)=O CANARFMTUKMTTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/10—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using coupling agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
인크레틴 유사체를 제조하기 위한 중간체 화합물, 또는 그의 제약상 허용가능한 염이 개시된다. 또한, 하이브리드 액체 고체상 합성 또는 천연 화학적 라이게이션을 통해 2 내지 4가지의 본원의 중간체 화합물을 커플링시킴으로써 인크레틴 유사체를 제조하는 방법이 개시된다.
Description
본 개시내용은 일반적으로 생물학, 화학 및 의약에 관한 것이고, 더욱 특별하게는 하이브리드 액체 고체상 합성 (HLSPS)을 통해 글루코스-의존성 인슐린 분비성 폴리펩티드 (GIP), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 글루카곤 (GCG) 수용체 중 하나 이상에서 활성을 갖는 인크레틴 유사체를 합성하는 방법에 관한 것이다.
지난 수십년에 걸쳐, 당뇨병의 유병률이 계속 증가하였다. 제2형 당뇨병 (T2DM)은 가장 흔한 형태의 당뇨병이며, 모든 당뇨병의 약 90%를 차지한다. T2DM은 인슐린 내성에 의해 유발된 높은 혈중 글루코스 수준을 특징으로 한다. T2DM 치료에 대한 현행 표준에는 식이요법 및 운동, 뿐만 아니라 인크레틴-기반 요법을 비롯한 경구 글루코스-저하 치료제 및/또는 주사가능한 글루코스-저하 치료제, 예컨대 GLP-1 수용체 효능제, GIP/GLP-1 이중 수용체 효능제 및 심지어 GIP/GLP-1/GCG (GGG) 삼중-수용체 효능제로의 처리가 포함된다.
국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/125938 및 2019/125929는 일반적으로 GGG 삼중-수용체 효능제로서 작용하는 인크레틴 유사체, 및 표준 고체상 펩티드 합성을 통한 그의 합성 방법을 기재한다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/049610, 2015/067716, 2016/198624, 2017/116204, 2017/153575 및 2018/100135 또한 참고한다. 마찬가지로, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/164483 및 2016/111971은 GLP-1 및 GIP 활성을 갖는 것으로 명시된 화합물을 기재한다. 더욱이, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2020/023386은 GIP 및 GLP1 수용체 효능제 활성을 갖는 펩티드를 기재한다.
그러나, 상업적으로 원하는 순도로 약학적으로 명쾌한 생성을 가능하게 하기 위해 이러한 인크레틴 유사체 및 그의 중간체의 대안적인 제조 방법이 필요하다. 마찬가지로, 인크레틴 유사체를 더 적은 정제 단계로 효율적으로 제공하기 위한 효율적인 방법 및 안정한 중간체가 필요하다.
이러한 요구를 해결하기 위해, 본 개시내용은 HLSPS 또는 천연 화학적 라이게이션 (NCL)을 통한 인크레틴 유사체의 제조 방법을 기재하며, 이러한 방법은 인크레틴 유사체를 제공하기 위해 2 내지 4가지 중간체 화합물을 사용한다.
제1 실시양태에서, 인크레틴 유사체는 하기 아미노산 서열, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함할 수 있으며:
YX2QGTFTSDYSIX13LDKX17AX19X20AFIEYLLX28X29GPSSX34APPPS
여기서, X2는 Aib이고, X13은 L 또는 αMeL이고, X17은 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 임의의 아미노산이고, 관능기는 C16-C22 지방산에 접합되고, X19는 Q 또는 A이고, X20은 Aib, αMeK, Q 또는 H이고, X28은 E 또는 A이고, X29는 G 또는 Aib이고, X34는 G 또는 Aib이고 (서열식별번호(SEQ ID NO):4), C-말단 아미노산은 임의적으로 아미드화된다. 특정한 예에서, 인크레틴 유사체는 하기 아미노산 서열, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 가질 수 있으며:
Y(Aib)QGTFTSDYSI(αMeL)LDKKAQ(Aib)AFIEYLLEGGPSSGAPPPS (서열식별번호:5)
여기서, C-말단 아미노산은 임의적으로 아미드화된다.
일부 예에서, C16-C22 지방산은 하기 구조를 갖는 링커를 통해 인크레틴 유사체에 부착될 수 있으며:
(2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)a-(γGlu)b-CO-(CH2)c-CO2H
여기서, a는 0, 1 또는 2일 수 있고, b는 1 또는 2일 수 있고, c는 16 또는 18일 수 있다.
특정한 예에서, 인크레틴 유사체는 하기 서열, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 가질 수 있으며:
Y(Aib)QGTFTSDYSI(αMeL)LDKK((2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ(Aib)AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2 (서열식별번호:6)
이는 하기 구조를 갖는 것으로 도시될 수 있다:
HLSPS를 통해 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 방법과 관련하여, 상기 방법은 4가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 8, 9 및 10에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
대안적으로, 상기 방법은 4가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 11, 12 및 10에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
대안적으로, 상기 방법은 4가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 13, 14 및 10에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
다른 예에서, 상기 방법은 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 13 및 15에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
대안적으로, 상기 방법은 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:16, 17 및 10에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
대안적으로, 상기 방법은 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:18, 12 및 10에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
대안적으로, 상기 방법은 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 45 및 10에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
대안적으로, 상기 방법은 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 11 및 20에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
다른 예에서, 상기 방법은 2가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:19 및 15에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
대안적으로, 상기 방법은 2가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:18 및 20에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
상기 방법은 커플링 단계 전에 2 내지 4가지 중간체 화합물을 합성하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
따라서, 상기 방법에서, 중간체 화합물을 서로 화학적으로 커플링시키거나 또는 효소적으로 커플링시켜, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 수득할 수 있다.
상기 방법에서, 다양한 중간체 화합물을 커플링시키기 전에, C16-C22 지방산 모이어티 및 임의적인 링커를 한 중간체 화합물에 부착시킬 수 있다 (즉, 완전한 인크레틴 유사체 합성 전에 아실화가 발생할 수 있음). 대안적으로, 다양한 중간체 화합물을 커플링시킨 후에, 지방산 모이어티를 인크레틴 유사체에 부착시킬 수 있다 (즉, 완전한 인크레틴 유사체 합성 후에 아실화가 발생할 수 있음). 예를 들어, 상기 방법은 2가지 중간체 화합물 (이러한 화합물은 서열식별번호:21 및 18에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 가짐)을 커플링시킨 후, 하기 구조를 갖는 지방산 모이어티를 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있다:
대안적으로, 상기 방법은 하기 2가지 중간체 화합물 (이러한 화합물은 서열식별번호:22 및 19에 제시된 구조를 가짐)을 커플링시킨 후, 하기 구조를 갖는 지방산 모이어티를 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있다:
상기 외에도, 대안적으로 NCL을 이용하여 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조할 수 있고, 상기 방법은 2가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
서열식별번호:23 및 24,
서열식별번호:39 및 24,
서열식별번호:25 및 26,
서열식별번호:40 및 26, 및
서열식별번호:27 및 26.
또 다른 실시양태에서, 인크레틴 유사체는 하기 아미노산 서열, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함할 수 있으며:
Y(Aib)EGT(αMeF(2F))TSD(4Pal)SI(αMeL)LD(Orn)K((2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γ-Glu)-CO-(CH2)16-CO2H)AQ(Aib)EFI(D-Glu)(αMeY)LIEGGPSSGAPPPS-NH2 (서열식별번호:29)
이는 하기 구조를 갖는 것으로 도시될 수 있다:
HLSPS를 통해 서열식별번호:29의 인크레틴 유사체를 제조하는 방법과 관련하여, 상기 방법은 하기 중간체 화합물 중 적어도 하나를 또 다른 중간체 화합물에 커플링시키는 단계를 적어도 포함할 수 있고, 이러한 화합물은 서열식별번호:30, 31, 32, 34, 35, 36 및/또는 37에 제시된 구조, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 갖는다.
하이브리드 액체 고체상 합성을 통해 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 포함하는, 서열식별번호:29의 인크레틴 유사체의 제조 방법이 제공된다:
a. 서열식별번호:7, 62, 42 및 31,
b. 서열식별번호:43, 및 44.
상기 방법 외에도, 본원의 실시양태는 중간체 화합물 자체 (예를 들어, 서열식별번호:7 내지 28 및 30 내지 41), 뿐만 아니라 그를 포함하는 조성물을 또한 포함한다.
본원의 유사체의 이점은 이들이 진성 당뇨병, 이상지질혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 대사 증후군, 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 비만, 뿐만 아니라 GLP-1 및/또는 GIP 및/또는 글루카곤의 조절과 연관된 다른 장애 또는 상태를 위한 효과적인 치료로서 사용될 수 있다는 것이다.
본원의 방법의 이점은 몇몇 공정 개선을 포함하며, 예를 들어 SPPS를 통해 초기에 생성된 더 짧은 단편은 일반적으로 HLSPS를 통해 증가된 순도 및 더 높은 수율을 가능하게 한다.
본원의 방법의 이점에는 SPPS에서 커플링 효율이 화학적 변환에 관여하는 실제 잔기에 의존적일 뿐만 아니라, 수지에 부착된 구조에 의해 영향을 받는다는 것이 포함된다 (즉, 용해도/응집 문제는 특정한 서열에 대해 널리 공지되어 있음). 단편이 더 짧을수록, 복잡한 아미노산 잔기의 커플링에 대해 더 많은 경로 융통성이 이용가능하고, 더욱 어려운 변환을 다루기 위해 단편 구조를 재설계할 수 있다.
본원의 방법의 이점에는 합성 동안에 불순물에 대한 개선된 제어 전략이 포함되며, 이는 조 펩티드에 대한 개선된 최종 불순물 프로파일을 가능하게 할 수 있고, 크로마토그래피 부담을 단순화/감소시켜, 비용 절감을 초래할 수 있다.
본원의 방법의 이점에는 SPPS를 통한 더 짧은 단편의 합성이 감소된 세척 주기, 감소된 시약 부피, 및 친환경적인 용매(들)의 사용을 가능하게 하여, 감소된 공정 질량 강도 (PMI)를 유도할 수 있다는 것이 포함된다.
본원의 방법의 이점에는 더 짧은 단편에 의해 긴 분자의 선형 구축물에서 전형적인 실패 위험이 유의하게 감소된다는 것이 포함된다.
본원의 방법의 이점에는 액체 및 고체상 합성의 조합이 새로운 제조 플랫폼에 더 적합하고, 다른 혁신적인 기술을 도입한다는 것이 포함된다.
본원의 방법의 이점에는 몇몇 독립적인 단편의 사용에 의해 제조 공정의 공급망 및 물류에서의 융통성이 포함된다.
본원의 방법의 이점에는 단편의 병렬 제조를 이용하여 단편의 병렬 공정에 의해 감소된 제조 주기를 제공할 수 있다는 것이 포함된다.
본원의 방법의 이점에는 현행 우수 제조 관리 기술 (cGMP) 수렴 단계가 특수 장비에 대한 필요없이 표준 시설에서 실행될 수 있다는 것이 포함된다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 인크레틴 유사체, 제약 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
더욱이, 문맥상 단지 하나의 요소만이 있는 것으로 명백하게 요구되지 않는다면, 단수 형태의 요소에 대한 언급은 1개 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수 형태는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
약어 및 정의
특정한 약어들은 다음과 같이 정의된다: "AEEA"는 2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸을 지칭하고, "D-Glu" 또는 "e"는 D-글루탐산을 지칭하고, 아미노산 서열에서 "e"는 D-글루탐산을 지칭하고, "Aib"는 α-아미노 이소부티르산을 지칭하고, "αMeL"은 α-메틸 류신을 지칭하고, "αMeK"는 α-메틸 리신을 지칭하고, "Boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고, "Bu"는 부틸을 지칭하고, "t-Bu"는 tert-부틸을 지칭하고, "CTC"는 클로로트리틸 클로라이드를 지칭하고, "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고, "DIC"는 디이소프로필카르보디이미드를 지칭하고, "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고, "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고, "DTT"는 디티오트레이톨을 지칭하고, "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고, "Fmoc"는 플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드를 지칭하고, "hr"은 시간(들)을 지칭하고, "IPA"는 이소프로판올을 지칭하고, "IPAc"는 이소프로필 아세테이트를 지칭하고, "min"은 분(들)을 지칭하고, "Me"는 메틸을 지칭하고, "MTBE"는 메틸-tert-부틸 에테르를 지칭하고, "옥시마"는 에틸 시아노히드록시이미노아세테이트를 지칭하고, "PG"는 보호기를 지칭하고, "Pip"는 피페리딘을 지칭하고, "SPPS"는 고체상 펩티드 합성을 지칭하고, "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고, "TIPS"는 트리이소프로필실란을 지칭하고, "Trt"는 트리틸을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약"은 예를 들어 명시된 농도, 길이, 분자량, pH, 서열 동일성, 시간 프레임, 온도 또는 부피와 같은 값 또는 값들의 통계적으로 의미있는 범위 내를 의미한다. 이러한 값 또는 범위는 주어진 값 또는 범위의 전형적으로 20% 이내, 더욱 전형적으로 10% 이내, 및 훨씬 더 전형적으로 5% 이내인 크기 내일 수 있다. "약"에 의해 허용가능한 변동은 연구 중인 특정한 시스템에 따라 좌우될 것이며, 관련 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 이해될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, GIP, GLP-1 또는 GCG 수용체 중 하나 이상과 관련하여, "활성", "활성화시키다", "활성화" 등은 관련 기술분야에 공지된 검정, 예컨대 하기 기재된 시험관내 검정을 이용하여 측정되는 바와 같이 본원에 기재된 화합물, 예컨대 인크레틴 유사체가 수용체(들)에 결합하여 반응을 유도하는 능력을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산"은 예를 들어 링커에 의해 지방산에 접합될 수 있는 관능기를 갖는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산을 의미한다. 이러한 관능기의 예에는 알키닐, 알케닐, 아미노, 아지도, 브로모, 카르복실, 클로로, 아이오도 및 티올 기가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 이러한 관능기를 포함하는 천연 아미노산의 예에는 Lys/K (아미노), Cys/C (티올), Glu/E (카르복실) 및 Asp/D (카르복실)이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유사체"는 표적 수용체를 활성화시키고, 해당 수용체에 대한 천연 효능제에 의해 유도되는 적어도 하나의 생체내 또는 시험관내 효과를 유도하는 화합물, 예컨대 합성 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "C16-C22 지방산"은 16 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 카르복실산을 의미한다. 본원에서 사용하기에 적합한 C16-C22 지방산은 포화 일산 또는 포화 이산일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "포화"는 지방산이 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않음을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이중 수용체 활성"은 과도한 활성과 연관된 원치않는 부작용을 피하면서 해당 수용체의 효능작용의 이점을 제공하기 위해 GIP, GLP-1 및 GCG 수용체 중 하나 이상에서 효능제 활성을 갖는 인크레틴 유사체, 특히 하나 이상의 수용체에서 균형 잡히고 충분한 활성을 갖는 유사체를 의미한다. 더욱이, 이중 수용체 활성을 갖는 인크레틴 유사체는 GIP, GLP-1 및 GCG 수용체 중 하나 이상에서 연장된 작용 기간을 갖고, 이는 유리하게는 1일 1회, 주 3회, 주 2회 또는 주 1회와 같이 덜 빈번하게 투여하는 것을 가능하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "글루코스-의존성 인슐린 분비성 폴리펩티드" 또는 "GIP"는 글루코스의 존재하에 췌장 베타 세포로부터 인슐린 분비를 자극함으로써 글루코스 항상성에서 생리학적 역할을 하는 펩티드, 특히 인간 GIP (서열식별번호:1)를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "글루카곤-유사 펩티드-1" 또는 "GLP-1"은 글루코스-의존성 인슐린 분비를 자극하고, 당뇨병에서 고혈당증을 예방하는 것으로 확인된 펩티드, 특히 인간 GLP-1 (서열식별번호:2)을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "글루카곤" 또는 "GCG"는 간세포 상에서 글루카곤 수용체에 결합하여 그를 활성화시켜, 간에서 글리코겐 분해로 지칭되는 과정을 통해 글리코겐 형태로 저장된 글루코스를 방출시킴으로써 혈중 글루코스를 유지하는데 도움이 되는 펩티드, 특히 인간 GCG (서열식별번호:3)를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인크레틴 유사체"는 GIP, GLP-1 및 GCG, 특히 인간 GIP (서열식별번호:1), 인간 GLP-1 (서열식별번호:2) 및 인간 GCG (서열식별번호:3) 각각과 구조적 유사성을 갖지만 여러 차이가 있는 화합물을 의미한다. 본원에 기재된 인크레틴 유사체는 GIP, GLP-1 및 GCG 수용체 중 하나 이상에 대한 친화도 및 활성 (즉, 이중 효능제 활성 또는 삼중 효능제 활성)을 갖는 화합물을 생성하는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용가능한 완충제"는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 표준 제약 완충제를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "삼중 수용체 활성"은 과도한 활성과 연관된 원치않는 부작용을 피하면서 수용체의 효능작용의 이점을 제공하기 위해 GIP, GLP-1 및 GCG 수용체에서 효능제 활성을 갖는 인크레틴 유사체, 특히 수용체에서 균형 잡히고 충분한 활성을 갖는 유사체를 의미한다. 더욱이, 삼중 수용체 활성을 갖는 인크레틴 유사체는 GIP, GLP-1 및 GCG 수용체 중 하나 이상에서 연장된 작용 기간을 갖고, 이는 유리하게는 1일 1회, 주 3회, 주 2회 또는 주 1회와 같이 덜 빈번하게 투여하는 것을 가능하게 한다.
조성물
본원의 인크레틴 유사체의 구조적 특징은 하나 이상의 수용체에서 활성 (즉, 이중 수용체 활성 또는 삼중 수용체 활성)의 유리한 효과를 수득하기 위해 GIP, GLP-1 및 GCG 수용체 중 하나 이상에서 충분한 활성을 갖는 화합물을 생성하지만, 3가지 모든 수용체에서 활성을 생성하기에 충분한 용량으로 투여될 때, 어느 한 수용체에서의 활성이 다른 두 수용체에서의 활성을 압도하거나 또는 바람직지 않은 부작용을 생성하는 정도로 너무 많지는 않다.
본원의 인크레틴 유사체의 구조적 특징은 또한 수성 용액 중에서 유사체의 용해도 개선, 화학적 및 물리적 제형 안정성의 개선, 약동학 프로파일의 연장, 및 면역원성에 대한 잠재성 최소화를 비롯하여 치료적 치료로서의 발달가능성과 관련된 여러 다른 유익한 속성을 갖는 화합물을 생성한다.
상기 나열된 구조적 특징이 예시적인 것이고 포괄적인 것이 아니며, 본원에 기재된 예시적인 유사체의 유익한 특징의 조합이 별개로 임의의 변형의 결과가 아니지만, 대신에 본원에 기재된 구조적 특징의 신규한 조합을 통해 달성된다는 것임을 주목해야 한다. 또한, 상기 나열된 변형의 상기 기재된 효과는 배타적이지 않으며, 이들 여러 변형 또한 하기 기재된 바와 같이 본원에 기재된 화합물의 특징에 중요한 다른 효과를 갖기 때문이다.
본원의 인크레틴 유사체의 아미노산 서열은 표준 1 또는 3 문자 코드 (예를 들어, L/Leu = 류신)를 사용하여 전형적으로 본원에 제시된 천연 발생 아미노산, 뿐만 아니라 천연 아미노산의 α-메틸 치환된 잔기 (예를 들어, (αMeL, αMeK, αMeY, αMeF(2F)), 및 특정한 다른 비천연 아미노산, 예컨대 Aib, 오르니틴, 4-Pal을 포함한다. 이들 아미노산의 구조는 하기에 도시된다:
상기 언급된 바와 같이, 본원의 인크레틴 유사체는 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 천연 또는 비천연 아미노산에 예를 들어 링커에 의해 접합된 지방산 모이어티를 포함한다. 이러한 접합은 때때로 아실화로 지칭된다. 특정한 예에서, 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 아미노산은 서열식별번호:5 또는 서열식별번호:29에서 위치 17의 K, C, E 및 D, 특히 K일 수 있고, K 측쇄의 ε-아미노 기에 접합된다. 지방산 모이어티는 알부민 결합제로서 작용하고, 지효성 화합물을 생성하는 능력을 제공한다.
본원의 인크레틴 유사체는 직접 결합에 의해 또는 링커에 의해 아미노산의 관능기에 화학적으로 접합된 C16-C22 지방산을 이용한다. 지방산의 길이 및 조성은 인크레틴 유사체의 반감기, 생체내 동물 모델에서 그의 효능, 및 그들의 용해도 및 안정성에 영향을 미친다. C16-C22 포화 지방 일산 또는 이산에 대한 접합은 바람직한 반감기, 생체내 동물 모델에서 바람직한 효능, 및 바람직한 용해도 및 안정성 특징을 나타내는 인크레틴 유사체를 생성한다.
본원에서 사용하기 위한 포화 C16-C22 지방산의 예에는 팔미트산 (헥사데칸산) (C16 일산), 헥사데칸디오산 (C16 이산), 마르가르산 (헵타데칸산) (C17 일산), 헵타데칸디오산 (C17 이산), 스테아르산 (C18 일산), 옥타데칸디오산 (C18 이산), 노나데실산 (노나데칸산) (C19 일산), 노나데칸디오산 (C19 이산), 아라카드산 (에이코산산) (C20 일산), 에이코산디오산 (C20 이산), 헨에이코실산 (헨에이코산산) (C21 일산), 헨에이코산디오산 (C21 이산), 베헨산 (도코산산) (C22 일산), 도코산디오산 (C22 이산), 예컨대 이들의 분지된 및 치환된 유도체가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 예에서, C16-C22 지방산은 포화 C18 일산, 포화 C18 이산, 포화 C19 일산, 포화 C19 이산, 포화 C20 일산, 포화 C20 이산, 및 이들의 분지된 및 치환된 유도체일 수 있다.
일부 예에서, 링커는 1 내지 4개의 아미노산, 아미노 폴리에틸렌 글리콜 카르복실레이트, 또는 이들의 혼합물을 가질 수 있다. 특정한 예에서, 아미노 폴리에틸렌 글리콜 카르복실레이트는 하기 구조를 갖는다:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH
여기서, m은 1 내지 12의 임의의 정수이고, n은 1 내지 12의 임의의 정수이고, p는 1 또는 2이다.
일부 예에서, 링커는 임의적으로 1 내지 4개의 아미노산과 조합되어 1개 이상의 (2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸) 모이어티를 가질 수 있다.
링커가 적어도 1개의 아미노산을 가질 수 있는 예에서, 아미노산은 1 내지 4개의 Glu 또는 γGlu 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 예에서, 링커는 1개 또는 2개의 Glu 또는 γGlu 아미노산 잔기, 예컨대 그의 D-형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 1개 또는 2개의 γGlu 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 링커는 36개 이하의 (2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸) 모이어티와 조합되어 사용되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기 (예컨대, 예를 들어, Glu 또는 γGlu 아미노산)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 링커는 1 내지 4개의 Glu 또는 γGlu 아미노산 및 1 내지 4개의 (2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸) 모이어티의 조합일 수 있다. 다른 예에서, 링커는 1개 또는 2개의 γGlu 아미노산 및 1개 또는 2개의 (2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸) 모이어티의 조합일 수 있다.
특정한 예에서, 본원에 기재된 인크레틴 유사체는 하기 화학식의 구조를 갖는 링커 및 지방산 성분을 포함한다:
(2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)a-(γGlu)b-CO-(CH2)c-CO2H,
여기서, a는 0, 1 또는 2이고, b는 1 또는 2이고, 및 c는 16 또는 18이다.
특정한 예에서, a는 2이고, b는 1이고, c는 16이며, 그의 구조는 하기에 도시된 바와 같다:
또 다른 특정한 예에서, a는 1이고, b는 2이고, c는 18이며, 그의 구조는 하기에 도시된 바와 같다:
또 다른 특정한 예에서, a는 0이고, b는 2이고, c는 18이며, 그의 구조는 하기에 도시된 바와 같다:
또 다른 특정한 예에서, a는 1이고, b는 1이고, c는 18이며, 그의 구조는 하기에 도시된 바와 같다:
특정한 예에서, 인크레틴 유사체의 전체 구조는 서열식별번호:6이다.
특정한 예에서, 인크레틴 유사체의 전체 구조는 서열식별번호:29이다.
GIP, GLP-1 및 GCG 수용체 각각에 대한 본원의 인크레틴 유사체의 친화도는 수용체 결합 수준을 측정하기 위해 관련 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 것들을 이용하여 측정될 수 있고, 일반적으로 억제 상수 (Ki) 값으로 표현된다. 수용체 중 하나 이상에서 본원의 인크레틴 유사체의 활성은 또한 관련 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어 하기 기재된 시험관내 활성 검정을 이용하여 측정될 수 있고, 일반적으로 유효 농도 50 (EC50) 값으로 표현되며, 이는 용량 반응 곡선에서 최대 자극의 절반을 유발하는 화합물의 농도이다.
본원의 인크레틴 유사체는 비경구 경로 (예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내 또는 경피)로 투여될 수 있는 제약 조성물로서 제형화될 수 있다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (Troy ed., Lippincott, Williams & Wilkins 21st ed. 2006)]을 참고한다.
본원의 인크레틴 유사체를 임의의 수많은 무기 및 유기 산/염기와 반응시켜, 제약상 허용가능한 산/염기 부가 염을 형성할 수 있다. 그의 제약상 허용가능한 염 및 그의 일반적인 제조 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, [Stahl et al., "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use" (Wiley-VCH 2nd ed. 2011)] 참고). 본원에서 사용하기 위한 그의 제약상 허용가능한 염에는 나트륨, 트리플루오로아세테이트, 히드로클로라이드 및/또는 아세테이트 염이 포함된다.
본 개시내용은 또한 본원의 인크레틴 유사체 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 합성하기 위한 신규한 중간체 화합물 및 방법을 제공하며, 따라서 이들을 포함한다. 본원의 중간체 화합물 및 인크레틴 유사체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 2가지 이상의 중간체 화합물에 대한 표준 고체상 펩티드 합성에 이어 HLSPS를 이용하는 방법은 하기 실시예에 기재된다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 본원의 인크레틴 유사체를 제조하기 위해 상이한 방식으로 조합될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 기술자가 용이하게 입수가능하다.
본원의 인크레틴 유사체는 일반적으로 광범위한 용량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 주 1회 투여를 위한 용량은 약 0.01 내지 약 30 mg/사람/주의 범위 내에, 약 0.1 내지 약 10 mg/사람/주의 범위 내에 또는 심지어 약 0.1 내지 약 3 mg/사람/주의 범위 내에 속할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 인크레틴 유사체는 매일, 주 3회, 주 2회 또는 주 1회, 특히 주 1회 투여로 투여될 수 있다.
본원의 인크레틴 유사체는 다양한 상태, 장애, 질환 또는 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 개체에서 T2DM을 치료하는 방법이 하기에 제공되며, 이러한 방법은 본원의 인크레틴 유사체, 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 유효량을 T2DM의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
방법
중간체 화합물의 표준 고체상 펩티드 합성:
본원의 인크레틴 유사체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수많은 표준 펩티드 합성 방법, 특히 SPPS를 통해 제조될 수 있다. SPPS 구축은 자동화 펩티드 합성기에 의한 순차적인 커플링을 이용하는 표준 Fmoc 펩티드 화학 기술을 이용하여 달성된다. SPPS 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에서 철저하게 설명될 필요는 없다. 일반적으로, ["Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" (Chan & White ed., Oxford University Press 2000), 및 Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154]를 참고한다.
탈보호를 위해, 수지를 DMF로 팽윤시킨 다음, 20% Pip/DMF (3 x 30 분)를 사용하여 탈보호시킨다. 후속적인 Fmoc 탈보호는 20% Pip/DMF (1 x 5-20 분, 1 x 20-30 분) 처리를 이용하며, 더욱 어려운 탈보호의 경우에는 1 x 5-20 분, 1 x 20 분 및 1 x 30 분 처리 순서가 이용된다.
탈보호 이후, 수지를 5 x 2 분의 10 부피 DMF 세척으로 세척한다. 아미노산 사전-활성화는 실온에서 30 분 동안 DIC/옥시마 DMF 용액을 사용한다. 활성화된 아미노산과 수지-결합된 펩티드의 커플링은 각각의 개별 아미노산에 대해 지정된 시간 동안 발생한다. 각각의 커플링 후에 10 부피 DMF로 5 x 2 분의 용매 세척을 수행한다.
최종 생성물의 단리를 위해, 수지-결합된 생성물을 10 부피 DCM으로 5 x 2 분 세척하여, DMF를 제거한다. 수지를 10 부피 IPA로 2 x 2 분 세척하여, DCM을 제거하고, 10 부피 MTBE로 5 x 2 분 세척한 다음, 생성물을 진공하에 40℃에서 건조시킨다. 수지-결합된 생성물을 저온 (-20℃) 보관한다.
분석을 위해, 하기 비: (0.93v/0.04v/0.03v/0.03w)의 TFA/H2O/TIPS/DTT의 산성 칵테일에 의해 수지로부터 펩티드를 절단시킨다. 수지를 DCM (4-5 vol, 3 x 30 분)으로 팽윤시키고, 배수시킨다. 절단 칵테일 (4-5 vol)을 사전 팽윤된 수지에 첨가하고, 현탁액을 실온에서 2 시간 동안 교반한다. 용액을 여과한 다음, 수지를 소량의 DCM으로 세척하고, 절단 용액과 합한다. 생성된 용액을 7-10 부피의 저온 (0℃) MTBE에 붓는다. 현탁액을 0℃에서 30 분 동안 숙성시키고, 생성된 침전물을 원심분리하고, 투명한 용액을 경사분리한다. 잔기를 동일한 부피의 MTBE에 현탁시키고, 생성된 현탁액을 다시 원심분리하고 경사분리한다. 경사분리 후에, 침전된 펩티드의 투명한 MTBE 용액을 진공하에 40℃에서 밤새 건조시킨다.
인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성:
상기 기재된 바와 같이 SPPS를 통해 제조된 중간체 화합물을 합하여, 서열식별번호:6 또는 29의 인크레틴 유사체를 수득할 수 있다. HLSPS 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에서 철저하게 기재될 필요는 없다. 일반적으로, 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0046349; 및 [Albericio et al. (1997) Methods Enzymol. 289:313-336, Bray et al. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:587-593, Dalcol et al. (1995) J. Org. Chem. 7575-60:7581, Gauthier et al. (1991) Tettrahedron Lett. 32: 577-580, Schneider et al. (2005) J. Peptide Sci.11:744-753, Smith, Organic Synthesis (Academic Press 4th ed. 2016), 및 Zhang et al. (2008) Org. Process Res. Dev. 12:101-110]을 참고한다.
간략히, HLSPS는 독립적인 중간체 화합물 합성 및 화합물 커플링을 수반한다. 본원에 적용시, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 한 가지 방법은 하기 4가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 8, 9 및 10에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링될 수 있다: 서열식별번호:7에서 서열식별번호:8에서 서열식별번호:9에서 서열식별번호:10으로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 또 다른 방법은 하기 4가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 11, 12 및 10에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링된다: 서열식별번호:7에서 서열식별번호:11에서 서열식별번호:12에서 서열식별번호:10으로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 또 다른 방법은 하기 4가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 13, 14 및 10에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링된다: 서열식별번호:7에서 서열식별번호:13에서 서열식별번호:14에서 서열식별번호:10으로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
대안적으로, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 한 가지 방법은 하기 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7 13 및 15에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링된다: 서열식별번호:7에서 서열식별번호:13에서 서열식별번호:15로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 또 다른 방법은 하기 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:16, 17 및 10에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링된다: 서열식별번호:16에서 서열식별번호:17에서 서열식별번호:10으로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 또 다른 방법은 하기 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:18, 12 및 10에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링된다: 서열식별번호:18에서 서열식별번호:12에서 서열식별번호:10으로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 또 다른 방법은 하기 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 45 및 10에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링된다: 서열식별번호:7에서 서열식별번호:45에서 서열식별번호:10으로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 또 다른 방법은 하기 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:7, 11 및 20에 제시된 구조를 갖는다.
일부 예에서, 단편은 하기 순서로 커플링된다: 서열식별번호:7에서 서열식별번호:11에서 서열식별번호:20으로 (즉, C-말단에서 N-말단으로). 다른 예에서, 적절한 보호기 전략을 이용하여, 단편은 상이한 순서로 커플링될 수 있다.
대안적으로, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 한 가지 방법은 하기 2가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:19 및 15에 제시된 구조를 갖는다.
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 또 다른 방법은 하기 2가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하고, 이러한 화합물은 서열식별번호:18 및 20에 제시된 구조를 갖는다.
대안적으로, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 다른 방법은 상기 기재된 것과 동일한 분리를 이용하지만, 대신에 먼저 백본의 모든 아미노산 단편을 커플링시킨 다음, 마지막 화학적 변환으로서 지방산 측면 모이어티를 도입시킨 후, 전체 탈보호시킨다. 본원에서, 예를 들어, 상응하는 PG는 Lys17에서 구현될 수 있으며, 이는 다른 PG (예를 들어, Boc, tBu 및/또는 Trt)의 존재하에 선택적으로 제거될 수 있다. 일부 예에서, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 방법은 하기 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하며, 이러한 화합물은 서열식별번호:21 및 18에 제시된 구조, 뿐만 아니라
일부 예에서, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 방법은 하기 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하며, 이러한 화합물은 서열식별번호:22 및 19에 제시된 구조, 뿐만 아니라
대안적으로, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체를 제조하는 다른 방법은 NCL 접근법을 통해 탈보호된 화합물 중간체 (예를 들어, 티오에스테르 단편 및 아미드 단편)를 커플링시키는 단계를 적어도 포함한다. 본원에서, 예를 들어 Ala21을 Cys의 천연 거울상이성질체로 치환시킬 수 있고, 라이게이션 단계를 완료한 후에 Cys를 탈황화시켜 필요한 Ala21을 하기 중간체 화합물에 전달함으로써 서열식별번호:6을 수득할 수 있으며, 이러한 화합물은 서열식별번호:23 및 24에 제시된 구조를 갖는다.
대안적으로, 티오에스테르 (서열식별번호:23)는 중간체 화합물로 치환될 수 있으며, C-말단에서 -C-P-OR 에스테르 (CPE)의 모이어티는 차폐된 티오에스테르로서 작용하여, 서열식별번호:39 및 24에 제시된 구조를 갖는 화합물의 라이게이션 단계를 용이하게 할 수 있다.
다른 예에서, Ala18을 Cys로 대체시키고, 하기 중간체 화합물의 천연 화학적 라이게이션 후에 탈황화시킬 수 있으며, 이러한 화합물은 서열식별번호:25 및 26에 제시된 구조를 갖는다.
대안적으로, 티오에스테르 (서열식별번호:25)를 중간체 화합물로 치환시킬 수 있고, -Cys-Pro-OR 에스테르 (CPE)의 모이어티는 차폐된 티오에스테르로서 작용하여, 서열식별번호:40 및 26에 제시된 구조를 갖는 화합물의 라이게이션 단계를 용이하게 할 수 있다.
대안적으로, 서열식별번호:5의 인크레틴 유사체를 제조하는 다른 방법은 NCL 접근법을 통해 하기 중간체 화합물 (예를 들어, 비-아실화된 티오에스테르 단편 및 아미드 단편)을 커플링시키는 단계를 적어도 포함하며, 이러한 화합물은 서열식별번호:27 및 26에 제시된 구조를 갖는다.
대안적으로, 티오에스테르 (서열식별번호:27)를 중간체 화합물로 치환시킬 수 있으며, -Cys-Pro-OR 에스테르 (CPE)의 모이어티는 차폐된 티오에스테르로서 작용하여, 서열식별번호:41 및 26에 제시된 구조를 갖는 화합물의 라이게이션 단계를 용이하게 할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 서열식별번호:29는 서열식별번호:43 및 서열식별번호:44를 커플링시킨 다음, 탈보호시켜, 서열식별번호:29를 생성함으로써 합성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 서열식별번호:48은 서열식별번호:20 및 서열식별번호:18을 이용하여 합성될 수 있다. 서열식별번호:48을 탈보호시켜 서열식별번호:6을 생성한다.
또 다른 실시양태에서, 서열식별번호:53은 서열식별번호:51 및 서열식별번호:52를 사용하여 NCL에 의해 합성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 서열식별번호:53은 서열식별번호:52 및 서열식별번호:54를 사용하여 NCL에 의해 합성될 수 있다.
서열식별번호:9, 12, 14, 15, 17, 20, 23 및 25의 화합물 중간체의 효과적인 제조를 위해, 지방 측쇄
및 지방 측쇄가 부착된 Fmoc-L-Lys-OH 아미노산:
을 사용하여 합성한다
SPPS의 개선된 순도 및 효율을 위해, 서열식별번호:10, 15, 20, 21, 22, 23, 25 및 27의 제조에서 하기 이량체, 삼량체 및 사량체를 사용할 수 있으며, 하기 구조는 SPPS 또는 액체 상 합성을 통해 아미노산 빌딩 블록을 사용하여 합성될 수 있다:
다른 방법/용도:
본원의 인크레틴 유사체는 수많은 치료적 적용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인크레틴 유사체는 개체에서 비만을 치료하는 방법에서 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 비만의 치료를 필요로 하는 개체에게 본원의 인크레틴 유사체, 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
추가로, 인크레틴 유사체는 개체에서 비치료적 체중 감소를 유도하는 방법에서 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 비치료적 체중 감소의 유도를 필요로 하는 개체에게 본원의 인크레틴 유사체, 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
추가로, 본원의 인크레틴 유사체는 개체에서 대사 증후군을 치료하는 방법에서 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 개체에게 본원의 인크레틴 유사체, 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
추가로, 본원의 인크레틴 유사체는 개체에서 NASH를 치료하는 방법에서 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 NASH의 치료를 필요로 하는 개체에게 기재된 인크레틴 유사체, 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
추가로, 본원의 인크레틴 유사체는 개체에서 NAFLD를 치료하는 방법에서 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 NAFLD의 치료를 필요로 하는 개체에게 본원의 인크레틴 유사체, 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
이들 방법에서, 인크레틴 유사체의 효과는 예를 들어 혈중 글루코스에서 유의한 감소를 관찰함으로써, 인슐린에서 유의한 증가를 관찰함으로써, HbA1c에서 유의한 감소를 관찰함으로써 및/또는 체중에서 유의한 감소를 관찰함으로써 평가될 수 있다.
대안적으로, 본원의 인크레틴 유사체 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 골 강도의 개선을 필요로 하는 개체에서 골 강도를 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 골 강도의 개선을 필요로 하는 개체는 골감소증 또는 유골형성 감소증을 갖거나, 또는 골절, 교정 절차, 보철 임플란트, 치과 임플란트, 및/또는 척추 융합술로부터 치유 중이다. 인크레틴 유사체는 다른 장애, 예컨대 파킨슨(Parkinson) 질환 또는 알츠하이머(Alzheimer) 질환의 치료를 위해 또한 사용될 수 있다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 제한하는 것이 아니라 설명의 목적으로 제공된다.
펩티드 및 폴리펩티드 합성
실시예 1: 중간체 화합물 1의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 1 (서열식별번호:7), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 1에 제시된 조건에 의해 시버(Sieber) 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 1: 실시예 1에 대한 SPPS 조건.
Fmoc 탈보호, 단편 절단 및 단리: 시버 수지 상에서 단편을 10 V의 20% 피페리딘/DMF와 함께 20-30 분 동안 2회 교반한 다음, 10 V의 DMF로 6회 세척한다. 시버 수지 상에서 de-Fmoc화 단편을 10 V DCM을 사용하여 10-20 분 동안 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시키고, 20 V의 5% TFA/DCM을 반응기에 충전한 다음, 질소하에 온도를 약 15℃로 유지하면서 2 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합한다. 감압하에 내부 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 생성된 용액으로부터 DCM을 제거하여 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. MTBE (25 V)를 용액에 충전하고, 감압하에 내부 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 DCM/MTBE 용매를 제거하여 다시 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. 상청액에서 단편의 잔류 농도가 <0.11 wt%에 도달하지 않을 때까지, MTBE 첨가/증류 작업을 반복한다. 이어서, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 2: 중간체 화합물 2의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 2 (서열식별번호:8), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 2에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 2: 실시예 2에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 10 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 약 25℃에서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨 다음, 5 V의 DMSO를 여액에 첨가한다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합한다. 온도를 ≤ 35℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 6-10 V로 농축시킨다 (잔류 DCM 농도 ≤ 15%). 단편의 DMSO 용액을 약 25℃에서 2-6 시간 기간에 걸쳐 (< 1 L/분) 11-15 V의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 형성된 슬러리를 약 25℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 8-12 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 3: 중간체 화합물 3의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 3 (서열식별번호:9), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 3에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Ala-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 3: 실시예 3에 대한 SPPS 조건.
* Fmoc-L-Lys(t-BuOOC-(CH2)18-COO-γ-L-Glu-AEEA)
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 진공하에 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤ X%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간 기간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 4: 중간체 화합물 4의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 4 (서열식별번호:10), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 4에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Leu-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 4: 실시예 4에 대한 SPPS 조건.
* Boc-L-Tyr(t-Bu)-Aib-L-Gln(Trt)-Gly-OH에 대한 구조는 다음과 같다:
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 2 V의 DMSO를 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 진공하에 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤5%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 DMSO 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 7-9 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 40℃에서 건조시킨다.
실시예 5: 중간체 화합물 5의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 5 (서열식별번호:11), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 5에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 5: 실시예 5에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 10 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 약 25℃에서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨 다음, 5 V의 DMSO를 여액에 첨가한다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합한다. 온도를 ≤ 35℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 6-10 V로 농축시킨다 (잔류 DCM 농도 ≤ 15%). 단편의 DMSO 용액을 약 25℃에서 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 11-15 V의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 형성된 슬러리를 약 25℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 8-12 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 6: 중간체 화합물 6의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 6 (서열식별번호:12), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 6에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 6: 실시예 6에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 진공하에 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤15%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 7: 중간체 화합물 7의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 7 (서열식별번호:13), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 7에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 7: 실시예 7에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 10 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 25℃에서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨 다음, 5 V의 DMSO를 여액에 첨가한다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합한다. 온도를 ≤ 35℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 6-10 V로 농축시킨다 (잔류 DCM 농도 ≤ 15%). 단편의 DMSO 용액을 약 25℃에서 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 11-15 V의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 형성된 슬러리를 약 25℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 8-12 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 8: 중간체 화합물 8의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 8 (서열식별번호:14), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 8에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Ala-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 8: 실시예 8에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 진공하에 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤15%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 9: 중간체 화합물 9의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 9 (서열식별번호:15), 또는 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 9에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Ala-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 9: 실시예 9에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 진공하에 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤15%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 10: 중간체 화합물 10의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 10 (서열식별번호:16), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 10에 제시된 조건에 의해 시버 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 10: 실시예 10에 대한 SPPS 조건.
Fmoc 탈보호, 단편 절단 및 단리: 시버 수지 상에서 단편을 10 V의 20% 피페리딘/DMF와 함께 20-30 분 동안 2회 교반한 다음, 10 V의 DMF로 6회 세척한다. 시버 수지 상에서 de-Fmoc화 단편을 10 V DCM을 사용하여 10-20 분 동안 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시킨다. 20 V의 5% TFA/DCM을 반응기에 충전하고, 질소하에 온도를 약 15℃로 유지하면서 2 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합한다. 감압하에 내부 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 생성된 용액으로부터 DCM을 제거하여 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. MTBE (25 V)를 용액에 충전하고, 감압하에 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 DCM/MTBE 용매를 다시 제거하여 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. 상청액에서 단편의 잔류 농도가 < 0.11 wt%에 도달하지 않을 때까지, MTBE 첨가/증류 작업을 반복한다. 이어서, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 슬러리를 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 11: 중간체 화합물 11의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 11 (서열식별번호:17), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 11에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 (0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 11: 실시예 11에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 진공하에 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤ X%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 12: 중간체 화합물 12의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 12 (서열식별번호:18), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 12에 제시된 조건에 의해 시버 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 12: 실시예 12에 대한 SPPS 조건.
Fmoc 탈보호, 단편 절단 및 단리: 시버 수지 상에서 단편을 10 V의 20% 피페리딘/DMF와 함께 20-30 분 동안 2회 교반한 다음, 10 V의 DMF로 6회 세척한다. 시버 수지 상에서 de-Fmoc화 단편을 10 V DCM을 사용하여 10-20 분 동안 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시킨다. 20 V의 5% TFA/DCM을 반응기에 충전하고, 질소하에 온도를 약 15℃로 유지하면서 2 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합한다. 감압하에 내부 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 생성된 용액으로부터 DCM을 제거하여 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. MTBE (25 V)를 용액에 충전하고, 감압하에 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 DCM/MTBE 용매를 다시 제거하여 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. 상청액에서 단편의 잔류 농도가 <0.11 wt%에 도달하지 않을 때까지, MTBE 첨가/증류 작업을 반복한다. 이어서, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 슬러리를 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 13: 중간체 화합물 13의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 13 (서열식별번호:19), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 13에 제시된 조건에 의해 시버 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 13: 실시예 13에 대한 SPPS 조건.
Fmoc 탈보호, 단편 절단 및 단리: 시버 수지 상에서 단편을 10 V의 20% 피페리딘/DMF와 함께 20-30 분 동안 2회 교반한 다음, 10 V의 DMF로 6회 세척한다. 시버 수지 상에서 de-Fmoc화 단편을 10 V DCM을 사용하여 10-20 분 동안 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시킨다. 20 V의 5% TFA/DCM을 반응기에 충전하고, 질소하에 온도를 약 15℃로 유지하면서 2 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합한다. 감압하에 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 생성된 용액으로부터 DCM을 제거하여 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. MTBE (25 V)를 용액에 충전하고, 감압하에 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 DCM/MTBE 용매를 다시 제거하여 22.5 V 잔류 부피가 되게 한다. 상청액에서 단편의 잔류 농도가 < 0.11 wt%에 도달하지 않을 때까지, MTBE 첨가/증류 작업을 반복한다. 이어서, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 슬러리를 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 14: 중간체 화합물 14의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 14 (서열식별번호:20), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 14에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 14: 실시예 14에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 진공하에 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤ X%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 15: 중간체 화합물 15의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 (서열식별번호:21), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 15에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 15: 실시예 15에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 진공하에 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤ X%). 온도를 약 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 16: 중간체 화합물 16의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 16 (서열식별번호:22), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 16에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Ala-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 16: 실시예 16에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: CTC 수지 상에서 단편을 DCM (5 V)을 사용하여 45 분 동안 1회 팽윤시킨다. 5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 2회 더 반복한다. 수지를 3 V의 DCM으로 세척하고, 10-15 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합하고, 생성된 혼합물을 ≤ 20℃로 냉각시킨다. 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 2-4 V로 농축시킨다. 5 V의 ACN을 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 20℃로 유지하면서 잔류 DCM을 진공하에 제거한다 (잔류 DCM 농도 ≤X%). 온도를 0℃로 유지하면서 단편의 ACN 용액을 2-6 시간에 걸쳐 (< 1 L/분) 5 V의 빙온의 H2O에 첨가한다. 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 0℃에서 30-40 분 동안 교반한 다음, 약 0℃에서 여과한다. 생성된 고체를 약 25℃에서 3-5 V의 H2O에 현탁시키고, 10-15 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 고체를 약 40℃에서 건조시킨다.
실시예 17: 중간체 화합물 17의 하이브리드 액체 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 17 (서열식별번호:23), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 17에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Aib-2-CTC-히드라진 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 17: 실시예 17에 대한 SPPS 조건.
여과 반응기를 사용하여 수지 상에서 단편을 DCM (3 x 10 V)으로 팽윤시킨다. 10 V의 TFA, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 탈보호 칵테일을 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 수지에 첨가하고, 생성된 슬러리를 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, DCM (2 x 3 V)으로 세척한다. 이어서, 생성된 여액을 합하고, 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
조 펩티드 히드라지드를 30 V의 라이게이션 완충제 (6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.2 M 인산수소나트륨 일염기성 완충제, pH 3.35)에 용해시키고, 약 -15℃로 냉각시킨다. 1 M 아질산나트륨 용액 (5.0-10.0 당량)을 히드라지드 용액에 첨가하고, 약 -15℃에서 10 분 동안 교반한다. 10 분 후, 2,2,2-트리플루오로에탄티올 (20.0 당량, pH 7.0)을 펩티드 히드라지드의 산화로부터 생성된 펩티딜 아지드에 첨가한다. 반응 혼합물의 pH를 5 N 수산화나트륨 용액에 의해 7.0으로 조정한다. 펩티딜 아지드를 1 시간 동안 티올 분해시킨 다음, 생성된 펩티드 티오에스테르를 라이게이션 화학에서 바로 사용하거나 또는 역상 크로마토그래피를 통해 정제한다 ([Huang et al. (2014) Tetrahedron 70:2951-2955] 참고).
실시예 18: 중간체 화합물 18의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 18 (서열식별번호:24), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 18에 제시된 조건에 의해 시버 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 18: 실시예 18에 대한 SPPS 조건.
절단 및 탈보호: 여과 반응기를 사용하여 수지 상에서 단편을 DCM (3 x 10 V)으로 팽윤시킨다. 10 V의 TFA, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 탈보호 칵테일을 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 수지에 첨가하고, 생성된 슬러리를 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, DCM (2 x 3 V)으로 세척한다. 이어서, 생성된 여액을 합하고, 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
실시예 19: 중간체 화합물 19의 하이브리드 액체 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 19 (서열식별번호:25), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 19에 제시된 조건에 의해 Fmoc-L-Lys(t-BuOOC-(CH2)18-COO-γ-L-Glu-AEEA)-Lys-2-CTC-히드라진 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 19: 실시예 19에 대한 SPPS 조건.
여과 반응기를 사용하여 수지 상에서 단편을 DCM (3 x 10 V)으로 팽윤시킨다. 10 V의 TFA, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 탈보호 칵테일을 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 수지에 첨가하고, 생성된 슬러리를 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, DCM (2 x 3 V)으로 세척한다. 이어서, 생성된 여액을 합하고, 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
조 펩티드 히드라지드를 30 V의 라이게이션 완충제 (6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.2 M 인산수소나트륨 일염기성 완충제, pH 3.35)에 용해시키고, 약 -15℃로 냉각시킨다. 1 M 아질산나트륨 용액 (5.0-10.0 당량)을 히드라지드 용액에 첨가하고, 약 -15℃에서 10 분 동안 교반한다. 10 분 후, 2,2,2-트리플루오로에탄티올 (20.0 당량, pH 7.0)을 펩티드 히드라지드의 산화로부터 생성된 펩티딜 아지드에 첨가한다. 반응 혼합물의 pH를 5 N 수산화나트륨 용액에 의해 7.0으로 조정한다. 펩티딜 아지드를 1 시간 동안 티올 분해시킨 다음, 생성된 펩티드 티오에스테르를 라이게이션 화학에서 바로 사용하거나 또는 역상 크로마토그래피를 통해 정제한다 (Huang (2014) 참고).
실시예 20: 중간체 화합물 20의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 20 (서열식별번호:26), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 20에 제시된 조건에 의해 시버 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 20: 실시예 20에 대한 SPPS 조건.
절단 및 탈보호: 여과 반응기를 사용하여 수지 상에서 단편을 DCM (3 x 10 V)으로 팽윤시킨다. 10 V의 TFA, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 탈보호 칵테일을 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 수지에 첨가하고, 생성된 슬러리를 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, DCM (2 x 3 V)으로 세척한다. 이어서, 생성된 여액을 합하고, 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
실시예 21: 중간체 화합물 21의 하이브리드 액체 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 21 (서열식별번호:27), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 21에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Lys(Boc)-2-CTC-히드라진 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 21: 실시예 21에 대한 SPPS 조건.
여과 반응기를 사용하여 수지 상에서 단편을 DCM (3 x 10 V)으로 팽윤시킨다. 10 V의 TFA, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 탈보호 칵테일을 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 수지에 첨가하고, 생성된 슬러리를 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, DCM (2 x 3 V)으로 세척한다. 이어서, 생성된 여액을 합하고, 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
조 펩티드 히드라지드를 30 V의 라이게이션 완충제 (6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.2 M 인산수소나트륨 일염기성 완충제, pH 3.35)에 용해시키고, 약 -15℃로 냉각시킨다. 1 M 아질산나트륨 용액 (5.0-10.0 당량)을 히드라지드 용액에 첨가하고, 약 -15℃에서 10 분 동안 교반한다. 10 분 후, 2,2,2-트리플루오로에탄티올 (20.0 당량, pH 7.0)을 펩티드 히드라지드의 산화로부터 생성된 펩티딜 아지드에 첨가한다. 반응 혼합물의 pH를 5 N 수산화나트륨 용액에 의해 7.0으로 조정한다. 펩티딜 아지드를 1 시간 동안 티올 분해시킨 다음, 생성된 펩티드 티오에스테르를 라이게이션 화학에서 바로 사용하거나 또는 역상 크로마토그래피를 통해 정제한다 (Huang (2014) 참고).
실시예 22: 중간체 화합물 22의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 22 (서열식별번호:28), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 22에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 22: 실시예 22에 대한 SPPS 조건.
절단 및 탈보호: CTC 수지 상에서 사량체를 DCM (5-10 V)을 사용하여 2 x 30 분 동안 팽윤시킨다. 3.5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 4회 더 반복한다. 수지를 3.5 V의 DCM으로 세척하고, 5-10 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합한다. 온도를 ≤ 35℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 1.5 V로 농축시킨다. 5 V의 IPAc를 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 40℃로 유지하면서 잔류 IPAc/DCM 용매를 진공하에 제거하여 1.5 V가 되게 한다. 5 V의 IPAc 첨가 및 진공 증류를 반복하여, 3.5 V의 최종 단편 용액을 생성한다. 이어서, 이 용액을 3 x 2 V의 5.0% NaCl 용액으로 세척한 다음, 온도를 ≤ 40℃로 유지하면서 IPAc를 감압하에 제거하여 1.5 V가 되게 한다. 4-5 V 헵탄을 40℃에서 용액에 첨가한다. 이어서, 온도를 약 15℃로 감소시키고, 생성된 슬러리를 30 분 동안 교반한다. 온도를 ≤ 40℃로 유지하면서 IPAc/헵탄 용매를 감압하에 제거하여 3.5 V가 되게 한다. 헵탄 충전 및 증류를 반복하고, 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 20℃로 냉각시키고, 여과하고, 2 V의 헵탄으로 세척하고, 생성된 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 23: 중간체 화합물 23의 고체상 펩티드 합성
중간체 화합물 23 (
), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 23에 제시된 조건에 의해 Fmoc-Leu-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-0.9 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 23: 실시예 23에 대한 SPPS 조건.
절단 및 탈보호: CTC 수지 상에서 사량체를 DCM (5-10 V)을 사용하여 2 x 30 분 동안 팽윤시킨다. 3.5 V의 1% TFA/DCM을 반응기에 충전시키고, 생성된 수지 현탁액을 질소하에 온도를 약 25℃로 유지하면서 10-15 분 동안 교반한다. 여액을 제거하고, 즉시 1.05 당량의 피리딘을 천천히 첨가하여 중화시킨다. 수지를 1% TFA/DCM으로 처리한 후, 여액 중화를 4회 더 반복한다. 수지를 3.5 V의 DCM으로 세척하고, 5-10 분 동안 교반한다. 모든 여액 및 세척액을 합한다. 온도를 ≤ 35℃로 유지하면서 단편 용액을 진공하에 1.5 V로 농축시킨다. 5 V의 IPAc를 용액에 첨가하고, 온도를 ≤ 40℃로 유지하면서 잔류 IPAc/DCM 용매를 진공하에 제거하여 1.5 V가 되게 한다. 5 V의 IPAc 첨가 및 진공 증류를 반복하여, 3.5 V의 최종 단편 용액을 생성한다. 이어서, 이 용액을 3 x 2 V의 5.0% NaCl 용액으로 세척하고, 온도를 ≤ 40℃로 유지하면서 IPAc를 감압하에 제거하여 1.5 V가 되게 한다. 4-5 V 헵탄을 약 40℃에서 용액에 첨가한다. 이어서, 온도를 약 15℃로 감소시키고, 생성된 슬러리를 30 분 동안 교반한다. 온도를 ≤ 40℃로 유지하면서 IPAc/헵탄 용매를 감압하에 제거하여 3.5 V가 되게 한다. 헵탄 충전 및 증류를 반복하고, 침전된 단편의 생성된 슬러리를 약 20℃로 냉각시키고, 여과하고, 2 V의 헵탄으로 세척하고, 생성된 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 24: 중간체 화합물 24의 액체 상 펩티드 합성
중간체 화합물 24 (
), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 용액 중에서 표준 커플링 화학을 이용하여 H-L-2-Me-Leu 및 Fmoc-L-Ile-OH을 커플링시킨 후, 후처리 및 단리하여 합성될 수 있다.
실시예 25: 지방산 모이어티 (화합물 25)의 고체상 펩티드 합성
화합물 25
(
), 또는 그의 제약상 허용가능한 염은 표준 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 간략히, SPPS는 하기 표 24에 제시된 조건에 의해 Fmoc-PEG-2-CTC 수지 (로딩 지수 0.6-1.1 mmol/g)를 이용하여 수행된다.
표 24: 실시예 25에 대한 SPPS 조건.
실시예 26: 4가지 중간체 화합물로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
커플링 프로토콜: 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 HLSPS를 통해 서열식별번호:7, 8, 9 및 10을 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 간략히, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 서열식별번호:7의 용액 (1.05-1.30 mmol) 및 서열식별번호:8의 용액 (1.00 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.30-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 2-4 시간 동안 교반한다. 이어서, 10 당량의 DEA를 첨가하고, 혼합물을 4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
다음으로, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 커플링된 서열식별번호:7+8의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:9의 용액 (1.05-1.30 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.30-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 2-4 시간 동안 교반한다. 이어서, 10 당량의 DEA를 첨가하고, 혼합물을 2-4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
다음으로, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 커플링된 서열식별번호:7+8+9의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:10의 용액 (1.20-1.30 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.50-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 3-4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
전체 탈보호: 탈보호 칵테일은 10 V의 TFA, 2 V의 DCM, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 약 15℃로 냉각시킨 다음, 고체인 커플링된 서열식별번호:7+8+9+10을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 혼합물을 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물 서열식별번호:6을 백색 고체로서 수득한다.
실시예 27: 4가지 중간체 화합물로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
여기서, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 본질적으로 실시예 26에서 서열식별번호:7, 8, 9 및 10의 커플링에 대해 기재된 바와 같이 수렴형 고체-상 펩티드 합성 (CSPPS)을 통해 서열식별번호:7, 11, 12 및 10을 커플링시킴으로써 제조된다.
실시예 28: 4가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
여기서, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 본질적으로 실시예 26에서 서열식별번호:7, 8, 9 및 10의 커플링에 대해 기재된 바와 같이 CSPPS를 통해 서열식별번호:7, 13, 14 및 10을 커플링시킴으로써 제조된다.
실시예 29: 3가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 CSPPS를 통해 서열식별번호:7, 13 및 15를 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 간략히, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 서열식별번호:7의 용액 (1.05-1.30 mmol) 및 서열식별번호:13의 용액 (1.00 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.30-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 2-4 시간 동안 교반한다. 이어서, 10 당량의 DEA를 첨가하고, 혼합물을 4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
다음으로, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 커플링된 서열식별번호:7+13의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:15의 용액 (1.20-1.30 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.50-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 2-4 시간 동안 교반한다. 이어서, 10 당량의 DEA를 첨가하고, 혼합물을 2-4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
전체 탈보호: 탈보호 칵테일은 10 V의 TFA, 2 V의 DCM, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 약 15℃로 냉각시킨 다음, 고체인 커플링된 서열식별번호:7+13+15를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 혼합물을 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물 SEQ 6을 백색 고체로서 수득한다.
실시예 30: 3가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 CSPPS를 통해 서열식별번호:16, 9 및 10을 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 간략히, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 서열식별번호:16의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:9의 용액 (1.05-1.30 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.30-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 3-4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
다음으로, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 커플링된 서열식별번호:16+9의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:10의 용액 (1.20-1.30 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.50-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 2-4 시간 동안 교반한다. 이어서, 10 당량의 DEA를 첨가하고, 혼합물을 2-4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
전체 탈보호: 탈보호 칵테일은 10 V의 TFA, 2 V의 DCM, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 약 15℃로 냉각시킨 다음, 고체인 커플링된 서열식별번호:16+9+10을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 혼합물을 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물 SEQ 6을 백색 고체로서 수득한다.
실시예 31: 3가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
여기서, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 본질적으로 실시예 30에서 서열식별번호:16, 9 및 10의 커플링에 대해 기재된 바와 같이 CSPPS를 통해 서열식별번호:18, 12 및 10을 커플링시킴으로써 제조된다.
실시예 32: 2가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 CSPPS를 통해 서열식별번호:19 및 15를 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 간략히, 30-40 V의 DMSO/ACN (70:30) 중에서 서열식별번호:18의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:15의 용액 (1.20-1.30 mmol)을 실온에서 PyBOP, HATU 또는 PyOXim 시약 (1.50-2.00 mmol) 및 DIEA (4.00-5.00 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. 혼합물을 실온에서 2-4 시간 동안 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다.
전체 탈보호: 탈보호 칵테일은 10 V의 TFA, 2 V의 DCM, 0.4 V의 TIPS, 0.4 V H2O 및 0.3 중량 V의 DTT를 혼합하여 제조하고, 균질해질 때까지 교반한다. 칵테일을 약 15℃로 냉각시킨 다음, 고체인 커플링된 서열식별번호:19+15를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 혼합물을 약 -10℃로 냉각시키고, 75 V의 MTBE를 천천히 첨가한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 2 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물 서열식별번호:6을 백색 고체로서 수득한다.
실시예 33: 2가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
여기서, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 본질적으로 실시예 32에서 서열식별번호:15 및 19의 커플링에 대해 기재된 바와 같이 CSPPS를 통해 서열식별번호:18 및 20을 커플링시킴으로써 제조된다.
실시예 34: 2가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
여기서, 두 단편을 커플링시킨 후에, Lys17 상의 보호기를 화학적 변환을 통해 선택적으로 제거한 다음 (조건은 기의 성질에 따라 좌우됨), 지방산 측쇄로 선택적으로 아실화시킨 후, 전체 탈보호를 수행한 것을 제외하고는, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 본질적으로 실시예 32에서 서열식별번호:15 및 19의 커플링에 대해 기재된 바와 같이 CSPPS를 통해 서열식별번호:21 및 18 또는 서열식별번호:22 및 19를 커플링시킴으로써 제조된다.
실시예 35: 2가지 중간체 단편으로부터 천연 화학적 라이게이션을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 천연 화학적 라이게이션을 통해 서열식별번호:23 및 24를 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 간략히, 서열식별번호:23의 펩티드 티오에스테르를 30-50 V의 라이게이션 완충제 (6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.2 M 인산수소나트륨 일염기성 완충제, pH 7.04)에 용해시킨다. N-말단 시스테인-함유 펩티드 단편 서열식별번호:24 (0.9-0.95 당량)를 티오에스테르 용액에 첨가한다. 40 당량의 2,2,2-트리플루오로에탄티올 (pH 7.16) 및 20 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (pH 7.0)을 반응 혼합물에 첨가하고, pH를 5 N 수산화나트륨 용액에 의해 7.0으로 조정한다. 반응을 실온에서 24 시간 동안 교반하고, 생성된 용액을 역상 정제에서 바로 사용한다.
실시예 36: 2가지 중간체 단편으로부터 천연 화학적 라이게이션을 통해 인크레틴 유사체의 하이브리드 액체 고체상 합성
여기서, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체는 본질적으로 실시예 35에서 서열식별번호:23 및 24의 커플링에 대해 기재된 바와 같이 CSPPS를 통해 서열식별번호:25 및 26을 커플링시킴으로써 제조될 수 있다.
실시예 36: 화합물 35의 합성
화합물 35
디클로로메탄 (7.5 L, 15.0 vol.)을 15-30℃에서 20 L 4구 플라스크에 첨가하고, 18-(tert-부톡시)-18-옥소옥타데칸산 (500.5 g, 1.0 eq. 1.35 mol) 및 N-히드록시숙신이미드 (185.6 g,1.2 eq., 1.61 mol)를 15-30℃에서 첨가하여, 현탁액을 수득한다. 반응 혼합물을 0-10℃로 냉각시키고, N-에틸-N'-카르보디이미드 (338.4 g,1.3 eq., 1.77 mol)로 한번에 충전하여, 용액을 수득한다. 반응 혼합물을 8 부피의 반-포화 염수로 3회 세척한다. 화합물 35를 다음 단계에서 바로 사용하여, 화합물 36을 제조한다.
화합물 35에 대한 대안적인 방법
18-(tert-부톡시)-18-옥소옥타데칸산 (20 g, 53.431 mmol, 99 질량%), N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 (1.2 당량, 64.117 mmol, 99.6 질량%) 및 4-디메틸아미노피리딘 (0.2 당량, 1.31 g, 10.7 mmol, 100 질량%)을 오버헤드 진탕기를 구비한 1000 mL 배플형 자켓-반응기에 충전한다. 에틸 아세테이트 (800 mL, 40 부피)를 첨가하고, 생성된 슬러리를 주위 온도 (18℃-23℃)에서 밤새 (18-24 h) 교반한다. 24 시간 후 조 샘플의 1H-NMR은 일반적으로 97-99% 반응 완료를 나타낸다. 배치를 탈이온수 (3 x 82 mL)로 추출한다. 유기 층을 진공하에 ~160 mL로 농축시킨다. 에틸 아세테이트 (200 mL)를 반응에 첨가하고, 조 반응 용액을 진공하에 50℃에서 ~180 mL로 감소시킨다. 용액을 자켓 여과기로 옮기고, 진탕시키면서 3℃로 천천히 냉각시킨다. 이어서, 반응을 3-5℃에서 1 시간 동안 유지시킨다. 고체를 여과하고, 저온 에틸 아세테이트 (18 mL)로 세척하고, 진공하에 (7 in의 Hg) 건조시켜, 화합물 35를 고체로서 수득한다 (22.6 g, 90.5% 수율, 99.17% HPLC-CAD).
실시예 37: t-BuO-C18-Glu-1-OtBu (화합물 36)의 합성
화합물 36
화합물 35를 15-30℃에서 20 L 4구 플라스크에서 디클로로메탄 (2.5 L, 5.0 vol.) 중 (4S)-4-아미노-5-tert-부톡시-5-옥소-펜탄산 (H-Glu-1-OtBu) (289 g, 1.14 eq., 1 mol)의 용액에 첨가한다. 이어서, 15-30℃에서 반응기를 디이소프로필에틸아민 (230 g,1.5 eq., 1.78 mol)으로 충전하여, 용액을 수득한다. 제조물 1<0.5%인 경우, 다음 단계에서 계속 반응시킨다. 유기 상을 KHSO4의 2% 수성 용액 (4 g/g x 3)으로 세척하고, 진공하에 T<50℃ 및 <-0.08MPa에서 1-2 vol.로 농축시킨다. 아세토니트릴 (8 vol.)을 반응기에 충전하고, <60℃에서 1-2 vol.로 농축시킨다. 아세토니트릴 (8 vol.)을 반응기에 다시 충전하고, <60℃에서 5-6 vol.로 농축시킨다. 농축물을 40-50℃로 냉각시키고, 0.5-1 시간 동안 교반한 다음, 2-4 시간 동안 15-30℃로 냉각시킨다. 슬러리를 여과하고, 아세토니트릴 (3 vol.)로 세척하고, N2하에 건조시켜, 화합물 36을 고체로서 수득한다 (659.5 g, 86.3% 수율, 99.1% LCAP).
화합물 36에 대한 대안적인 방법
화합물 35 (50 g, 104.8 mmol, 98 질량%), (4S)-4-아미노-5-tert-부톡시-5-옥소-펜탄산 H-Glu-1-OtBu (H-Glu-1-OtBu) (25.7 g, 126 mmol, 99.3 질량%)을 오버헤드 진탕기 및 열전대를 구비한 1L 배플형 자켓-반응기에 충전한다. 아세토니트릴 (500 mL, 10 V)을 사용하여 고체를 깔때기 아래 반응 용기로 세척한다. 이어서, 디이소프로필에틸아민 (22 mL, 126 mmol, 99.75 질량%)을 반응에 첨가한다. 반응을 40℃로 가열하고, 18 시간 동안 교반한다. 1H-NMR / HPLC-CAD에 의해 반응 완료를 확인한 후, 아세트산 (7.2 mL, 130 mmol, 100 질량%) 및 물 (215 mL, 11934.6 mmol, 100 질량%)을 반응에 충전하고, 30-35℃에서 1 시간 동안 교반한다. 배치를 오버헤드 진탕기를 구비한 자켓 여과기로 옮기고, -20℃로 냉각시킨다. Tr = 2℃ 및 Tj = -9℃에서 용액으로부터 고체가 결정화되기 시작한다. 고체를 이 온도에서 1 시간 동안 유지시킨다. 이어서, 탈이온수 (8.6 V, 460 mL)를 이 배치에 붓고, 여과기를 0℃로 가온시킨다. 고체를 여과하고, 고진공하에 40℃에서 건조시켜, 화합물 36을 고체로서 수득한다 (55.5 g, 95.3% 수율, 99.62% HPLC-CAD).
실시예 38: t-BuO-C18-Glu-1-OtBu-5-ONSu (화합물 37)의 합성
아세토니트릴 (12.0 vol.)을 15-30℃에서 20 L 4구 플라스크에 첨가한다. 화합물 36 (500.4 g,1.0 eq., 0.90 mol) 및 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 (278.5 g,1.2 eq., 1.09 mol)를 15-30℃에서 플라스크에 첨가하여, 현탁액을 수득한다. 4-디메틸아미노피리딘 (11.0g, 0.1 당량, 0.09mol)을 한번에 첨가하여, 용액을 수득한다. 물 (1.6 Kg)을 0.5-1 시간에 걸쳐 첨가한다. 혼합물을 1-2 시간 동안 0-10℃로 냉각시키고, 여과하고, 아세토니트릴 (2 vol. 0-10℃)로 세척하고, N2하에 건조시켜, 화합물 37을 고체로서 수득한다 (536.0 g, 91.3% 수율 100.0% LCAP).
화합물 37의 대안적인 합성
화합물 36 (55 g, 98.96 mmol), N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 (31 g, 121 mmol, 99.6 질량%), 4-디메틸아미노피리딘 (1.22 g, 9.89 mmol, 99 질량%)을 오버헤드 진탕기 및 열전대를 구비한 1L 배플형 자켓-반응기에 충전한다. 아세토니트릴 (660 mL, 12 V)을 반응 용기에 첨가한다. 반응을 24℃에서 4 시간 동안 교반한다. 1H-NMR / HPLC-CAD에 의해 반응 완료를 확인한 후, 반응 용액을 1000 mL 비커로 옮기고, 탈이온수 (180 mL)를 자성 교반 막대를 구비한 비커에 첨가한다. 용액이 교반됨에 따라 반응으로부터 고체가 부서져 나온다. 반응 슬러리를 냉장고 (2-10℃)에서 밤새 냉각시킨다. 고체를 여과하고, 여과 케이크를 125 mL 저온 (2-10℃) 아세토니트릴로 세척한다. 고체를 고진공하에 40℃에서 24 시간 동안 건조시켜, 화합물 37이 형성된다 (59.3 g, 91.8% 수율, 99.61% HPLC-CAD).
실시예 39: t-BuO-C18-Glu-1-OtBu-5-(AEEA)
2
(화합물 38)의 합성
디클로로메탄 (7.5L,15.0 vol.)을 15-30℃에서 20 L 4구 플라스크에 한번에 첨가한 후, 15-30℃에서 (AEEA)2 (261 g, 1.1 eq., 0.85 mol), 화합물 37 (501 g,1.0 eq., 0.77 mol) 및 디이소프로필에틸아민 (1.5 eq.)을 첨가한다. 화합물 37이 <0.5%이면, 다음 단계에서 계속 반응시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 진공하에 T<30℃, P<-0.08 MPa에서 5-6 vol.로 농축시킨다. 에틸 아세테이트를 조 생성물 (5 vol.)에 첨가하고, 진공하에 T<50℃, P<-0.08 MPa에서 농축시킨다. 에틸 아세테이트 (10 vol.)를 농축물에 첨가하고, 2% 수성 KHSO4 (5 g/g x 5-6) 용액으로 세척하고, 진공하에 T<40℃ 및 P<-0.0 8MPa에서 1.2 vol.로 농축시킨다. 디메틸포름아미드를 농축물 (3 g/g vol.)에 첨가하여, 생성물 화합물 38을 옅은 황색 용액으로 수득한다 (2.4Kg, 92.7% 수율, 98.7% LCAP).
화합물 38의 대안적인 합성
(AEEA)2 (27.6 g, 1.1 당량, 85.0 mmol, 95 질량%), N-메틸-N-트리메틸실릴아세트아미드 (30 mL, 2 당량, 200 mmol, 90 질량%) 및 에틸 아세테이트 (230 mL)를 열전대 및 자성 교반 막대를 구비한 500 mL 플라스크에 첨가한다. 반응을 18-23℃에서 3 시간 동안 교반한다. 3 시간 후, 화합물 37 (50 g, 76.58 mmol, 100 질량%) 및 에틸 아세테이트 (130 mL)를 반응 플라스크에 첨가하고, 18-23℃에서 2 시간 동안 교반한다. 1H-NMR / HPLC-CAD에 의해 반응 완료를 확인한 후, 반응 용액을 분별 깔때기로 옮기고, 유기 층을 2 % KHSO4 용액 (100 mL x 3) 및 2% NaCl 용액 (100 mL x 6)으로 세척한다. 유기 층을 농축시키고, 생성된 오일을 고진공하에 50℃에서 24 시간 동안 건조시켜, 화합물 38을 -20℃에서 왁스성 고체로서 수득한다 (66.32g, Q-NMR에 의한 94.9% 효능, 99.53% HPLC-CAD).
실시예 40: 천연 화학적 라이게이션
화합물 39의 합성
Fmoc-히드라진-2-클로로트리틸 수지 (1.16 g, 0.85 mmol)를 심포니(Symphony) X 합성기 상에서 2 x 10 mL DMF로 각각 20 분 동안 팽윤시킨다. Fmoc 탈보호는 3 x 10 mL 20% 피페리딘/DMF에 의해 각각 30 분 동안 수행된다. 이어서, 수지를 5 x 10 mL DMF로 세척한다.
(2S)-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-부톡시-4-[(18-tert-부톡시-18-옥소-옥타데카노일)아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산 (화합물 38, 2.13 g, 1.78 mmol, 2.1 당량) 및 TNTU (0.715 g, 1.96 mmol, 2.31 당량)를 약 20.5 mL의 DMF에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (0.57 mL, 3.27 mmol, 3.85 당량)을 용액에 첨가한다. 용액을 회전식 혼합기 상에서 15 분 동안 혼합한다. 15 분 후, 사전-활성화된 화합물 38의 용액을 수지에 첨가하고, 8 시간 동안 커플링시킨다. 이어서, 수지를 5 x 10 mL DMF, 5 x 10 mL DCM으로 세척하고, 합성기 상에서 8 시간 동안 건조시킨다. 수지 로딩은 정량적인 NMR에 의해 0.45 mmol/g인 것으로 결정된다.
실시예 41: 화합물 40 (서열식별번호:58)의 합성
각각 약 1.10 g의 화합물 39 (로딩 값: 0.45 mmol/g)를 2개의 40 mL 반응기 용기에 첨가하고, 2 x 20 mL DMF로 각각 20 분 동안 팽윤시킨다. 서열식별번호:58은 표준 SPPS 프로토콜을 이용하여 합성한다.
탈보호: 4 x 9 mL의 DMF 중 20% v/v 피페리딘, 각각 30 분.
커플링: 3 당량의 아미노산, 3 당량의 옥시마 및 3.3 당량의 DIC가 아미노산 커플링을 위해 사용된다.
SPPS 동안에, 각각의 커플링 및 fmoc 탈보호의 최종 반복 후에 수지를 1 분 N2 혼합하면서 5 x 9 mL DMF로 세척한다. 펩티드 히드라지드 합성 마지막에, 수지를 N2 혼합하면서 DCM으로 세척한다. 수지를 펩티드 합성기 상에서 건조시킨다.
전체 탈보호 및 절단
2.5% w/v 디티오트레이톨 (DTT), 2.5% v/v 물, 2.5% v/v 트리이소프로필실란 (TIPS) 및 92.5% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 제조된 45 mL의 절단 칵테일을 500 mL 3구 둥근 바닥 플라스크에서 건조된 수지 (4.2 g)에 첨가하고, 약 3 시간 교반한다. 수지를 여과하고, 2 x 2.5 mL TFA로 세척한다. 여액을 350 mL 저온 MTBE에 붓고, 펩티드가 즉시 침전된다. 여과 플라스크를 2 x 2.5 mL TFA로 세척하고, 저온 MTBE에 붓는다. 이를 30 분 동안 -20℃로 냉각시킨 다음, 원심분리한다. 이어서, 펩티드 침전물을 300 mL MTBE로 2회 세척하고, 원심분리한다. 펩티드 침전물을 27℃의 진공 오븐에서 약 14 시간 동안 건조시킨다. 건조시킨 후에 약 2.75 g의 조 화합물 40이 수득된다 [예측치 (질량+2H+)/2 = 1356.2257, 실측치 (질량+2H+)/2 = 1356.2245].
실시예 42: 화합물 41 (서열식별번호:59)의 합성
약 0.50 mmol의 화합물 41 (서열식별번호:59)은 화합물 40, 서열식별번호:58의 합성과 유사한 표준 SPPS 프로토콜에 의해 시버 아미드 수지 상에서 합성된다.
전체 탈보호 및 절단: 5% w/v 디티오트레이톨 (DTT), 2.5% v/v 물, 2.5% v/v 트리이소프로필실란 (TIPS) 및 90% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 제조된 25 mL의 절단 칵테일을 건조된 수지 (2.21 g)에 첨가하고, 회전식 혼합기 상에서 3 시간 혼합한다. 수지를 여과하고, 2 x 2.0 mL TFA로 세척한다. 여액을 175. mL 저온 MTBE에 붓고, 펩티드가 즉시 침전된다. 여과 플라스크를 2 x 2 mL TFA로 세척하고, 저온 MTBE에 붓는다. 이를 30 분 동안 -20℃로 냉각시킨 다음, 원심분리한다. 펩티드 침전물을 150 mL MTBE로 2회 세척하고, 원심분리한다. 펩티드 침전물을 27℃의 진공 오븐에서 14 시간 동안 건조시킨다. 건조시킨 후에 약 1.351 g의 조 화합물 41 (서열식별번호:58)이 수득된다. 이를 주위 온도에서 처음 3 분 동안 물 중 10% 아세토니트릴 (0.1% TFA) 및 3 내지 5 분에 물 중 10-15% 아세토니트릴 (0.1% TFA) 이후 23 분에 걸쳐 물 중 15-35% 아세토니트릴 (0.1% TFA)의 선형 구배를 이용하여 워터스(Waters) CSH C18 10 μm 컬럼 (10 mm x 250 mm) 상에서 RP-HPLC에 의해 정제한다. 약 650 mg의 정제된 화합물 41이 수득된다 [예측치 (질량+2H+)/2 = 1138.5486, 실측치 (질량+2H+)/2 = 1138.5458].
실시예 43: 화합물 42 (서열식별번호:60)의 합성
화합물 42 (티오에스테르 합성), 서열식별번호:60
조 펩티드 히드라지드 (화합물 40; 서열식별번호:58, 118.2 mg, 0.044 mmol)를 10 mL의 라이게이션 완충제 (6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.3 M 인산수소나트륨 일염기성, pH 약 3.5)에 용해시킨다. 용액을 아세톤-얼음 조에서 -15℃로 냉각시킨다. 0.3 mL의 1 M 아질산나트륨 용액 (20.7 mg, 0.3 mmol, 6.8 당량)을 펩티드 히드라지드 용액에 첨가하고, -15℃에서 15 분 동안 교반한다. 그 동안에, 0.2 mL 티오페놀을 라이게이션 완충제 (pH 약 7.0)에 의해 1.1 mL로 희석한다. 15 분 후, 1.1 mL의 티오페놀 혼합물을 펩티드 히드라지드 용액에 첨가하여, 화합물 40으로부터 생성된 펩티딜 아지드를 동일계 내에서 티올 분해시킨다.
반응 혼합물의 pH를 5 N 수산화나트륨 용액에 의해 약 7.0으로 조정한다. 펩티딜 아지드를 15 분 동안 티올 분해시켜, 화합물 42 (서열식별번호:60)를 수득한다.
실시예 44: 화합물 43, 서열식별번호:61 (티오에스테르 화합물 42와의 천연 화학적 라이게이션):
화합물 41 (서열식별번호:59 (75.4 mg, 0.033 mmol)을 섬광 바이알에서 2 mL의 라이게이션 완충제 (pH 약 7.0)에 용해시키고, 용액을 조 티오에스테르 용액 화합물 42 (서열식별번호:60)에 첨가한다. 바이알을 1 mL의 라이게이션 완충제 (pH 약 7.0)로 세정하고, 세정물을 반응 혼합물에 첨가한다. 1.5 mL의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP, 라이게이션 완충제 중 0.25 M, pH 약 7.0) 및 1.0 mL의 아스코르브산 용액 (라이게이션 완충제 중 0.53 M, pH 약 7.0)을 반응 혼합물에 첨가한다. 반응 혼합물의 pH를 5 N NaOH 용액에 의해 약 7.1로 조정하고, 용액이 투명하게 변하였다. 반응을 9-10 시간 내에 완료하여, 서열식별번호:61을 수득한다.
실시예 45: 서열식별번호:62 (화합물 44)의 합성
표 25: 서열식별번호:62 (화합물 44)에 대한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: DCM을 사용하여 CTC 수지 상에서 단편을 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시키고, 2% TFA/DCM (4 ml/g의 수지)을 반응기에 충전한 다음, 질소하에 15 분 동안 교반한다. 이어서, 1% TFA/DCM (4 ml/g의 수지)을 충전하고, 15 분 동안 교반하고, 여과 후에 이를 반복한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합하고, DIPEA로 중화시킨다. 생성된 용액으로부터 DCM을 제거하고, 염수를 충전하여 단편 2를 침전시킨다. 이어서, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 밝은 황색 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 46: 서열식별번호:42 (화합물 45)의 합성
표 26: 서열식별번호:42 (화합물 45)의 합성을 위한 SPPS 조건.
화합물 38
단편 절단 및 단리: DCM을 사용하여 CTC 수지 상에서 단편을 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시키고, 20% HFIP/DCM (8 ml/g의 수지)을 반응기에 충전한 다음, 60 분 동안 질소하에 교반한다. 이어서, 20% HFIP/DCM (4 ml/g의 수지)을 충전하고, 60 분 동안 교반한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 합하고, DCM 및 HFIP를 생성물로부터 제거하고, 헵탄 및 에테르를 충전하여 단편 3을 침전시킨다. 이어서, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 오렌지색 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 47: 서열식별번호:31 (화합물 28)의 합성
표 27: 서열식별번호:31의 합성을 위한 SPPS 조건.
단편 절단 및 단리: DCM을 사용하여 CTC 수지 상에서 단편을 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시키고, 2% TFA/DCM (4 ml/g의 수지)을 반응기에 충전한 다음, 질소하에 15 분 동안 교반한다. 이어서, 1% TFA/DCM (4 ml/g의 수지)을 충전하고, 15 분 동안 교반하고, 여과 후에 이를 반복한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합하고, DIPEA로 중화시킨다. 생성된 용액으로부터 DCM을 제거하고, 염수를 충전하여 단편 2를 침전시킨다. 이어서, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 회백색 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 48: 서열식별번호:43 (화합물 46)의 합성
표 28: SPPS를 통한 서열식별번호:43의 제조:
단편 절단 및 단리: 10 V DCM을 사용하여 시버 수지 상에서 단편을 10-20 분 동안 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시키고, 15 분 동안 6% TFA/DCM (5ml/g의 수지), 15 분 동안 3% TFA/DCM (5ml/g의 수지), 5 분 동안 1% TFA/DCM (10ml/g의 수지), 3 분 동안 1% TFA/DCM (5ml/g의 수지) 및 3 분 동안 1% TFA/DCM (2.5ml/g의 수지)으로 순차적으로 세척한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합한다. 생성된 용액으로부터 DCM을 감압하에 제거하고, EtOAc로 재구성한다. 헵탄을 용액에 충전하고, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 회백색 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 49: 서열식별번호:44 (화합물 47)의 합성
표 29: 서열식별번호:44의 제조.
단편 절단 및 단리: 10 V DCM을 사용하여 시버 수지 상에서 단편을 10-20 분 동안 2회 팽윤시킨다. 수지를 가진 반응기를 약 15℃로 냉각시키고, 15 분 동안 6% TFA/DCM (5ml/g의 수지), 15 분 동안 3% TFA/DCM (5ml/g의 수지), 5 분 동안 1% TFA/DCM (10ml/g의 수지), 3 분 동안 1% TFA/DCM (5ml/g의 수지) 및 3 분 동안 1% TFA/DCM (2.5ml/g의 수지)으로 순차적으로 세척한다. 수지를 여과하고, 3 x 10 V의 DCM으로 세척한다. 모든 여액을 함께 합한다. 생성된 용액으로부터 DCM을 감압하에 제거하고, EtOAc로 재구성한다. 헵탄을 용액에 충전하고, 온도를 약 15℃로 유지하면서 생성된 슬러리를 여과한다. 케이크에 14 V의 신선한 MTBE를 첨가하고, 약 15℃에서 30 분 동안 교반한 다음, 여과한다. 세척을 1회 더 반복하고, 생성된 회백색 고체를 약 35℃에서 건조시킨다.
실시예 50: 서열식별번호:29의 제조:
4가지 중간체 단편으로부터 화학적 접합을 통해 서열식별번호:29의 하이브리드 액체 고체상 합성.
서열식별번호:29는 HLSPS를 통해 서열식별번호:7, 42, 31 및 62를 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 서열식별번호:7 및 62를 커플링시켜, 서열식별번호:43을 생성한다. 서열식별번호:42 및 31을 커플링시켜, 서열식별번호:44를 생성한다. 서열식별번호:43 및 서열식별번호:44를 커플링시켜, 서열식별번호:29를 생성한다.
간략히, 10 V의 DMSO 중에서 서열식별번호:7의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:62의 용액 (1.1 mmol)을 실온에서 PyBOP, DEPBT 또는 EDC/HONB 시약 (1.30-2.00 mmol) 및 DIEA (2 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 여겨질 때까지, 혼합물을 실온에서 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 서열식별번호:43을 회백색 고체로서 수득한다.
다음으로, x V의 DMSO 중에서 서열식별번호:31의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:42의 용액 (1.1 mmol)을 실온에서 PyBOP, DEPBT 또는 EDC/HONB 시약 (1.30-2.00 mmol) 및 DIEA (2 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 여겨질 때까지, 혼합물을 실온에서 교반한다. 혼합물을 20 V의 15-20% 염수 용액으로 켄칭시킨 다음, 추가 10 V의 물을 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 서열식별번호:44를 회백색 고체로서 수득한다.
최종적으로, 17 V의 THF 중에서 서열식별번호:43의 용액 (1.00 mmol) 및 서열식별번호:44의 용액 (1.0 mmol)을 실온에서 DEPBT 시약 (1.30-2.00 mmol) 및 DIEA (1 mmol)를 사용하여 커플링시킨다. HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 여겨질 때까지, 혼합물을 실온에서 교반한다. 혼합물을 20 V의 물에 의해 켄칭시킨다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 물로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 백색 고체로서 수득한다. 생성된 펩티드를 출발 물질 g당 10 ml로 TFA:TIPS:DTT:물의 칵테일 (92.5:2.5:2.5:2.5)에 의해 탈보호시킨다. 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서 생성물을 칵테일 mL당 4 mL의 20% 헵탄/MTBE에 의해 침전시킨다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 3 x 10 V의 MTBE로 세척한다. 고체를 진공 건조기 (40℃)에서 건조시켜, 생성물을 회백색 고체로서 수득한다.
실시예 51: 서열식별번호:7의 대안적인 합성
표 30: 합성은 0.80 mmol/g의 로딩으로 Fmoc-시버 아미드 수지를 사용한다. 하기 변형과 함께 일반적인 SPPS 절차가 이용된다:
수지 결합된 서열식별번호:7 (54 g, ~24.0 mmol)을 2 x 300 mL (각각 30 분)의 20% Pip/DMF로 처리한다. 2) 6 x 300 mL의 DMF에 이어서, 5 x 300 mL의 DCM으로 세척한다. 3) 500 mL TFA/DCM (5/95, v/v)을 첨가하고, 2 시간 동안 교반한다. 4) 혼합물을 여과하고, 500 mL의 DCM으로 세척하여, 1000 mL의 총 여액 부피를 수득한다. 5) ~250 mL로 농축시킨다. 6) 250 mL MTBE를 충전한다. 7) 단계 5-6을 5-6 회 반복한다. 8) 여과하고, 습식 케이크를 수집하고, 33℃의 진공 오븐에서 밤새 건조시켜, 백색 고체의 서열식별번호:7 (18.3 g, 75% 수율)을 생성한다. UPLC를 이용하여 단리된 고체를 분석한다 (94.4 면적%). LC-MS ([M+H]+): 1020.58.
실시예 52: 서열식별번호:45 (화합물 48)의 합성
표 31: 합성은 0.80 mmol/g의 로딩으로 2-CTC 수지를 사용한다. 하기 변형과 함께 일반적인 SPPS 절차가 이용된다:
서열식별번호:45 부드러운 절단:
1) 수지 결합된 서열식별번호:45 (4.0 g, ~1.34 mmol)를 첨가하고, 40mL 절단 칵테일 TFA/DCM (1/99, v/v/v)을 충전한다. 2) 실온에서 10 분 동안 교반한다. 3) 여과하고, 여액을 수집한다. 4) 여액을 0.44mL 피리딘 (1/1, mol/mol)으로 중화시킨다. 5) 단계 1-4를 3회 더 반복한다. 6) 합한 여액을 농축 건조시킨다. 7) 슬러리를 10mL의 DMSO에 용해시킨다. 8) 교반하면서 DMSO 용액을 저온 100mL 물에 천천히 충전한다. 9) 여과하고, 침전물을 수집한다. 10) 50mL 물로 2 회 재슬러리화한다. 11) 밤새 진공 건조시켜, 백색 고체의 서열식별번호:45 (2.5 g, 58% 수율)를 생성한다. UPLC를 이용하여 단리된 고체를 분석한다 (95.0 면적%). LC-MS ([M+2H]2+/2): 1604.97.
실시예 53: 서열식별번호:10의 대안적인 합성
표 32: 합성은 0.80 mmol/g의 로딩으로 Fmoc-Leu-OH 2-CTC 수지를 사용한다. 하기 변형과 함께 일반적인 SPPS 절차가 이용된다:
부드러운 절단: 1) 수지 결합된 서열식별번호:10 (60 g, ~40 mmol)을 첨가하고, 600mL 절단 칵테일 TFA/DCM (1/99, v/v/v)을 첨가한다. 2) 실온에서 10 분 동안 교반한다. 3) 여과하고, 여액을 수집한다. 4) 여액을 6.6mL 피리딘 (1/1, mol/mol)으로 중화시킨다. 5) 단계 1-4를 3회 더 반복한다. 6) 합한 여액을 농축 건조시킨다. 7) 슬러리를 60mL의 DMSO에 용해시킨다. 8) 교반하면서 DMSO 용액을 저온 600mL 물에 천천히 충전한다. 9) 여과하고, 침전물을 수집한다. 10) 300mL 물로 2회 재슬러리화시킨다. 11) 밤새 진공 건조시켜, 서열식별번호:10 (56.4 g, 125% 수율)을 습식 고체로서 생성한다. UPLC를 이용하여 단리된 고체를 분석한다 (93.1 면적%). LC-MS ([M+H]+): 2341.52.
실시예 54: LPPS에 의한 서열식별번호:46 (화합물 49)의 합성:
20 mL 유리 섬광 바이알에, 서열식별번호:7(250 mg, 77.9 μmol), 서열식별번호:45 (103 mg, 90.7 μmol), 및 DMSO (5 mL)를 첨가한다. 이 용액에 DIEA (81 μL, 0.47 mmol)를 첨가한 후, PyAOP (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트) (100 mg, 192 μmol)를 첨가한다. 반응을 4 시간 동안 교반한 다음, 35mL 냉수를 천천히 첨가한다. 침전된 생성물을 여과에 의해 수집하고, 후속적으로 물 (2 x 35 mL)로 세척한다. 습식 케이크를 진공하에 건조시켜, 서열식별번호:46 (화합물 49)을 백색 고체로서 수득한다 (199mg, 61% 수율). UPLC: 46.2 면적%.
실시예 55: LPPS에 의한 서열식별번호:47 (화합물 50)의 합성:
20 mL 유리 섬광 바이알에, 서열식별번호:46 (500 mg, 120 μmol)에 이어서, 2mL MeCN (2 mL)을 첨가한다. Et2NH (0.5 mL, 4.8 mmol)를 충전하고, 4 시간 동안 교반한다. 용액을 농축 건조시킨다. 5mL MeCN을 충전하고, 다시 농축 건조시킨다. MeCN 첨가 및 건조를 2-3 회 더 반복한다. 1mL의 MeCN을 충전하여, 슬러리를 용해시킨 다음, 교반하면서 반응 용액을 15mL 저온 MTBE에 천천히 충전한다. 여과하고, 침전물을 수집하고, 10mL MTBE로 2회 재슬러리화한다. 습식 케이크를 진공하에 건조시켜, 서열식별번호:47 (화합물 50)을 백색 고체로서 수득한다 (200 mg, 42% 수율). UPLC: 75.3 면적%. LC-MS [M+3H]3+/3: 1331.60.
실시예 56: LPPS에 의한 서열식별번호:48 (화합물 51)의 합성:
20 mL 유리 섬광 바이알에, 서열식별번호:10 (75 mg, 32.1 μmol), 서열식별번호:47 (100 mg, 25.0 μmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt; 5 mg, 36.8 μmol), 및 DMSO (2 mL)를 첨가한다. 이 용액에 DIEA (30 μL, 173 μmol)를 첨가한 후, PyAOP (33 mg, 63 μmol)를 첨가한다. 반응을 5 시간 동안 교반한 다음, 15mL 냉수를 천천히 첨가한다. 침전된 생성물을 여과에 의해 수집하고, 후속적으로 물 (3 x 10 mL)로 세척한다. 습식 케이크를 진공하에 건조시켜, 서열식별번호:48 (화합물 51)을 백색 고체로서 수득한다 (120mg, 76% 수율). UPLC: 53.6 면적%.
실시예 57: 전체 탈보호에 의한 서열식별번호:6의 합성
1mL 절단 칵테일 용액 TFA/H2O/TIPS/DTT (0.925/0.025/0.025/0.025, v/v/v/v)을 충전한 다음, 서열식별번호:48의 샘플 (76 mg, 12.0 μmol)을 이 혼합물에 첨가하여 용액을 제공한다. 혼합물을 대략 주위 온도에서 약 3 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 -15℃ MTBE (10 mL)에 붓고, 생성된 현탁액을 약 30 분 동안 교반한다. 여과기를 통해 여과하고, 습식 케이크를 MTBE (2X10 mL)로 세척한다. 습식 케이크를 35℃에서 진공하에 건조시켜, 서열식별번호:6 (80 mg, 44.8 면적%, 140% 조 수율)을 습식 고체로서 수득한다. UPLC: 44.8 면적%. LC-MS [M+3H]3+/3: 1183.20.
실시예 58: 서열식별번호:11의 대안적인 합성
표 33: 합성은 0.835 mmol/g의 로딩으로 Fmoc-Gly-CTC 수지를 사용한다. 하기 변형과 함께 일반적인 SPPS 절차가 이용된다.
부드러운 절단: 1) 수지 결합된 서열식별번호:11 (10.0 g, ~4.4 mmol)을 첨가하고, 100mL 절단 칵테일 TFA/DCM (1/99, v/v)을 충전한다. 2) 실온에서 10 분 동안 교반한다. 3) 여과하고, 여액을 수집한다. 4) 여액을 1.1mL 피리딘 (1/1, mol/mol)으로 중화시킨다. 5) 단계 1-4를 3회 더 반복한다. 6) 합한 여액을 농축 건조시킨다. 7) 슬러리를 20mL의 DMSO로 용해시킨다. 8) 교반하면서 DMSO 용액을 저온 100mL 물에 천천히 충전한다. 9) 여과하고, 침전물을 수집한다. 10) 100mL 물로 2회 재슬러리화시킨다. 11) 밤새 진공 건조시켜, 백색 고체의 서열식별번호:11 (4.01 g, 62% 수율)을 수득한다. UPLC를 이용하여 단리된 고체를 분석한다 (97.6 면적%). LC-MS [M+H]+: 1445.78.
실시예 59: 서열식별번호:18의 대안적인 합성
표 34: 합성은 0.71 mmol/g의 로딩으로 Fmoc-시버 아미드 수지를 사용한다. 하기 변형과 함께 일반적인 SPPS 절차가 이용된다:
부드러운 절단: 1) 최종 2 x 30 분 De-Fmoc 주기 후에, 수지 결합된 서열식별번호:18 (8.2 g, ~ 3.1 mmol)을 40mL 절단 칵테일 TFA/HFIP/DCM (1/25/74, v/v/v)에 첨가하고, 이를 25℃에서 5 분 동안 교반한다. 2) 여과하고, 여액을 수집하고, 여액을 0.44mL 피리딘 (1/1, mol/mol)으로 중화시킨다. 3) 절단 과정을 2회 더 반복한다. 4) 합한 여액을 농축 건조시킨다. 5) 슬러리를 10mL의 DMSO에 용해시키고, 교반하면서 DMSO 용액을 200mL MTBE에 천천히 충전한다. 6) 여과하고, 침전물을 수집한다. 7) 40mL MTBE로 2회 더 재슬러리화시키고, 침전물을 여과한다. 8) 조 물질을 진공에서 밤새 건조시켜, 2.76 그램의 조 물질 (41.4% 수율)을 HPLC에 의해 92.5% 순도로 수득한다. LC-MS [M+2H]2+/2: 1113.90.
실시예 60: 서열식별번호:20의 대안적인 합성
표 35: 합성은 0.80 mmol/g의 로딩으로 2-CTC 수지를 사용한다. 하기 변형과 함께 일반적인 SPPS 절차가 이용된다.
부드러운 절단: 1) 수지 결합된 서열식별번호:20 (5.7 g, ~10 mmol)을 첨가하고, 60mL 절단 칵테일 TFA/DCM (1/99, v/v/v)을 충전한다. 2) 실온에서 10 분 동안 교반한다. 3) 여과하고, 여액을 수집한다. 4) 여액을 6.6mL 피리딘 (1/1, mol/mol)으로 중화시킨다. 5) 단계 1-4를 3회 더 반복한다. 6) 합한 여액을 농축 건조시킨다. 7) 슬러리를 30mL의 DMSO에 용해시킨다. 8) 교반하면서 DMSO 용액을 저온 300mL 물에 천천히 충전한다. 9) 여과하고, 침전물을 수집한다. 10) 200mL 물로 2회 재슬러리화시킨다. 11) 밤새 진공 건조시켜, 백색 고체의 서열식별번호:20 (4.5 g, 63.4% 수율)을 생성한다. UPLC를 이용하여 단리된 고체를 분석한다 (99.4 면적%). LC-MS [M+2H]2+/2: 2053.39.
실시예 61: LPPS에 의한 서열식별번호:49 (화합물 52)의 합성:
20 mL 유리 섬광 바이알에, 서열식별번호:11 (1.0 eq, 145mg), 서열식별번호:7 (1.1 eq, 125mg), 및 DMSO/MeCN (5 mL, 4/1, v/v)을 충전하여, 모든 물질을 용해시킨다. DIEA (3.0 eq, 0.055mL)를 반응 혼합물에 첨가한 후, PyOxim (1.5 eq, 80mg)을 첨가한다. 반응을 4 시간 동안 교반한 다음, 교반하면서 40ml의 물을 천천히 첨가한다. 침전된 생성물을 여과에 의해 수집하고, 후속적으로 물 (2 x 40 mL)로 세척한다. 습식 케이크를 진공하에 건조시켜, 조 고체를 서열식별번호:49를 백색 고체로서 (180mg, 73.2% 수율) HPLC에 의해 89.5% 순도로 수득한다. LC-MS [M+2H]2+/2: 1225.2.
실시예 62: LPPS에 의한 서열식별번호:18의 합성:
20 mL 유리 섬광 바이알에, 서열식별번호:49 (700 mg)를 첨가한 후, 8mL DMSO (2 mL)를 첨가한다. Et2NH (2.0 mL)를 충전하고, 4 시간 동안 교반한다. 용액을 농축 건조시킨다. 교반하면서 60mL 저온 MTBE를 충전한다. 여과하고, 침전물을 수집하고, 60mL MTBE로 2회 재슬러리화시킨다. 습식 케이크를 진공하에 건조시켜, 서열식별번호:18을 백색 고체로서 (520 mg, 82% 수율) HPLC에 의해 82.3% 순도로 수득한다. LC-MS [M+2H]2+/2: 1113.8.
실시예 63: LPPS에 의한 서열식별번호:48의 합성:
20 mL 유리 섬광 바이알에, 서열식별번호:20 (1.0 eq, 84mg), 서열식별번호:18 (1.1 eq, 50mg), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt; 1.0 eq, 3 mg), 및 DMSO (2 mL)를 첨가하여, 모든 물질을 용해시킨다. DIEA (6 eq, 21 μL)를 이 용액에 첨가한 후, PyAOP (2.5 eq, 22mg)를 첨가하고, 6 시간 동안 혼합한다. 추가의 PyAOP (1.0 eq, 9mg) 및 DIEA (2.5 eq, 9 μL)를 충전하고, 12 시간 동안 혼합한다. 추가의 PyAOP (1.0 eq, 9mg) 및 DIEA (2.5 eq, 9 μL)를 충전하고, 6 시간 동안 혼합한다. 교반하면서 반응 용액을 냉수에 천천히 충전한다. 침전된 생성물을 여과에 의해 수집하고, 후속적으로 물로 3회 (3x10ml) 세척한다. 생성물을 진공하에 건조시켜, 백색 고체 서열식별번호:48 (90mg, 69.8% 수율)을 수득한다. UPLC: 81.9 면적%.
실시예 64: 서열식별번호:48의 전체 탈보호에 의한 서열식별번호:6의 생성
전체 탈보호는 하기 절차를 이용하여 수행한다: 1) 4mL 절단 칵테일 TFA/H2O/TIPS/DTT (0.925/0.025/0.025/0.025)을 R1에 충전한 후, 서열식별번호:48 (180 mg)을 충전한다. 2) 이를 20-30℃에서 3 시간 동안 교반한다. 3) 용액을 냉각된 MTBE (30mL)에 붓는다. 현탁액을 0.5 시간 동안 교반한다. 4) 여과기를 통해 여과한 후, MTBE 세척 (30mL)을 2회 수행한다. 5) 습식 케이크를 감압하에 일정한 중량이 될 때까지 건조시킨다. 6) 180mg의 건조된 조 물질을 HPLC에 의해 66.3% 순도로 수득한다.
실시예 65: 천연 화학적 라이게이션
수지 화합물 53의 합성:
Fmoc-히드라진-2-클로로트리틸 수지 (30.06 g, 25.5 mmol)를 300 mL DCM 중에서 15 분 동안 팽윤시킨다. 이를 2 x 400 mL DMF로 각각 15 분 동안 팽윤시킨다. Fmoc 탈보호는 3 x 400 mL 20% 피페리딘/DMF에 의해 각각 30 분 동안 수행한다. 이어서, 수지를 5 x 400 mL DMF로 세척한다. Fmoc-L-Lys(alloc)-OH (34.63 g, 76.5 mmol, 3.0 당량) 및 HBTU (29.17 g, 76.9 mmol, 3.02 당량)를 400 mL의 DMF에 용해시킨다. N,N-디이소프로필에틸아민 (27 mL, 155 mmol, 6.08 당량)을 아미노산 용액에 첨가한다. 이어서, 용액을 수지 제조물 XX에 첨가하고, 6 시간 동안 교반한다. 수지를 5 x 400 mL DMF에 이어서, 5 x 300 mL DCM으로 세척하고, 수지를 35℃에서 진공 오븐에서 약 16 시간 동안 건조시킨다. 수지 로딩은 정량적인 NMR에 의해 0.52 mmol/g인 것으로 결정된다.
실시예 66: 펩티드 히드라지드 서열식별번호:50 (화합물 54)의 합성
약 12.19 g의 수지 화합물 53 (5.4 mmol, 로딩 값: 0.44 mmol/g)을 3 x 120 mL DMF로 각각 15 분 동안 팽윤시킨다. 펩티드 히드라지드 (서열식별번호:50)를 이전에 기재된 바와 같이 표준 SPPS를 이용하여 합성한다.
탈보호: 4 x 100 mL의 DMF 중 20% v/v 피페리딘, 각각 20 분.
커플링: 3 당량의 아미노산, 3 당량의 옥시마 및 3.3 당량의 DIC가 아미노산 커플링을 위해 사용된다.
SPPS 동안에, 각각의 커플링 및 fmoc 탈보호의 최종 반복 후에 수지를 5 분 N2 혼합하면서 5 x 120 mL DMF로 세척한다.
펩티드 히드라지드 합성 마지막에, 수지를 N2 혼합하면서 DCM으로 세척한다. 수지를 펩티드 합성기 상에서 건조시킨다.
Alloc 탈보호 및 측쇄 커플링:
수지를 5 분 교반하면서 5 x 120 mL DCM으로 세척한다. 팔라듐 테트라키스 (500 mg, 0.43 mmol, 0.1 당량) 및 페닐실란 (0.7 mL, 5.7 mmol, 1.02 당량)의 용액을 75 mL DCM 중에서 제조한다. 이를 수지에 첨가하고, 20 분 동안 교반한다. 이를 5 x 120 mL DCM으로 세척하고, 각각 5 분 동안 교반한다. Pd(PPh3)4 및 PhSiH3에 의한 alloc 탈보호를 2회 반복한다.
수지를 5 x 120 mL DMF로 세척하고, 각각 5 분 동안 교반한다. TNTU (3.95 g, 10.82 mmol, 2 당량)를 (S)-13-(tert-부톡시카르보닐)-36,36-디메틸-10,15,34-트리옥소-3,6,35-트리옥사-9,14-디아자헵타트리아콘탄산 (화합물 25, 27 mL, 0.29 g/mL, 7.873 g, 10.8 mmol, 2 당량)의 DMF 용액에 용해시키고, 이 용액을 DMF에 의해 75 mL까지 만든다. 3.8 mL의 N,N-디이소프로필에틸아민 (3.8 mL, 21.82 mmol, 4.0 mmol)을 화합물 25의 용액에 첨가하고, 10 분 동안 교반한다. 이어서, 이를 수지에 첨가하고, 14 시간 동안 교반한다. 이어서, 수지를 5 x 120 mL DMF (5 분 교반) 및 5 x 120 mL DCM (5 분 교반)으로 세척한다. 수지를 진공 오븐에서 35℃에서 약 16 시간 동안 건조시킨다.
전체 탈보호 및 절단:
2.5% w/v 디티오트레이톨 (DTT), 2.5% v/v 물, 2.5% v/v 트리이소프로필실란 (TIPS) 및 92.5% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 제조된 250 mL의 절단 칵테일을 500 mL 3구 둥근 바닥 플라스크에서 건조된 수지 (22.2 g)에 첨가하고, 약 2.5 시간 동안 교반한다. 수지를 여과하고, 2 x 7.5 mL TFA로 세척한다. 여액을 1.40 L 저온 MTBE에 붓고, 펩티드가 즉시 침전된다. 여과 플라스크를 2 x 5 mL TFA로 세척하고, 저온 MTBE에 붓는다. 이를 30 분 동안 -20℃로 냉각시킨 다음, 원심분리한다. 이어서, 펩티드 침전물을 300 mL MTBE로 2회 세척하고, 원심분리한다. 펩티드 침전물을 27℃의 진공 오븐에서 약 16 시간 동안 건조시킨다. 약 9.9 g의 조 서열식별번호:50이 건조시킨 후에 수득된다.
실시예 67: 티오에스테르 서열식별번호:51 (화합물 55)의 합성:
조 펩티드 히드라지드 (서열식별번호:50, 3.65 g, 1.41 mmol)를 250 mL의 라이게이션 완충제 (6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.1 M 인산수소나트륨 일염기성, pH 약 7.0)에 용해시킨다. pH를 5 N HCl 용액에 의해 약 3.3으로 조정하고, 용액을 아세톤-얼음 조에서 -15℃로 냉각시킨다. 2.5 mL의 4.31 M 아질산나트륨 용액 (742.7 mg, 10.8 mmol, 7.6 당량)을 펩티드 히드라지드 용액에 첨가하고, -15℃에서 15 분 동안 교반한다. 그 동안에, 4-머캅토페놀 (1.052 g, 8.34 mmol)을 3 mL의 라이게이션 완충제에 현탁시키고, pH를 5 N NaOH 용액에 의해 약 7.0으로 조정하고, 라이게이션 완충제 (6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.1 M 인산수소나트륨 일염기성, pH 약 7.0)에 의해 10 mL까지 만든다. 15 분 후, 7.5 mL의 4-머캅토페놀을 펩티드 히드라지드 용액에 첨가하여, 서열식별번호:50으로부터 생성된 펩티딜 아지드를 동일계 내에서 티올 분해시킨다.
반응 혼합물의 pH를 5 N 수산화나트륨 용액에 의해 약 6.5로 조정한다. 펩티딜 아지드를 15 분 동안 티올 분해시키고, 조 티오에스테르 혼합물을 정제하는 내내 일정한 5% 아세트산암모늄하에 주위 온도에서 처음 3 분 동안 물 중 10% 아세토니트릴 및 3 분 내지 5 분에 물 중 10-30% 아세토니트릴 이후 25 분에 걸쳐 물 중 30-55% 아세토니트릴의 선형 구배를 이용하여 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18 10 μm 컬럼 (30 mm x 250 mm) 상에서 RP-HPLC에 의해 정제한다. 이를 통해 약 0.415 g의 펩티드 티오에스테르 (서열식별번호:51)가 수득된다 [예측치 (질량+2H+)/2 = 1342.7052, 실측치 (질량+2H+)/2 = 1342.6958].
실시예 68: 서열식별번호:53을 합성하기 위한 천연 화학적 라이게이션
6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.1 M 인산수소나트륨 일염기성 (pH 약 7.0)의 수성 용액은 천연 화학적 라이게이션에서 사용된 라이게이션 완충제이다. 완충제를 15 분 동안 질소 기체에 의해 탈기시킨다. 4-머캅토페놀 (193 mg, 1.5 mmol, 10 당량), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP, 656.6 mg, 2.3 mmol, 15.3 당량) 및 아스코르브산 (269 mg, 1.5 mmol, 10 당량)을 3구-둥근 바닥 플라스크에 넣는다. 플라스크를 질소 기체하에 둔다. 41 mL의 라이게이션 완충제를 첨가하여 둥근 바닥 플라스크에서 시약을 용해시킨다. 용액의 pH를 5 N NaOH 용액에 의해 약 7.0으로 조정한다. 펩티드 티오에스테르 서열식별번호:51 ((406.8 mg, 0.15 mmol) 및 N-말단 시스테인 단편 서열식별번호 52 (화합물 56) (326.5 mg, 0.15 mmol, 1 당량)를 상기 용액에 첨가한다. pH를 5 N NaOH 용액에 의해 약 7.0으로 조정한다. 반응 혼합물을 질소하에 약 10 시간 동안 교반한다. 대부분의 티오에스테르 서열식별번호:51이 소모되며, 따라서 반응 혼합물을 -20℃의 냉동고에서 약 14 시간 동안 교반한다. 서열식별번호:53을 정제하는 내내 일정한 5% 아세트산암모늄하에 주위 온도에서 처음 3 분 동안 물 중 20% 아세토니트릴 및 3 분 내지 5 분에 물 중 20-30% 아세토니트릴 이후 25 분에 걸쳐 물 중 30-50% 아세토니트릴의 선형 구배를 이용하여 페노메넥스 루나 C18 10 μm 컬럼 (30 mm x 250 mm) 상에서 RP-HPLC에 의해 정제한다. 이를 통해 약 0.52 g의 시스테인 유사체 서열식별번호:53이 수득된다 [예측치 (질량+3H+)/3 = 1587.8219, 실측치 (질량+3H+)/3 = 1587.8198].
광탈황화: 3 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.1 M 인산수소나트륨 일염기성 (pH 약 7.0)의 수성 완충제를 신선하게 제조한다. 7.64 mM 트리스(2,2'-비피리딜)디클로로루테늄(II) 육수화물 (2.86 mg, 0.004 mmol)의 0.5 mL 용액을 완충제 중에서 제조한다. 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP, 64.3 mg, 0.22 mmol)을 완충제에 현탁시키고, pH를 5 N NaOH 용액에 의해 약 7.0으로 조정한다. 이를 완충제에 의해 2 mL로 희석한다. 서열식별번호:53 (10 mg, 0.0021 mmol)을 7 mL 섬광 바이알에서 4 mL의 완충제에 용해시킨다. 트리페닐포스핀-3,3',3"-트리술폰산 삼나트륨 염 (TPPTS, 231.2 mg, 0.41 mmol, 194 당량) 및 2-머캅토에탄술폰산 나트륨 염 (MESNa, 32.6 mg, 0.20 mmol, 95 당량)을 서열식별번호:6의 용액에 첨가한다. 28 μL의 트리스(2,2'-비피리딜)디클로로루테늄(II) 육수화물 (0.00021 mmol, 0.1 당량) 및 20 μL의 TCEP 용액 (0.0022 mol, 1.0 당량)을 반응 혼합물에 첨가한다. 바이알을 펜(Penn) 광학 코팅 광반응기 m1에 넣고, 91% LED 강도하에 459 RPM에서 교반한다. 팬을 3564 RPM에서 작동시켜 반응 혼합물의 가열을 방지한다. 약 3.5 시간 후에, TCEP (0.40 mg, 0.7 당량)를 추가로 첨가하고, 반응 혼합물을 광반응기에서 16 시간 동안 교반한다. 16 시간 후에, 반응을 완료하고, 95% 초과의 서열식별번호:53이 서열식별번호:6으로 전환된다.
무금속 탈황화: 6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.1 M 인산수소나트륨 일염기성 (pH 7.0)의 수성 용액은 이 반응에서 사용된 완충제이다. 완충제를 1 시간 넘게 질소 기체에 의해 철저하게 퍼징한다. 서열식별번호:53 (40.3 mg, 0.0085 mmol), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로클로라이드 (27.7 mg, 0.0857 mmol, 10.1 당량), 환원된 L-글루타티온 (L-GSH, 25.9 mg, 0.0843 mmol, 10 당량) 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP, 36.5 mg, 0.1273 mmol, 15.0 당량)을 4 mL의 완충제에 용해시킨다. 반응 혼합물을 질소 기체에 의해 약 2 분 동안 다시 탈기시키고, pH를 5 N NaOH에 의해 약 7.0으로 조정한다. 용액을 질소하에 45℃에서 12 시간 동안 교반한 다음, 실온에서 8 시간 동안 교반한다. 20 시간 후에, 대부분의 서열식별번호:53이 서열식별번호:6으로 전환된다. [예측치 (질량+3H+)/3 = 1604.5153, 실측치 (질량+3H+)/3 = 1577.1581].
실시예 69: 서열식별번호 52 및 54를 사용하고 시스테이닐프롤릴 에스테르 (CPE)를 사용하여 천연 화학적 라이게이션 (NCL)에 의한 서열식별번호:53 (화합물 57)의 합성
3M 완충제 용액: 구아니딘 히드로클로라이드 (2.86 g, 30.0 mmol), 인산이수소나트륨 (0.24 g, 2.0 mmol) 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 [TCEP] (0.0166 g, 0.0579 mmol)를 15 mL 원심분리 튜브에 칭량하고, 탈이온수에 용해시키고, 대략 9.5 mL까지 만든다. 완충제 용액의 pH를 필요에 따라 5N NaOH에 의해 ~8.3으로 조정한다. pH가 초과하는 경우, 1N HCl을 첨가하여 ~8.3으로 다시 조정한다.
라이게이션에 대한 일반적인 절차:
1mL의 완충제 용액을 사전 칭량된 서열식별번호:54 [CPE-펩티드 유사체] (0.01 g, 0.003 mmol, 94.69 질량%) 및 서열식별번호:52 [Cys-펩티드] (0.0073 g, 0.0032 mmol, 96.9 질량%)를 함유하는 5 mL 섬광 바이알에 첨가한다. 펩티드 단편을 초음파 처리에 의해 3M 완충제 용액에 완전히 용해시킨다. 용액의 pH를 기록하고, 5N NaOH를 첨가하여 pH ~8.30으로 다시 조정한다. pH가 초과하는 경우, 1N HCl을 첨가하여 pH ~8.3으로 다시 조정한다. 이어서, 용액을 HPLC 바이알로 옮기고, 샘플을 상이한 시점에 엘티보(ELTIVO)에 의해 37℃에서 (32℃ 내부 온도) 모니터링한다. 서열식별번호:53 유사체로의 완전한 전환 (Q-Tof에 의해 69%까지)은 일반적으로 18 시간 후에 관찰된다.
5M 완충제 용액: 구아니딘 히드로클로라이드 (4.78 g, 50.0 mmol), 인산이수소나트륨 (0.24 g, 2.0 mmol) 및 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 [TCEP] (0.0166 g, 0.0579 mmol)를 15 mL 원심분리 튜브에 칭량하고, 탈이온수에 용해시키고, 대략 9.5 mL까지 만든다. 완충제 용액의 pH를 필요에 따라 5N NaOH를 첨가하여 ~8.3으로 다시 조정한다. pH가 초과하는 경우, 1N HCl을 첨가하여 ~8.3으로 다시 조정한다.
라이게이션에 대한 일반적인 절차:
3mL의 완충제 용액을 사전 칭량된 서열식별번호:54 [CPE-펩티드 유사체] (0.01 g, 0.003 mmol, 94.69 질량%) 및 서열식별번호:52 [Cys-펩티드] (0.0073 g, 0.0032 mmol, 96.9 질량%)를 함유하는 5 mL 섬광 바이알에 첨가한다. 펩티드 단편을 초음파 처리에 의해 5M 완충제 용액에 완전히 용해시킨다. 용액의 pH를 기록하고, 5N NaOH를 첨가하여 pH ~8.30으로 다시 조정한다. pH가 초과하는 경우, 1N HCl을 첨가하여 pH ~8.3으로 다시 조정한다. 이어서, 티올 [예컨대; MeSNa, 티오페놀, 히드록시티오페놀] (5 당량)을 반응 용액에 첨가한다. pH를 다시 모니터링하고, 필요에 따라 1N NaOH 또는 1N HCl을 사용하여 pH ~8.3으로 추가로 조정한다. 이어서, 용액을 HPLC 바이알로 옮기고, 샘플을 상이한 시점에서 HPLC에 의해 37℃에서 (32℃ 내부 온도) 모니터링한다. 서열식별번호:53으로의 완전한 전환은 일반적으로 대략 17 시간 후에 관찰된다 (HPLC에 의해).
실시예 70: Fmoc-L-Pro-글리콜산-L-Val-OH (화합물 58)의 합성
단계 1 (Fmoc-L-Val-OH 커플링):
제1 커플링 전에, Fmoc-링크(Rink) 아미드 AM 수지 (0.74 g/mmol, 1.35 g, 1.00 mmol)를 반응 용기에 충전한다. 수지를 3 x 10 ml의 DMF로 각각 15 분 동안 팽윤시킨 다음, 3 x 10 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 각각 30 분 동안 탈보호시키고, 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다. 용액은 10 ml의 DMF 중 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-메틸-부탄산 (1.018 g, 3.00 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (0.74 g, 3.30 mmol, 60 질량%)로 제조된다. 이 용액에 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (0.52 mL, 3.30 mmol)를 첨가하고, 상응하는 용액을 팽윤된 수지를 함유하는 반응 용기에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 1 시간 동안 혼합한 다음, 액체를 배수시킨다. 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한 다음, 단계 2로 전달한다.
단계 2 (글리콜산 커플링):
단계 1로부터의 수지를 3 x 10 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)로 각각 30 분 동안 처리하여 Fmoc 기를 제거하고, 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다. 용액은 10 ml의 DMF 중 글리콜산 (228 mg, 3.00 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (353 mg, 2.31 mmol)로 제조된다. 이 용액에 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (0.52 mL, 3.30 mmol)를 첨가하고, 상응하는 용액을 각각의 반응기에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 5 시간 혼합한 다음, 액체를 배수시킨다. 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 1 분 동안 세척한 다음, 단계 3으로 전달한다.
단계 3 (Fmoc-L-Pro-OH 커플링):
용액은 10 ml의 DMF 중 (2R)-1-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐)피롤리딘-2-카르복실산 (1.012 g, 3.00 mmol), (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) (1.25 g, 3.30 mmol), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.87 mL, 5.00 mmol)으로 제조된다. 용액을 수분 동안 진탕시킨 다음, 수지를 함유하는 반응 용기로 옮긴다. 반응을 주위 온도에서 16 시간 혼합한 다음, 액체를 배수시킨다. 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 1 분 동안 및 5 x 10 ml의 디클로로메탄으로 2 분 동안 세척한 다음, 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 수지 상에서 1.719 g의 표제 화합물을 제공한다.
92.5% TFA, 2.5% 트리이소프로필실란, 2.5% 물, 및 2.5% 디티오트레이톨 (v/v/v/w)로 이루어진 2.0 mL의 용액에 의해 수지로부터 50 mg의 펩티드 샘플을 절단시킨다. 혼합물을 회전식 혼합기 상에서 1.5 시간 동안 진탕시키고, 16 ml의 80:20 DMSO/아세토니트릴 (v/v)로 희석하고, 여과하여, 수지를 제거한다. 여액을 LC/MS에 의해 분석하고, 75.5 면적%의 원하는 트리펩티드 및 16.8%의 다중 글리콜산 부가를 함유하는 생성물을 함유하는 것으로 나타났다.
실시예 71: Fmoc-L-Pro-글리콜산-L-Val-OH의 대안적인 합성
단계 1 (Fmoc-L-Val-OH 커플링):
제1 커플링 전에, 링크 아미드 AM 수지 (0.74 g/mmol, 1.35 g, 1.00 mmol)를 반응기 용기에 충전시킨다. 각각의 수지를 3 x 10 ml의 DMF로 각각 20 분 동안 팽윤시킨 다음, 3 x 10 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 각각 30 분 동안 탈보호시키고, 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다. 용액은 10 ml의 DMF 중 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-메틸-부탄산 (1.018 g, 3.00 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (353 mg, 2.31 mmol)로 제조된다. 이 용액에 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (517 μL, 3.30 mmol)를 첨가하고, 상응하는 용액을 팽윤된 수지를 함유하는 반응 용기에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 4 시간 동안 혼합한 다음, 배수시킨다. 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척하고, 다음 단계로 전달한다.
단계 2 (Fmoc-글리콜산 커플링):
3 x 10 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)로 각각 30 분 동안 처리하여 Fmoc 기를 제거하고, 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다. 용액은 10 ml의 DMF 중 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐옥시)아세트산 (894.9 mg, 3.00 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (353 mg, 2.31 mmol)로 제조된다. 이 용액에 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (517 μL, 3.30 mmol)를 첨가하고, 상응하는 용액을 수지를 함유하는 반응기에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 16 시간 동안 혼합하고, 액체를 배수시킨다. 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한 다음, 다음 단계로 전달한다.
단계 3 (Fmoc-L-Pro-OH 커플링):
3 x 10 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)로 각각 30 분 동안 처리하여 Fmoc 기를 제거하고, 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다. 용액은 10 ml의 DMF 중 (2S)-1-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐)피롤리딘-2-카르복실산 (1.012 g, 3.00 mmol), (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) (1.25 g, 3.30 mmol), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (870 μL, 5.00 mmol)으로 제조된다. 상응하는 용액을 수지를 함유하는 반응기에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 8 시간 동안 혼합한 다음, 배수시킨다. 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 및 5 x 10 ml의 디클로로메탄으로 1 분 동안 세척한 다음, 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 수지 상에서 1.622 g의 표제 화합물을 제공한다.
92.5% TFA, 2.5% 트리이소프로필실란, 2.5% 물, 및 2.5% 디티오트레이톨 (v/v/v/w)로 이루어진 2.0 mL의 용액에 의해 수지로부터 50 mg의 펩티드 샘플을 절단시킨다. 혼합물을 회전식 혼합기 상에서 1.5 시간 동안 진탕시키고, 16 ml의 80:20 DMSO/아세토니트릴 (v/v)로 희석하고, 여과하여, 수지를 제거한다. 여액을 LC/MS에 의해 분석하고, 검출가능한 다중 글리콜산 부가가 없는 84.93 면적%의 원하는 트리펩티드를 함유하는 것으로 나타났다.
실시예 72: 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐옥시)아세트산 (Fmoc-글리콜산) (화합물 59)의 합성
단계 1 (tert-부틸 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐옥시)아세테이트):
500 mL 둥근 바닥 플라스크 에서 120 ml의 디클로로메탄 중 tert-부틸 2-히드록시아세테이트 (10.00 g, 71.90 mmol, 95 질량%)의 기계적으로 교반된 용액에 피리딘 (60 mL, 742.0 mmol)을 한번에 첨가한다. 생성된 용액을 얼음 조에서 0-5℃로 냉각시킨다. 이 용액에 60 ml의 디클로로메탄 중 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (20.00 g, 77.30 mmol)의 용액을 적하 깔때기를 통해 30 분에 걸쳐 적가한다. 첨가가 완료될 때까지, 반응에서 침전물이 형성되었다. 얼음 조를 제거하고, 반응 혼합물을 주위 온도에서 18 시간 동안 교반한다. 추가로 교반하는 동안에 더 많은 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 감압하에 고체-오일 잔류물로 농축시켜, 대부분의 피리딘 및 디클로로메탄을 제거한 다음, 200 ml의 디클로로메탄에 다시 용해시킨다. 용액을 2 x 100 ml의 1M 수성 황산수소나트륨 용액에 이어서, 2 x 100 ml의 포화 염수 용액으로 세척한다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 점차적으로 고체화되는 27.13 그램의 황색 오일로 농축시킨다. 조 생성물을 정제하지 않고 다음 단계에 전달한다.
단계 2 (2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐옥시)아세트산):
단계 1로부터의 Tert-부틸 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐옥시)아세테이트 (26.0 g, 73.40 mmol)를 디클로로메탄 (200 mL)에 용해시킨다. 기계적으로 교반된 용액에 트리플루오로아세트산 (52 mL)에 이어서, 트리이소프로필실란 (13 mL)을 첨가한다. 생성된 용액을 주위 온도에서 3 시간 동안 교반한다. 용액을 감압하에 농축시켜, 디클로로메탄 및 거의 모든 트리플루오로아세트산을 제거한다. 생성된 점성의 잔기를 1000 mL의 5% 수성 중탄산나트륨 용액으로 점차적으로 처리하여, 발포를 방지하고, 수성 용액을 3 x 500 ml의 메틸 tert-부틸 에테르로 세척하여, 잔류 트리이소프로필실란을 제거한다. 수성 용액을 0-5℃로 냉각시키고, 300 ml의 에틸 아세테이트를 첨가한다. 2상 혼합물을 40% 수성 인산에 의해 ~ pH 2로 산성화시키고, 약 75 ml의 산이 필요하다. 층을 분리시킨 후, 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 감압하에 점성의 옅은 황색 오일로 농축시킨다. 오일을 냉동고에서 -20℃로 냉각시키고, 상기 물질이 백색 고체로 완전히 고체화된다. 고체를 75 ml의 저온 헵탄으로 연화처리하고, 초음파 처리 후에 균일한 백색 현탁액이 형성된다. 고체를 여과하고, 헵탄으로 세척하고, 진공 오븐에서 밤새 33℃에서 건조시켜, 15.21 g (2 단계에 걸쳐 69.5% 수율)의 백색 고체를 수득한다.
NMR (CDCl3)에 의해 원하는 생성물이 단리되었음을 확인하였다.
실시예 73: Fmoc-Lys(Mtt)-Cys(Trt)-OH (화합물 60)의 합성
단계 1
(2S)-6-[[디페닐(p-톨릴)메틸]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산 (A, 15 g, 24.01 mmol), N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 (7.45 g, 29.0 mmol, 99.6 질량%), 4-디메틸 아미노피리딘 [DMAP] (0.3 g, 2 mmol, 99 질량%)을 교반 막대를 구비한 250 mL 플라스크에 칭량한다. 이어서, 에틸 아세테이트 (225 mL, 2000 mmol, 100 질량%)를 첨가하고, 용액이 수득될 때까지 용액을 실온에서 (21-24℃) 혼합한다. 반응을 18 시간 동안 또는 LCMS / NMR에 의해 반응의 완료가 확인될 때까지 교반한다. 반응 혼합물을 분별 깔때기로 옮기고, 탈이온수 (60 mL x 3)로 세척하고, 유기 층을 회전식 증발기 상에서 농축 건조시켜, 단계 1의 조 화합물을 수득한다.
단계 2
N,N-디메틸포름아미드 (208 mL, 2690 mmol) 중 단계 1의 조 화합물 (17.33 g, 24.01 mmol)에 N,N-디이소프로필에틸아민 (5.03 mL, 28.8 mmol) 및 (2R)-2-아미노-3-트리틸술파닐-프로판산 (9.6 g, 26 mmol)을 첨가한다. 반응을 자성 교반을 이용하여 실온에서 (21-24℃) 18 시간 동안 또는 LCMS / NMR에 의해 반응의 완료가 확인될 때까지 교반한다. 반응 혼합물을 분별 깔때기로 옮기고, 10% 시트르산 (120 mL x 2)으로 세척하고, 디클로로메탄 (100 mL x 5)으로 추출한다. 유기 층을 탈이온수 (100 mL x 2)로 세척하고, 합한 유기 층을 회전식 증발기 상에서 48 - 50℃에서 농축 건조시켜, 과량의 용매를 제거한다. 조 화합물 60을 초음파 처리에 의해 아세토니트릴 (30 mL)에 용해시킨다. 조 화합물 60 용액을 교반하면서 저온 아세토니트릴: 탈이온수 (3:2, 700 mL)에 적가한다. 슬러리를 0℃에서 밤새 교반한다. 고체를 여과하고, 헥산 (70 mL)으로 세척하고, 40℃의 진공 오븐에서 건조시켜, 생성물 Fmoc-Lys(Mtt)-Cys(Trt)-OH (화합물 60) (21.0 g, Q-NMR에 의해 효능에 대해 보정된 76.8% 수율)를 수득한다.
실시예 74: Fmoc-L-Lys(mtt)-L-Cys(trt)-L-Pro-글리콜산-L-Val-OH (화합물 61)의 합성
커플링 반응 전에, 상기 실시예 73으로부터의 수지 상의 Fmoc-L-Pro-글리콜산-L-Val-OH (1.719 g, 1.00 mmol)를 3 x 15 ml의 DMF로 각각 20 분 동안 팽윤시킨 다음, 4 x 15 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 각각 30 분 동안 탈보호시키고, 5 x 15 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다. 용액은 10 ml의 DMF 중 (2R)-2-[[(2S)-6-[[디페닐(p-톨릴)메틸]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-3-트리틸술파닐-프로판산 (2.28 g, 2.00 mmol, 85.24 질량%), 히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt) (0.375 g, 2.30 mmol, 95 질량%), 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (0.41 ml, 2.60 mmol)로 제조된다. 상응하는 용액을 수지를 함유하는 반응기에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 12 시간 동안 혼합하고, 액체를 배수시킨다. 수지를 5 x 15 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 및 5 x 15 ml의 디클로로메탄으로 1 분 동안 세척한 다음, 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 수지 상에서 1.973 g의 표제 화합물을 수득한다.
92.5% TFA, 2.5% 트리이소프로필실란, 2.5% 물, 및 2.5% 디티오트레이톨 (v/v/v/w)로 이루어진 2.0 mL의 용액에 의해 수지로부터 50 mg의 펩티드 샘플을 절단시킨다. 혼합물을 회전식 혼합기 상에서 1.5 시간 동안 진탕시키고, 16 ml의 80:20 DMSO/아세토니트릴 (v/v)로 희석하고, 여과하여, 수지를 제거한다. 여액을 LC/MS에 의해 분석하고, 2.91 면적%의 des-프롤린 및 3.83%의 des-발린과 함께 81.93 면적%의 원하는 펜타펩티드를 함유하는 것으로 나타났다.
실시예 75: Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-OH (서열식별번호:55)의 합성
표제 화합물은 하기 기재된 바와 같이 표준 고체상 합성 조건 (Fmoc-보호된 아미노산/에틸 시아노글리옥실레이트-2-옥심 (옥시마)/N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여 제조된다.
용매 및 시약 제조:
20 L의 DMF를 용매 저장기에 충전한다. 5 L의 20% 피페리딘/DMF (v/v) 용액을 탈보호 저장기에 충전한다. 600 mL의 0.660 M DIC 용액을 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (49.98 g, 396.0 mmol) 및 DMF를 사용하여 제조하고, DIC/용매 저장기에 충전한다. 500 ml의 0.750 M 옥시마 용액을 에틸 시아노글리옥실레이트-2-옥심 (53.29 g, 371.2 mmol) 및 DMF를 사용하여 제조하고, 옥시마/용매 저장기에 충전한다. 시버 수지 (0.71 mmol/g, 14.09 g, 10.00 mmol)를 반응기에 충전한다. 하기 나타낸 합성 단계를 시작하기 전에, 수지를 3 x 180 ml의 DMF로 각각 20 분 동안 팽윤시키고, 3 x 180 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 각각 30 분 동안 Fmoc 기를 제거한다.
아미노산 용액 제조:
100 mL의 0.375 M FmocNH-L-Ala-OH 용액을 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로판산 (11.68 g, 37.52 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다. 200 mL의 0.375 M FmocNH-Gly-OH 용액을 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (22.30 g, 75.01 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다. 360 mL의 0.375 M FmocNH-L-Pro-OH 용액을 (2S)-1-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐)피롤리딘-2-카르복실산 (45.54 g, 135.0 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다. 280 mL의 0.375 M FmocNH-L-Ser(tBu)-OH 용액을 (2S)-3-tert-부톡시-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로판산 (40.25 g, 105.0 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
커플링 조건:
Pro: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 6 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 2 분 DMF 세척.
Ala (Pro 이후), Gly (Pro 이후): 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 4 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 2 분 DMF 세척.
다른 모든 커플링: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 4 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의한 3 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 2 분 DMF 세척.
합성 마지막에, 수지를 5 x 180 ml의 DMF로 각각 2 분 동안, 이어서 5 x 180 ml의 MTBE로 각각 2 분 동안 세척한다. 수지를 반응기로부터 제거하고, 무게를 잰 결정화 접시로 옮기고, 진공하에 40℃에서 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 수지 상에서 25.15 g의 표제 화합물을 수득한다. 수지 출발 물질의 질량을 기반으로 하여, 펩티드의 수율은 11.07 g (89%)이다.
수지를 3 x 6 ml의 DMF로 10 분 동안 팽윤시키고, 3 x 6 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)로 각각 30 분 동안 처리하고, 5 x 6 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척하고, 5 x 6 ml의 디클로로메탄으로 각각 1 분 동안 세척하고, 일정한 중량이 될 때까지 건조시킴으로써, 수지 상에서 251 mg 펩티드 샘플로부터 Fmoc 기를 제거한다.
탈보호된 생성물 샘플을 회전식 혼합기 상에서 20 ml 섬광 바이알에서 5 mL의 TFA/TIS/H2O/DTT ([0.925v:0.025v:0.025v]:0.025w) 용액과 함께 2 시간 동안 혼합함으로써 수지로부터 절단시킨다. 수지를 여과하고, 수지 습식 케이크를 2 mL의 순수한 TFA로 세척한다.
생성된 조 펩티드를 35 mL의 저온 MTBE에 의해 침전시키고, 원심분리하고, 2 x 35 ml의 MTBE로 세척하고, 진공하에 밤새 33℃에서 건조시켜, 105.1 mg (94.9%)의 완전히 탈보호된 펩티드를 수득한다. UPLC에 의해 분석하여, 98.62 면적%의 순도를 나타내었으며, 0.30 면적%를 넘는 관련 물질은 없었다. 수지 상에 펩티드의 로딩은 0.37 mmol/g으로 측정되고, 이론적 로딩은 0.37 mmol/g이다.
실시예 75: H-Cys-Gln-Aib-Phe-Ile-Glu-Tyr-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH
2
서열식별번호:52 (화합물 62)의 합성
표제 화합물은 하기 기재된 바와 같이 표준 고체상 합성 조건 (Fmoc-보호된 아미노산/에틸 시아노글리옥실레이트-2-옥심 (옥시마)/N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여 제조된다.
용매 및 시약 제조:
40 L의 DMF를 용매 저장기에 충전한다. 4 L의 20% 피페리딘/DMF (v/v) 용액을 탈보호 저장기에 충전한다. 600 mL의 0.660 M DIC 용액을 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (49.98 g, 396.0 mmol) 및 DMF를 사용하여 제조하고, DIC/용매 저장기에 충전한다. 500 ml의 0.750 M 옥시마 용액을 에틸 시아노글리옥실레이트-2-옥심 (53.29 g, 371.2 mmol) 및 DMF를 사용하여 제조하고, 옥시마/용매 저장기에 충전한다. 시버 수지 상의 9H-플루오렌-9-일메틸 N-[2-[(2S)-2-[[(1S)-2-[[(1S)-2-[[2-[[(1S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[[(1S)-2-아미노-1-(tert-부톡시메틸)-2-옥소-에틸]카르바모일]피롤리딘-1-카르보닐]피롤리딘-1-카르보닐]피롤리딘-1-일]-1-메틸-2-옥소-에틸]아미노]-2-옥소-에틸]아미노]-1-(tert-부톡시메틸)-2-옥소-에틸]아미노]-1-(tert-부톡시메틸)-2-옥소-에틸]카르바모일]피롤리딘-1-일]-2-옥소-에틸]카르바메이트 (0.41 mmol/g, 1.22 g, 0.500 mmol)를 각각 11개의 반응기에 충전한다 (수지 상에서 총 5.5 mmol의 펩티드). 하기 나타낸 합성 단계를 시작하기 전에, 각각의 반응기에서 수지를 3 x 10 ml의 DMF로 각각 20 분 동안 팽윤시킨 다음, 3 x 10 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 각각 30 분 동안 Fmoc 기를 제거하고, 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다.
아미노산 용액 제조:
1. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Ala-OH 용액을 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로판산 (6.66 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
2. 103 mL의 0.375 M FmocNH-L-Glu(tBu)-OH 용액을 (2S)-5-tert-부톡시-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜탄산 (16.44 g, 38.63 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
3. 61 mL의 0.375 M FmocNH-L-Phe-OH 용액을 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-페닐-프로판산 (8.83 g, 22.79 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
4. 57 mL의 0.375 M FmocNH-Gly-OH 용액을 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (6.36 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
5. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Ile-OH 용액을 (2S,3S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-메틸-펜탄산 (7.55 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
6. 103 mL의 0.375 M FmocNH-L-Leu-OH 용액을 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-4-메틸-펜탄산 (13.65 g, 38.62 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
7. 82 mL의 0.375 M FmocNH-L-Gln(trt)-OH 용액을 (2S)-5-(tert-부틸아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜탄산 (13.05 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
8. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Tyr(tBu)-OH 용액을 (2S)-3-(4-tert-부톡시페닐)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로판산 (9.82 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
9. 57 mL의 0.375 M FmocNH-Aib-OH 용액을 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-2-메틸-프로판산 (6.96 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
10. 44 mL의 0.375 M FmocNH-L-Cys(trt)-OH 용액을 (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐-프로판산 (9.66 g, 16.50 mmol) 및 DMF로부터 제조하고, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
커플링 조건:
Gln: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 18 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척.
Aib, Ala, Leu-9: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 12 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척.
Phe, Ile: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 8 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척.
Cys: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 사전-활성화 없음, 주위 온도에서 8 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척.
다른 모든 커플링: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 4 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의한 3 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척.
합성 마지막에, 각각의 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안, 이어서 5 x 1 ml의 디클로로메탄으로 각각 1 분 동안 세척한다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시키고, 합하여, 수지 상에서 24.394 g의 표제 화합물을 제공한다. 수지를 3 x 4 ml의 DMF로 각각 15 분 동안 팽윤시키고, 3 x 4 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)로 각각 30 분 동안 처리하고, 5 x 4 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척하고, 5 x 4 ml의 디클로로메탄으로 각각 1 분 동안 세척하고, 일정한 중량이 될 때까지 건조시킴으로써, 수지 상에서 91.8 mg의 펩티드 샘플로부터 Fmoc 기를 제거한다. 회전식 혼합기 상에서 20 ml 섬광 바이알에서 5 mL의 TFA/TIS/H2O/DTT ([0.925v:0.025v:0.025v]:0.025w) 용액과 2 시간 동안 혼합함으로써 수지로부터 탈보호된 생성물 샘플을 절단시킨다. 수지를 여과하고, 수지 습식 케이크를 2 mL의 순수한 TFA로 세척한다. 생성된 조 펩티드를 35 mL의 저온 MTBE에 의해 침전시키고, 원심분리하고, 2 x 35 ml의 MTBE로 세척하고, 진공하에 밤새 33℃에서 건조시켜, 48.2 mg의 완전히 탈보호된 펩티드를 수득한다. UPLC에 의한 분석은 88.02 면적% 순도를 나타내었고, 1.0 면적%가 넘는 관련 물질은 없었다. 나머지 펩티드를 3구 둥근 바닥 플라스크에서 185 mL의 트리플루오로아세트산, 5.0 mL의 트리이소프로필실란, 5.0 mL의 물, 5.0 g의 디티오트레이톨로 이루어진 200 ml의 용액과 함께 주위 온도에서 2 시간 동안 기계적으로 교반함으로써 수지로부터 절단시킨다. 수지를 프릿화 깔때기 상에서 여과에 의해 제거하고, 80 ml의 TFA로 세척하여, 대략 280 mL의 총 용액 부피를 수득한다. 1400 ml의 저온 MTBE에 첨가하여 펩티드를 침전시킨다. -20℃에서 1 시간 동안 숙성시킨 후, 슬러리를 6개의 보틀에 나누고, 원심분리한다. 원심분리 이후 생성된 고체를 2개의 보틀에 합하고, 각각의 고체를 250 ml의 실온 MTBE로 2회 세척한다. 생성된 백색 고체를 33℃의 진공 오븐에서 밤새 건조시켜, 20.07 g의 조 펩티드를 수득한다.
실시예 76: Boc-Tyr(tBu)-Aib-Gln(trt)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-αMeLeu-Leu-Asp(tBu)-Lys(mtt)-Cys(trt)-Pro-글리콜산-Val-NH
2
(서열식별번호:56; 화합물 63)의 합성
표제 화합물은 표준 고체상 합성 조건 (Fmoc-보호된 아미노산/에틸 시아노글리옥실레이트-2-옥심 (옥시마)/N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여 제조된다.
용매 및 시약 제조:
40 L의 DMF를 용매 저장기에 충전한다. 4 L의 20% 피페리딘/DMF (v/v) 용액을 탈보호 저장기에 충전한다. 600 mL의 0.660 M DIC 용액을 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (49.98 g, 396.0 mmol) 및 DMF를 사용하여 제조하고, DIC/용매 저장기에 충전한다. 500 ml의 0.750 M 옥시마 용액을 에틸 시아노글리옥실레이트-2-옥심 (53.29 g, 371.2 mmol) 및 DMF를 사용하여 제조하고, 옥시마/용매 저장기에 충전한다. 링크 아미드 AM, 링크 아미드 MBHA 또는 시버 수지 상의 [2-[[(1S)-1-카르바모일-2-메틸-프로필]아미노]-2-옥소-에틸] (2S)-1-[(2R)-2-[[(2S)-6-[[디페닐(p-톨릴)메틸]아미노]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-3-트리틸술파닐-프로파노일]피롤리딘-2-카르복실레이트 (0.500 mmol)를 각각 8개의 반응기에 충전한다 (수지 상에서 총 4.0 mmol의 펩티드).
하기 나타낸 합성 단계를 시작하기 전에, 각각의 반응기에서 수지를 3 x 10 ml의 DMF로 각각 20 분 동안 팽윤시킨 다음, 4 x 10 ml의 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 각각 30 분 동안 Fmoc 기를 제거하고, 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척한다.
아미노산 용액 제조:
1. 57 mL의 0.375 M FmocNH-Aib-OH 용액을 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-2-메틸-프로판산 (6.96 g, 21.37 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
2. 103 mL의 0.375 M FmocNH-L-Asp(tBu)-OH 용액을 (2S)-4-tert-부톡시-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-4-옥소-부탄산 (15.87 g, 38.63 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
3. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Phe-OH 용액을 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-페닐-프로판산 (8.28 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
4. 57 mL의 0.375 M FmocNH-Gly-OH 용액을 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (6.36 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
5. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Ile-OH 용액을 (2S,3S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-메틸-펜탄산 (7.55 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
6. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Lys(boc)-OH 용액을 (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산 (10.02 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
7. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Leu-OH 용액을 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-4-메틸-펜탄산 (7.55 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
8. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Gln(trt)-OH 용액을 (2S)-5-(tert-부틸아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜탄산 (13.05 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
9. 103 mL의 0.375 M FmocNH-L-Ser(tBu)-OH 용액을 (2S)-3-tert-부톡시-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로판산 (14.81 g, 38.63 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
10. 103 mL의 0.375 M FmocNH-L-Thr(tBu)-OH 용액을 (2S,3R)-3-tert-부톡시-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)부탄산 (15.35 g, 38.63 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
11. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-Tyr(tBu)-OH 용액을 (2S)-3-(4-tert-부톡시페닐)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로판산 (9.82 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
12. 57 mL의 0.375 M BocNH-L-Tyr(tBu)-OH 용액을 (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-(4-tert-부톡시페닐)프로판산 (7.21 g, 21.38 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
13. 57 mL의 0.375 M FmocNH-L-αMeLeu-OH 용액을 (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-2,4-디메틸-펜탄산 (7.85 g, 21.37 mmol) 및 DMF로부터 제조한 다음, 적절한 아미노산 보틀에 충전한다.
커플링 조건:
Boc-Tyr, Ile: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 18 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척.
Aib, Gln, αMeLeu: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 12 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의해 4 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척.
다른 모든 커플링: 0.18 M, 3.0 당량 아미노산, 3.0 당량 옥시마/3.3 당량 DIC, 활성화된 에스테르 용액의 30 분 사전-활성화, 주위 온도에서 4 시간 커플링 시간, 20% 피페리딘/DMF (v/v)에 의한 3 x 30 분 탈보호, 탈보호 이후 및 커플링 이후 5 x 1 분 DMF로 세척. 합성 마지막에, 각각의 수지를 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안, 이어서 5 x 1 ml의 디클로로메탄으로 각각 1 분 동안 세척한다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시키고, 다음 단계로 전달한다. 한 반응기로부터의 샘플 (~ 80 mg)을 회전식 혼합기 상에서 20 ml 섬광 바이알에서 5 mL의 TFA/TIS/H2O/DTT ([0.925v:0.025v:0.025v]:0.025w) 용액과 함께 2 시간 동안 혼합함으로써 수지로부터 절단시킨다. 수지를 여과하고, 수지 습식 케이크를 2 mL의 순수한 TFA로 세척한다. 생성된 조 펩티드를 35 mL의 저온 MTBE에 의해 침전시키고, 원심분리하고, 2 x 35 ml의 MTBE로 세척하고, 진공하에 밤새 33℃에서 건조시켜, 완전히 탈보호된 펩티드의 샘플을 수득한다. UPLC에 의한 분석은 59.8 면적% 순도를 나타내었다.
실시예 77: Tyr-Aib-Gln-Glu-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-αMeLeu-Leu-Asp-Lys(AEEA-AEEA-γGlu-C
20
-OH)-Cys-Pro-글리콜산-Val-NH
2
(서열식별번호:57; 화합물 64)의 합성
단계 1 (mtt 보호기)의 탈보호:
링크 아미드 AM, 링크 아미드 MBHA 또는 시버 수지 상의
[2-[[(1S)-1-카르바모일-2-메틸-프로필]아미노]-2-옥소-에틸] (2S)-1-[(2R)-
2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-tert-부톡시-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-
2-[[(2S)-3-tert-부톡시-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-tert-부톡시-2-[[(2S)-3-tert-
부톡시-2-[[(2S,3R)-3-tert-부톡시-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-3-tert-부톡시-2-
[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-(4-tert-부톡시
페닐)프로파노일]아미노]-2-메틸-프로파노일]아미노]-5-옥소-5-(트리틸아미
노)펜타노일]아미노]아세틸]아미노]부타노일]아미노]-3-페닐-프로파노일]아
미노]부타노일]아미노]프로파노일]아미노]-4-옥소-부타노일]아미노]-3-(4-
tert-부톡시페닐)프로파노일]아미노]프로파노일]아미노]-3-메틸-펜타노일]아
미노]-2,4-디메틸-펜타노일]아미노]-4-메틸-펜타노일]아미노]-4-옥소-부타노
일]아미노]-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-6-[[디페닐(p-
톨릴)메틸]아미노]헥사노일]아미노]-3-트리틸술파닐-프로파노일]피롤리딘-2-
카르복실레이트 (0.500 mmol)
를 각각 8개의 상이한 반응기에 충전한다. 각각의 수지를 3 x 10 ml의 DCM으로 각각 15 분 동안 팽윤시킨 다음, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올, 디클로로메탄 중 30% (v/v) (10 mL, 94.98 mmol)로 처리하고, 1 시간 동안 혼합한다. 액체를 배수시키고, 수지를 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올, 디클로로메탄 중 30% (v/v) (10 mL, 94.98 mmol)로 다시 처리하고, 1 시간 동안 혼합한다. 액체를 다시 배수시키고, 수지를 5 x 10 ml의 디클로로메탄으로 각각 1 분 동안, 이어서 5 x 10 ml의 DMF로 각각 1 분 동안 세척하고, 커플링 반응으로 전달한다.
단계 2 (측쇄의 커플링):
2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-부톡시-4-[(20-tert-부톡시-20-옥소-아이코사노일)아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세트산 (6.41 g, 8.00 mmol, 91 질량%) 및 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP) (4.16 g, 8.00 mmol)를 72 mL의 DMF에 용해시킨다. N,N-디이소프로필에틸아민 (1.40 mL, 8.00 mmol)을 첨가하고, 생성된 용액을 1 분 동안 진탕시킨 다음,용액의 1/8을 반응 용기 중의 각각의 수지에 첨가하고, 16 시간 동안 혼합한다. 액체를 배수시키고, 수지를 5 x 15 ml의 DMF로 각각 1 분 동안, 5 x 15 ml의 디클로로메탄으로 각각 1 분 동안 세척한 다음, 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 수지 상에서 15.66 g의 펩티드를 수득한다.
단계 3 (수지로부터 펩티드의 절단 및 전체 탈보호):
펩티드를 3구 둥근 바닥 플라스크에서 148 mL의 트리플루오로아세트산, 4.0 mL의 트리이소프로필실란, 4.0 mL의 물, 및 4.0 g의 디티오트레이톨로 이루어진 160 ml의 용액과 함께 주위 온도에서 2 시간 동안 기계적으로 교반함으로써 수지로부터 절단시킨다. 수지를 프릿화 깔때기 상에서 여과에 의해 제거하고, 64 ml의 TFA로 세척하여, 대략 224 mL의 총 용액 부피를 수득한다. 1120 ml의 저온 MTBE를 첨가하여 펩티드를 침전시킨다. -20℃에서 1 시간 동안 숙성시킨 후, 슬러리를 4개의 보틀에 나누고, 원심분리한다. 원심분리 후에 생성된 고체를 2개의 보틀에서 합하고, 각각의 고체를 250 ml의 실온 MTBE로 2회 세척한다. 생성된 고체를 33℃의 진공 오븐에서 밤새 건조시켜, 7.817 g의 조 표제 화합물을 수득한다.
실시예 78: 서열식별번호:6의 정제
조 생성물 (76.23g)을 5 L 반응기에서 3.05L의 25% ACN/물 혼합물 (25g/L 조 농도)에 용해시키고, 30 분 동안 교반한다. 28% 수산화암모늄을 사용하여 pH=9.0으로 조정하여 전환시킴으로써 뎁시펩티드 이성질체를 수정하고, 60 분 동안 교반한 후, 후속적으로 다시 산성으로 조정한다 (TFA를 사용하여 pH=2). pH 조정 후에 용해도를 보장하기 위해 최종 ACN 함량은 30%이어야 한다. 제1 크로마토그래피 단계 전에 조 물질을 여과한다.
제1 크로마토그래피 단계: 컬럼: DAC200, 200mm x 250mm, 정지상 (YMC 트리아트(Triart) C18, 10 um, 12nm); 이동상 A: H2O 중 0.1% TFA; 이동상 B: 100% ACN; 230 nm에서 검출; 주입 부피: 3.5L (300ml/분의 유량으로 주입 펌프에 의해).
구배:
원하는 생성물을 갖는 분획을 수집한다.
제2 크로마토그래피 단계: 동등한 부피의 H2O로 희석하고, 희석된 암모니아를 사용하여 pH를 6.5로 조정한다. 컬럼: DAC200, 200mm x 250mm, 정지상 (YMC 트리아트 C18, 10um, 12nm). 이동상 A: H2O 중 10mM NH4HCO3; 이동상 B: 100% ACN; 230nm에서 검출; 주입 부피: 7.0L (300ml/분의 유량으로 주입 펌프에 의해).
구배:
원하는 생성물을 갖는 분획을 수집한다.
나트륨 염 전환 단계: 200ml H2O에 용해된 1.76g (44.0mmol) NaOH를 7.2L의 분리된 분획에 적가하고, 동결건조시킨다. 38.02g 정제된 생성물 (순도:98.0%)을 수득한다.
실시예 79: 서열식별번호:29의 정제
조 생성물을 20cm 컬럼 (4.8kg 다이소(Daiso) C18-ODS-RPS, 10μ, 120Å), 이동상 A: H2O 중 0.1% TFA; 이동상 B: 100% ACN을 이용하여 정제하고; 230 nm에서 검출한다. 제1 정제 단계:
구배:
약 88% 이상의 순도의 생성물을 갖는 분획을 수집하고, H2O에 의해 1:1로 희석하고, 50% NH4OH에 의해 pH를 6.5로 조정한다.
제2 크로마토그래피 단계: 제1 단계의 컬럼을 사용한다. 이동상 A: H2O 중 10mM NH4HCO3; 이동상 B: 100% ACN; 230nm에서 검출한다.
구배:
약 97% 이상의 순도를 갖는 분획을 수집한다.
3 eq의 NaOH를 첨가하여 나트륨 염으로 전환시킨 후, 동결건조시킨다.
서열
하기 아미노산 서열이 본 개시내용에서 언급되며, 참고를 위해 하기에 제공된다.
서열식별번호:1 - 인간 GIP
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ
서열식별번호:2 - 인간 GLP-1 (7-36) 아미드
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
서열식별번호:3 - 인간 GCG
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT
서열식별번호:4 - 인크레틴 유사체
YX2QGTFTSDYSIX13LDKX17AX19X20AFIEYLLX28X29GPSSX34APPPS
여기서, X2는 Aib이고, X13은 L 또는 αMeL이고, X17은 접합에 이용가능한 관능기를 갖는 임의의 아미노산이고, 관능기는 C16-C22 지방산에 접합되고, X19는 Q 또는 A이고, X20은 Aib, αMeK, Q 또는 H이고, X28은 E 또는 A이고, X29는 G 또는 Aib이고, X34는 G 또는 Aib이고, C-말단 아미노산은 임의적으로 아미드화된다.
서열식별번호:5 - 인크레틴 유사체
Y(Aib)QGTFTSDYSI(αMeL)LDKKAQ(Aib)AFIEYLLEGGPSSGAPPPS
서열식별번호:6 - 인크레틴 유사체
Y(Aib)QGTFTSDYSI(αMeL)LDKK((2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)-(γGlu)-CO-(CH2)18-CO2H)AQ(Aib)AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2
서열식별번호:7 - 중간체 화합물 1
서열식별번호:8 - 중간체 화합물 2
서열식별번호:9 - 중간체 화합물 3
서열식별번호:10 - 중간체 화합물 4
서열식별번호:11 - 중간체 화합물 5
서열식별번호:12 - 중간체 화합물 6
서열식별번호:13 - 중간체 화합물 7
서열식별번호:14 - 중간체 화합물 8
서열식별번호:15 - 중간체 화합물 9
서열식별번호:16 - 중간체 화합물 10
서열식별번호:17 - 중간체 화합물 11
서열식별번호:18 - 중간체 화합물 12
서열식별번호:19 - 중간체 화합물 13
서열식별번호:20 - 중간체 화합물 14
서열식별번호:21 - 중간체 화합물 15
서열식별번호:22 - 중간체 화합물 16
서열식별번호:23 - 중간체 화합물 17
여기서, R은 2,2,2-트리플루오로에틸일 수 있다.
서열식별번호:24 - 중간체 화합물 18
서열식별번호:25 - 중간체 화합물 19
여기서, R은 2,2,2-트리플루오로에틸일 수 있다.
서열식별번호:26 - 중간체 화합물 20
서열식별번호:27 - 중간체 화합물 21
여기서, R은 2,2,2-트리플루오로에틸일 수 있다.
서열식별번호:28 - 중간체 화합물 22
서열식별번호:29 - 인크레틴 유사체
Y-Aib-EGT-αMeF(2F)-TSD-4Pal-SI-αMeL-LD-Orn-K((2-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γ-Glu)-CO-(CH2)16-CO2H)AQ-Aib-EFI-(D-Glu)-αMeY-LIEGGPSSGAPPPS-NH2
서열식별번호:30 - 중간체 화합물 27
서열식별번호:31 - 중간체 화합물 28
서열식별번호:32 - 중간체 화합물 29
서열식별번호:33 - 중간체 화합물 30
GPSSGAPPPS
서열식별번호:34 - 중간체 화합물 31
서열식별번호:35 - 중간체 화합물 32
서열식별번호:36 - 중간체 화합물 33
서열식별번호:37 - 중간체 화합물 34
서열식별번호:38 - 중간체 화합물 23
서열식별번호:39 - 중간체 화합물 24
R은 -CH2-C(O)-Val-NH2이다.
서열식별번호:40 - 중간체 화합물 25
R은 -CH2-C(O)-Val-NH2이다.
서열식별번호:41 - 중간체 화합물 26
R은 -CH2-C(O)-Val-NH2이다.
서열식별번호:42
서열식별번호:43
서열식별번호:44
서열식별번호:45
서열식별번호:46
서열식별번호:47
서열식별번호:48
서열식별번호:49
서열식별번호:50
서열식별번호:51
서열식별번호:52
CQ-(Aib)-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH2
서열식별번호:53
서열식별번호:54
여기서, R은 Pro-글리콜산-Val 또는 Pro-글리콜산이다.
서열식별번호:55
서열식별번호:56
서열식별번호:57
서열식별번호:58
서열식별번호:59
CQ-(Aib)-EFI-(D-Glu)-(α-메틸-Tyr)-LIEGGGPSSGAPPPS-NH2
서열식별번호:60
서열식별번호:61
서열식별번호:62
SEQUENCE LISTING
<110> Eli Lilly and Company
<120> METHODS OF MAKING INCRETIN ANALOGS
<130> X22477
<150> US 62/888,756
<151> 2019-08-19
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln
35 40
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> AMIDATION
<400> 2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is L or alpha-Methyl-L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa at position 17 is any amino acid with a functional group
available for conjugation, and the functional group is conjugated
to a C16-C22 fatty acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa at position 19 is Q or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib, alpha-Methyl-K, Q or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa at position 28 is E or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa at position 29 is G or Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> Xaa at position 34 is G or Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> The C-terminal amino acid is optionally amidated
<400> 4
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Xaa Ala Xaa Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Xaa Xaa Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Xaa Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 5
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-Methyl-L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib
<400> 5
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 6
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-Methyl-L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide
<400> 6
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ser at position 10 is amidated as a C-terminal primary amide
<400> 7
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<400> 8
Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is Aib
<400> 9
Asp Lys Lys Ala Gln Xaa Ala
1 5
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-Methyl-Leu
<400> 10
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<400> 11
Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is Aib
<400> 12
Asp Lys Lys Ala Gln Xaa
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<400> 13
Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<400> 14
Asp Lys Lys Ala
1
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<400> 15
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> Ser at position 18 is amidated as a C-terminal primary amide
<400> 16
Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro
1 5 10 15
Pro Ser
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is Aib
<400> 17
Asp Lys Lys Ala Gln Xaa Ala
1 5
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Ser at position 19 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 18
Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro
1 5 10 15
Pro Pro Ser
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Ser at position 21 is amidated as a C-terminal primary amide
<400> 19
Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly
1 5 10 15
Ala Pro Pro Pro Ser
20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<400> 20
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa
20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The sidechain of Lys at position 17 is protected by a protecting
group PG.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<400> 21
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa
20
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The sidechain of lysine is protected by a protecting group PG.
<400> 22
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> The C-terminal hyroxyl is modified with -SR, wherein R can be
2,2,2-trifluoroethyl.
<400> 23
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa
20
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The side chain of Ala is modified with -SH.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Ser at position 19 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 24
Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro
1 5 10 15
Pro Pro Ser
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> The C terminal hydroxyl is modified with -SR, wherein R can be
2,2,2-trifluoroethyl.
<400> 25
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa
20
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of Ala is modified with -SH.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Ser at position 22 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 26
Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Pro Pro Pro Ser
20
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The C-terminal hydroxyl is modified with -SR, wherein R may be
2,2,2-trifluoroethyl.
<400> 27
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<400> 28
Tyr Xaa Gln Gly
1
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-methyl-Phe(2F).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is 4Pal..
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Orn.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)-CO-(CH2)16-CO
2H.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa at position 24 is D-Glu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa at position 25 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 29
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ile Xaa Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-mehtyl-Phe(2F).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is 4Pal.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<400> 30
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ile Xaa Leu
1 5 10
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-methyl-Phe(2F).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is 4Pal.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<400> 31
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ile Xaa Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is D-Glu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa at position 7 is alpha-methyl-Tyr.
<400> 32
Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 33
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-methyl-Phe(2F).
<400> 34
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser
1 5
<210> 35
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is D-Glu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa at position 7 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Ser at position 21 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 35
Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly
1 5 10 15
Ala Pro Pro Pro Ser
20
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa at position 4 is D-Glu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa at position 5 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Ser at position 19 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 36
Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro
1 5 10 15
Pro Pro Ser
<210> 37
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa at position 7 is D-Glu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa at position 8 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Ser at position 22 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 37
Cys Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly Gly Pro Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Pro Pro Pro Ser
20
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is Aib.
<400> 38
Asp Lys Lys Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly
1 5 10 15
<210> 39
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> The C-terminal is -OR, wherein R is -CH2-C(O)-Val-NH2.
<400> 39
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa Cys Pro
20
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The C-terminal is -OR, wherein R is -CH2-C(O)-Val-NH2.
<400> 40
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Cys Pro
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The C-terminal is -OR, wherein R is -CH2-C(O)-Val-NH2.
<400> 41
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Cys Pro
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Orn.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of Orn is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(
CH2)16-CO2-(t-butyl).
<400> 42
Asp Xaa Lys Ala
1
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is D-Glu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> The sidechain of D-glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa at position 7 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of alpha-methyl-tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Ser at position 21 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 43
Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly
1 5 10 15
Ala Pro Pro Pro Ser
20
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-methyl-Phe(2F).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is 4Pal.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Orn.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> The sidechain of Orn is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(
CH2)16-CO2-(t-butyl).
<400> 44
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ile Xaa Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<400> 45
Asp Lys Lys Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly
1 5 10 15
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Ser at position 25 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 46
Asp Lys Lys Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
20 25
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Lys at position 3 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Ser at position 25 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 47
Asp Lys Lys Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
20 25
<210> 48
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> The sidechain of lysine is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu(t-butyl))-CO-(C
H2)18-CO2-(t-butyl).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 48
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 49
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Ser at position 19 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 49
Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro
1 5 10 15
Pro Pro Ser
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The C-terminus is modified with N-NH2.
<400> 50
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The C-terminus is modified with S-(4-OH-phenyl).
<400> 51
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 52
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Ser at position 22 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 52
Cys Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Pro Pro Pro Ser
20
<210> 53
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 53
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Cys Gln Xaa Ala Phe Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> The C-terminus is modified with -(CO)-R, wherein R is
Pro-(glycolic acid)-Val or Pro-(glycolic acid).
<400> 54
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Cys
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Fmoc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ser at position 10 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 55
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N-terminus is protected by Boc.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of threonine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> The sidechain of serine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> The sidechain of aspartic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The sidechain of lysine is modified with mtt.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> The sidechain of cysteine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> The C-terminus is modified with Pro-(glycolic acid)-Val and Val
is amidated.
<400> 56
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Cys
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)-(gamma-Glu)-CO-(CH2)18-CO2
H.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> The C-terminus is modified with -Pro-(glycolic acid)-Val, and Val
is amidated.
<400> 57
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys
1 5 10 15
Lys Cys
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-methyl-Phe(2F).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is 4Pal.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Orn.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)-CO-(CH2)16-CO
2H.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The C-terminus is modified with N-NH2.
<400> 58
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ile Xaa Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Lys
<210> 59
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa at position 3 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa at position 7 is D-Glu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa at position 8 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Ser at position 23 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 59
Cys Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
20
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-methyl-Phe(2F).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is 4Pal.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Orn.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)-CO-(CH2)16-CO
2H.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> The C-terminus is modified with -S-phenyl.
<400> 60
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ile Xaa Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Lys
<210> 61
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is alpha-methyl-Phe(2F).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa at position 10 is 4Pal.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa at position 13 is alpha-methyl-Leu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is Orn.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Lys at position 17 is chemically modified through conjugation to
the epsilon-amino group of the K side-chain with
(2-[2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)-CO-(CH2)16-CO
2H.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa at position 20 is Aib.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa at position 24 is D-Glu.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa at position 25 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide.
<400> 61
Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ile Xaa Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Lys Cys Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> The sidechain of glutamine is protected by Trityl (Trt).
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa at position 2 is Aib.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa at position 6 is D-Glu.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> The sidechain of D-Glu is protected by t-butyl.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa at position 7 is alpha-methyl-Tyr.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> The sidechain of alpha-methyl-tyrosine is protected by t-butyl.
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> The sidechain of glutamic acid is protected by t-butyl.
<400> 62
Gln Xaa Glu Phe Ile Xaa Xaa Leu Ile Glu Gly
1 5 10
Claims (38)
- 하이브리드 액체 고체상 합성을 통해 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 4가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 포함하는, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체의 제조 방법:
a. 서열식별번호:7, 8, 9 및 10,
b. 서열식별번호:7, 11, 12, 및 10, 및
c. 서열식별번호:7, 13, 14 및 10. - 하이브리드 액체 고체상 합성을 통해 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 3가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 포함하는, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체의 제조 방법:
a. 서열식별번호:7, 13 및 15,
b. 서열식별번호:16, 17 및 10,
c. 서열식별번호:18, 12 및 10, 및
d. 서열식별번호:7, 45 및 10. - 하이브리드 액체 고체상 합성을 통해 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 포함하는, 서열식별번호:6의 인크레틴 유사체의 제조 방법:
a. 서열식별번호:15 및 19 및
b. 서열식별번호:18 및 20. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:7 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:8 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:9 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:10 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:11 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:12 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:13 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:14 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:15 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:16 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:17 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:18 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:19 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:20 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:21 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:22 또는 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:23 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:24 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:25 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:26 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:27 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:28 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:38 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:39 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:40 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - Boc-Y(Aib)EGT(αMeF(2F))TSD(4Pal)SI(αMeL)L (서열식별번호:30), 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 중간체 화합물.
- 하기를 포함하는 중간체 화합물:
서열식별번호:31 또는 그의 제약상 허용가능한 염. - Q(Aib)EFI(D-Glu)(αMeY)LIEG (서열식별번호:32), 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 중간체 화합물.
- GPSSGAPPPS (서열식별번호:33), 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 중간체 화합물.
- Boc-Y(Aib)EGT(αMeF(2F))TS (서열식별번호:34), 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 중간체 화합물.
- Q(Aib)EFI(D-Glu)(αMeY)LIEGGPSSGAPPPS-NH2 (서열식별번호:35), 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 중간체 화합물.
- EFI(D-Glu)(αMeY)LIEGGPSSGAPPPS-NH2 (서열식별번호:36), 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 중간체 화합물.
- CQ(Aib)EFI(D-Glu)(αMeY)LIEGGPSSGAPPPS-NH2 (서열식별번호:37), 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 중간체 화합물.
- 서열식별번호:38, 서열식별번호:39, 서열식별번호:40, 서열식별번호:41, 서열식별번호:42, 서열식별번호:43, 서열식별번호:44, 서열식별번호:45, 서열식별번호:46, 서열식별번호:47, 서열식별번호:48, 서열식별번호:49, 서열식별번호:50, 서열식별번호:51, 서열식별번호:52, 서열식별번호:53, 서열식별번호:54, 서열식별번호:56, 서열식별번호:57, 서열식별번호:58, 서열식별번호:59, 서열식별번호:60, 서열식별번호:61, 서열식별번호:62, 또는 그의 제약상 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 중간체 화합물.
- 하이브리드 액체 고체상 합성을 통해 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중간체 화합물을 커플링시키는 단계를 포함하는, 서열식별번호:29의 인크레틴 유사체의 제조 방법:
a. 서열식별번호:7, 62, 42 및 31,
b. 서열식별번호:43, 및 44.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962888756P | 2019-08-19 | 2019-08-19 | |
| US62/888,756 | 2019-08-19 | ||
| PCT/US2020/046778 WO2021034815A1 (en) | 2019-08-19 | 2020-08-18 | Methods of making incretin analogs |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220035199A true KR20220035199A (ko) | 2022-03-21 |
Family
ID=72322545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227005160A KR20220035199A (ko) | 2019-08-19 | 2020-08-18 | 인크레틴 유사체의 제조 방법 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220411461A1 (ko) |
| EP (1) | EP4017866A1 (ko) |
| JP (1) | JP2022545200A (ko) |
| KR (1) | KR20220035199A (ko) |
| CN (1) | CN114269775A (ko) |
| AU (1) | AU2020334993B2 (ko) |
| BR (1) | BR112022001081A2 (ko) |
| CA (1) | CA3148347A1 (ko) |
| CL (1) | CL2022000374A1 (ko) |
| CO (1) | CO2022001413A2 (ko) |
| EC (1) | ECSP22013340A (ko) |
| IL (1) | IL289957A (ko) |
| MX (1) | MX2022002115A (ko) |
| PE (1) | PE20221049A1 (ko) |
| WO (1) | WO2021034815A1 (ko) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022159395A1 (en) | 2021-01-20 | 2022-07-28 | Viking Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of metabolic and liver disorders |
| JP2024518058A (ja) | 2021-05-07 | 2024-04-24 | イーライ リリー アンド カンパニー | 浸食性錠剤 |
| TW202404996A (zh) * | 2022-04-04 | 2024-02-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 製備glp-1/升糖素雙重促效劑之方法 |
| CN115368234B (zh) * | 2022-08-19 | 2024-01-26 | 淄博矿业集团有限责任公司 | 一种索马鲁肽侧链及其中间体的合成方法 |
| WO2024077149A2 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Eli Lilly And Company | Peptides for incretin synthesis |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110046349A1 (en) | 2009-07-15 | 2011-02-24 | Matthieu Giraud | Process for the production of exenatide and of an exenatide analogue |
| SG11201407137PA (en) | 2012-05-03 | 2014-11-27 | Zealand Pharma As | Gip-glp-1 dual agonist compounds and methods |
| WO2014049610A2 (en) | 2012-09-26 | 2014-04-03 | Cadila Healthcare Limited | Peptides as gip, glp-1 and glucagon receptors triple-agonist |
| PE20151770A1 (es) * | 2013-05-28 | 2015-12-11 | Takeda Pharmaceutical | Compuesto peptidico |
| BR112016009995B1 (pt) | 2013-11-06 | 2023-04-18 | Zealand Pharma A/S | Compostos agonistas triplos glucagon-glp-1-gip |
| CN103613656B (zh) * | 2013-11-20 | 2015-03-04 | 陕西东大生化科技有限责任公司 | 一种艾塞那肽的固相片段合成方法 |
| JOP20200119A1 (ar) | 2015-01-09 | 2017-06-16 | Lilly Co Eli | مركبات مساعد مشترك من gip وglp-1 |
| WO2016198624A1 (en) | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Sanofi | Exendin-4 derivatives as trigonal glp-1/glucagon/gip receptor agonists |
| CN116063453A (zh) | 2015-12-31 | 2023-05-05 | 韩美药品株式会社 | 胰高血糖素/glp-1/gip受体三重激动剂 |
| JP7237590B6 (ja) | 2016-03-10 | 2023-03-28 | メドイミューン・リミテッド | 肥満の治療のためのグルカゴン及びｇｌｐ－１コアゴニスト |
| TW201833131A (zh) | 2016-12-02 | 2018-09-16 | 法商賽諾菲公司 | 作為胜肽類ｇｌｐ１／升糖素／ｇｉｐ受體促效劑之新化合物 |
| CN106749610A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种艾塞那肽的制备方法及其产品 |
| TWI810937B (zh) | 2017-12-21 | 2023-08-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途 |
| TWI744579B (zh) * | 2017-12-21 | 2021-11-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途 |
| WO2020023386A1 (en) | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Eli Lilly And Company | Gip/glp1 co-agonist compounds |
-
2020
- 2020-08-18 KR KR1020227005160A patent/KR20220035199A/ko active Search and Examination
- 2020-08-18 JP JP2022510146A patent/JP2022545200A/ja active Pending
- 2020-08-18 AU AU2020334993A patent/AU2020334993B2/en active Active
- 2020-08-18 PE PE2022000273A patent/PE20221049A1/es unknown
- 2020-08-18 CN CN202080059063.8A patent/CN114269775A/zh active Pending
- 2020-08-18 CA CA3148347A patent/CA3148347A1/en active Pending
- 2020-08-18 BR BR112022001081A patent/BR112022001081A2/pt unknown
- 2020-08-18 MX MX2022002115A patent/MX2022002115A/es unknown
- 2020-08-18 US US17/633,631 patent/US20220411461A1/en active Pending
- 2020-08-18 WO PCT/US2020/046778 patent/WO2021034815A1/en unknown
- 2020-08-18 EP EP20765144.9A patent/EP4017866A1/en active Pending
-
2022
- 2022-01-18 IL IL289957A patent/IL289957A/en unknown
- 2022-02-11 CO CONC2022/0001413A patent/CO2022001413A2/es unknown
- 2022-02-15 CL CL2022000374A patent/CL2022000374A1/es unknown
- 2022-02-18 EC ECSENADI202213340A patent/ECSP22013340A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021034815A1 (en) | 2021-02-25 |
| CA3148347A1 (en) | 2021-02-25 |
| ECSP22013340A (es) | 2022-03-31 |
| MX2022002115A (es) | 2022-03-17 |
| AU2020334993A1 (en) | 2022-02-24 |
| CN114269775A (zh) | 2022-04-01 |
| EP4017866A1 (en) | 2022-06-29 |
| US20220411461A1 (en) | 2022-12-29 |
| IL289957A (en) | 2022-03-01 |
| BR112022001081A2 (pt) | 2022-05-24 |
| JP2022545200A (ja) | 2022-10-26 |
| AU2020334993B2 (en) | 2023-07-13 |
| CO2022001413A2 (es) | 2022-03-18 |
| CL2022000374A1 (es) | 2022-11-18 |
| PE20221049A1 (es) | 2022-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020334993B2 (en) | Methods of making incretin analogs | |
| WO2017023933A2 (en) | Peptidomimetic macrocycles | |
| US9073965B2 (en) | Adiponectin receptor agonists and methods of use | |
| CN113330024A (zh) | 制备gip/glp1双重激动剂的方法 | |
| CA3017926A1 (en) | Methods for synthesizing .alpha.4.beta.7 peptide antagonists | |
| KR20110125235A (ko) | 뉴로펩타이드 ｙ 수용체 결합성 화합물을 포함하는 세포독성 접합체 | |
| IL171204A (en) | Compounds and pharmaceutical compositions containing them and use thereof for the preparation of medicaments | |
| TW202140513A (zh) | 人類運鐵蛋白受體結合肽 | |
| JP2023037645A (ja) | ペプチド類化合物、その使用及びそれを含む組成物 | |
| JP2008529969A (ja) | 固相合成におけるｓ−アルキル−スルフェニル保護基 | |
| US20160354480A1 (en) | Activated neurotensin molecules and the uses thereof | |
| JP2008517016A (ja) | 樹脂上ペプチド環化 | |
| CA3125383A1 (en) | Conotoxin peptide analogs and uses for the treatment of pain and inflammatory conditions | |
| Pineda-Castañeda et al. | Designing Short Peptides: A Sisyphean Task? | |
| KR20240045202A (ko) | Ghr-결합 펜딩 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 | |
| WO2023196765A1 (en) | Process for preparing a glp-1/glucagon dual agonist |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |