CN109239242A - 一种艾塞那肽杂质含量的分析方法 - Google Patents

一种艾塞那肽杂质含量的分析方法 Download PDF

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赵慧英
张磊
张�林
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Abstract

本发明公开了一种艾塞那肽杂质含量的分析方法，属于药物分析技术领域。本发明将艾塞那肽及三个特定杂质采用胰蛋白酶酶切，酶切后样品分别采用两种色谱方法进行分离，以外标法计算测定艾塞那肽中杂质[D‑His1]‑艾塞那肽、杂质[Double Pro38]‑艾塞那肽及杂质[Des‑Gly2]‑艾塞那肽含量。本发明的方法便捷、有效、精准度高，能够有效分离杂质并准确定量。

Description

一种艾塞那肽杂质含量的分析方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种艾塞那肽杂质含量的分析方法。该分析方法能够简便分离和准确定量测定艾塞那肽三个特定杂质，可作为艾塞那肽质量控制的重要组成部分。
背景技术
艾塞那肽(Exenatide)是美洲巨蜥蜴毒液中提取分离的含有39个氨基酸的多肽序列，与GLP-1具有53％的同源性，由于不易被DPP-Ⅳ降解而表现出更强的稳定性及生物活性。艾塞那肽为GLP-1受体激动剂，可促进胰岛素分泌，主要用于改善Ⅱ型糖尿病患者的血糖控制。
艾米林制药公司(Amylin)与美国礼来公司共同研发的艾塞那肽注射液(Byetta，百泌达)于2005年在美国上市，长效艾塞那肽(Bydureon，百达扬)分别于2011年获得欧盟批准，2012年获得FDA批上市。
艾塞那肽原料药采用固相合成方法制备，在艾塞那肽合成工艺中会产生一系列与其结构、性质类似的杂质，如非对映异构体、缺失肽等，目前已公开的艾塞那肽有关物质检测方法分离能力较差，无法对特定杂质进行准确分离定量，尤其是对非对映异构体杂质[D-His1]-艾塞那肽的分离困难较大。有文献报道，将艾塞那肽全水解为氨基酸，采用氘代试剂衍生后，利用气相手性色谱柱分离，质谱定量检测的方法对杂质[D-His1]-艾塞那肽进行控制，该方法所用仪器、试剂及色谱柱均较为特殊，检测成本高，且方法操作繁琐，重复性较差。
为有效分析和检测药品质量，保证用药安全，仍需要开发出一种便捷、有效检测艾塞那肽相关杂质的分析方法。
艾塞那肽及需检测杂质的序列结构如下：
1)艾塞那肽
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
2)[D-His1]-艾塞那肽
H-D-His1-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
3)[Double Pro38]-艾塞那肽
H-His1-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro38-Pro38-Ser39-NH2
4)[Des-Gly2]-艾塞那肽
H-His1-Glu3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2
艾塞那肽与三个特定杂质均为长链多肽物质，其中个别氨基酸的微小差异对多肽的化学性质无影响。尤其是非对映异构体杂质[D-His1]-艾塞那肽，其结构与艾塞那肽相似，物理化学性质也几乎无差异，采用常规液相色谱方法均无法分离并准确定量测定。因此，有必要寻找一种能有效分离上述相关艾塞那肽杂质的检测方法。发明人通过大量研究发现了一种可以有效分离并准确定量分析上述各杂质的检测方法。
发明内容
本发明提供一种可有效分离并准确定量艾塞那肽特定杂质的方法，旨在解决艾塞那肽及其特定杂质[D-His1]-艾塞那肽、[Double Pro38]-艾塞那肽及[Des-Gly2]-艾塞那肽的分离与定量测定。
本发明所采用的胰蛋白酶能够特异性作用于上述多肽序列中第12位、27位赖氨酸和第20位精氨酸的羧端C-O键，使艾塞那肽及特定杂质均酶解为四个肽段。
艾塞那肽酶解四个肽段(分别命名为T1、T2、T3及T4肽段)
T1段：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓
T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓
T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓
T4段：Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
同理：杂质[D-His1]-艾塞那肽可酶解四个肽段(分别命名为D-T1、T2、T3及T4肽段)
D-T1段(即[D-His1]-T1段)：D-His1-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓
T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓
T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓
T4段：Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
杂质[Double Pro38]-艾塞那肽可酶解四个肽段(分别命名为T1、T2、T3及T4ˊ肽
段)T1段：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓
T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓
T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓
T4ˊ段(即[Double Pro38]-T4段)：
Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro38-Pro38-Ser39-NH2
杂质[Des-Gly2]-艾塞那肽可酶解四个肽段(分别命名为T1ˊ、T2、T3及T4肽段)
T1ˊ段(即[Des-Gly2]–T1段)：
H-His1-Glu3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓
T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓
T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓
T4段：Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
表1：艾塞那肽及特定杂质分离目标肽段(加粗部分为目标分离肽段)
名称 水解后产生的4个肽片段
艾塞那肽 T<sub>1</sub>、T<sub>2</sub>、T<sub>3</sub>、T<sub>4</sub>
[Double Pro<sup>38</sup>]-艾塞那肽 T<sub>1</sub>、T<sub>2</sub>、T<sub>3</sub>、[Double Pro<sup>38</sup>]-T<sub>4</sub>
[Des-Gly<sup>2</sup>]-艾塞那肽 [Des-Gly<sup>2</sup>]–T<sub>1</sub>、T<sub>2</sub>、T<sub>3</sub>、T<sub>4</sub>
[D-His<sup>1</sup>]-艾塞那肽 [D-His<sup>1</sup>]-T<sub>1</sub>、T<sub>2</sub>、T<sub>3</sub>、T<sub>4</sub>
利用艾塞那肽酶解肽段与杂质肽酶解肽段的不同，采用高效液相色谱法对不同的肽段进行分离，从而达到定量检测艾塞那肽特定杂质的目的。(例如:艾塞那肽与[D-His1]-艾塞那肽，两者酶解后均产生4个肽段，仅T1与[D-His1]-T1肽段不同，其余3个肽段均相同，采用高效液相色谱法对T1与[D-His1]-T1进行分离，从而达到定量检测艾塞那肽特定杂质[D-His1]-艾塞那肽的目的。)
本发明的另一个技术方案为：以强阳离子交换柱为色谱柱，以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，定量测定艾塞那肽中杂质[D-His1]-艾塞那肽含量，达到质量控制的目的。
本发明的另一个技术方案为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱，以氯化钾溶液-乙腈为流动相，采用梯度洗脱方式，能够定量测定艾塞那肽中杂质[Double Pro38]-艾塞那肽及[Des-Gly2]-艾塞那肽含量，达到质量控制的目的。
本发明所述的分析方法可按如下方式实现：
方法一：
1)样品制备：
1％的碳酸氢铵溶液：取碳酸氢铵1.0g，加水95ml溶解后用氨水调节pH至8.5后，再加水定容至100ml。
胰蛋白酶溶液：取胰蛋白酶加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.05mg的溶液。
稀磷酸溶液：取磷酸5ml，加水稀释至100ml，即得。
供试品溶液：取艾塞那肽25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加入稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，加入1％碳酸氢铵溶液15ml，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液：取[D-His1]-艾塞那肽对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含250μg的溶液；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加入稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，加入1％碳酸氢铵溶液15ml，再加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2)色谱条件
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：采用强阳离子交换色谱柱；色谱柱粒径为3μm；色谱柱长度为100mm；色谱柱内径为4.6mm。
流动相：磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(56.4:43.6，V/V)；其中磷酸二氢钾溶液的pH值为2.0～6.0，优选3.8～4.2，更优选3.9、4.0、4.1；所述磷酸二氢钾浓度为0.025～0.045mol/L，优选0.035～0.040mol/L，更优选0.035mol/L，使用本领域常规试剂磷酸调节pH值。
流速：1.2ml/min(等度洗脱方式)，范围1.1ml/min～1.3ml/min；柱温：45℃～55℃；检测波长：214nm；进样体积：40μl。
3)杂质的计算
按照外标法计算，计算公式如下：
A对：对照品溶液中[D-His1]-T1的峰面积；
A样：供试品溶液中[D-His1]-T1对应的峰面积；
C对：对照品溶液中[D-His1]-艾塞那肽的浓度(mg/ml)；
C样：供试品溶液的浓度(mg/ml)；
方法二：
1)样品制备：
1％的碳酸氢铵溶液：取碳酸氢铵1.0g，加水95ml溶解后用氨水调节pH至8.5后，再加水定容至100ml。
胰蛋白酶溶液：取胰蛋白酶加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.05mg的溶液。
供试品溶液配制：取艾塞那肽25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，加入冰醋酸2ml(或者稀磷酸2ml)终止反应，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液配制：取[Double Pro38]-艾塞那肽及[Des-Gly2]-艾塞那肽对照品各适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含[Double Pro38]-艾塞那肽125μg、[Des-Gly2]-艾塞那肽50μg的混合溶液；精密量取混合溶液1ml，置25ml量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，加入冰醋酸2ml(或者稀磷酸2ml)终止反应，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2)色谱条件
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；色谱柱粒径为5μm；色谱柱长度为150mm；色谱柱内径为4.6mm。
流动相A：0.1mol/L氯化钾溶液(含0.1％三乙胺)，用磷酸调节pH值为2.7；其中溶液的pH值为2.0～4.0，优选2.5～2.9，更优选2.6、2.7、或者2.8；所述氯化钾浓度为0.09～0.11mol/L，优选0.095～0.105mol/L，更优选0.1mol/L，0.1％三乙胺为体积分数，使用本领域常规试剂磷酸调节pH值。
流动相B：乙腈。
梯度洗脱程序优选为：
流速：0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：40℃～50℃；检测波长：214nm；进样体积：80μl。
梯度洗脱程序更优选为：
流速：1.0ml/min；柱温：45℃；检测波长：214nm；进样体积：80μl
3)杂质的计算
按照外标法计算，计算公式如下：
A对：对照品溶液中[Double Pro38]-T4或[Des-Gly2]–T1的峰面积；
A样：供试品溶液中[Double Pro38]-T4或[Des-Gly2]–T1对应的峰面积；
C对：对照品溶液中[Double Pro38]-艾塞那肽或[Des-Gly2]-艾塞那肽的浓度(mg/ml)；
C样：供试品溶液的浓度(mg/ml)；
本发明的另一个技术方案为杂质化合物[1-12]-艾塞那肽及[D-His1，1-12]-艾塞那肽分别作为杂质对照品的用途；该化合物可以在测定艾塞那肽中[D-His1]-艾塞那肽含量的分析方法中作为杂质对照品，用以确定杂质的出峰位置及色谱条件的系统适用性符合要求。
本发明请求保护的分析方法具有如下的积极效果：所述的分析方法具有较好的特定杂质的专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为该化合物的质量控制提供了有效保障。
在本发明中，如未特别说明，所述溶剂均为常规溶剂。本发明所使用的试剂或原料均可以通过现有文献或现有技术制备得到，或者可以购买得到。
附图说明
图1为实施例1中系统适用性HPLC图谱。
图2为实施例1中混合溶液HPLC图谱。
图3为[D-His1]-艾塞那肽线性关系图。
图4为实施例2中系统适用性HPLC图谱。
图5为[Double Pro38]-艾塞那肽线性关系图。
图6为[Des Gly2]-艾塞那肽线性关系图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解为：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得得到的技术方案均属于本发明的保护范围。本发明所使用的杂质对照品可以通过购买得到，如杂质[Double Pro38]-艾塞那肽购自上海吉尔生化有限公司，也可以通过化学方法制备得到并进行结构确证。
实施例1：([D-His1]-艾塞那肽)
1、色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪—紫外检测器
色谱柱：强阳离子交换色谱柱[PolysulfoEthyl ATM(3μm，4.6*100mm，300A)]
流动相：磷酸二氢钾缓冲液(取磷酸二氢钾4.76g，加水1000ml溶解。磷酸调节pH值为4.0)-乙腈(56.4:43.6)
柱温：50℃。波长：214nm。流速：1.2ml/min。进样：40μl。
2、分析方法验证
1)专属性
(1)空白溶剂：取1％碳酸氢铵溶液15ml，置50ml量瓶，加胰蛋白酶溶液1.5ml，混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，混匀，加水稀释至刻度，即得。
(2)[1-12]-艾塞那肽定位溶液配制：精密称取[1-12]-艾塞那肽对照品10.25mg，置50ml量瓶，加入1％碳酸氢铵溶液30ml溶解，再加入稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
(3)[D-His1，1-12]-艾塞那肽定位溶液配制：精密称取[D-His1，1-12]-艾塞那肽对照品10.06mg，置50ml量瓶，加入1％碳酸氢铵溶液30ml溶解，再加入稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
(4)系统适用性溶液配制：精密称取[1-12]-艾塞那肽对照品9.51mg及[D-His1，1-12]-艾塞那肽对照品9.20mg，置50ml量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液30ml溶解，再加入稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
(5)杂质[D-His1]-艾塞那肽定位溶液配制：精密称取[D-His1]-艾塞那肽杂质对照品9.91mg，置50ml量瓶，加1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，混匀，加水稀释至刻度，即得。
(6)供试品溶液配制：精密称取艾塞那肽10.43mg，置50ml量瓶，加1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，混匀，加水稀释至刻度，即得。
(7)混合样品溶液配制：精密称取[D-His1]-艾塞那肽杂质对照品9.79mg及艾塞那肽9.92mg，置50ml量瓶，加1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，混匀，加水稀释至刻度，即得。
精密量取上述各溶液40μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
上述溶液按照本发明实施例所述色谱条件检测，定位溶液、混合溶液与系统适用性溶液中各杂质的保留时间和分离度见表2，系统适用性HPLC图谱如图1所示，混合溶液图谱如图2所示。结果表明，空白溶剂及艾塞那肽T1肽段不干扰[D-His1]-艾塞那肽-T1肽段，两者分离度为2.2，系统适用性符合要求。
表2定位溶液、混合溶液与系统适用性溶液中各杂质的保留时间和分离度
2)线性
分别配制[D-His1]-艾塞那肽浓度为0.5166μg/ml、1.033μg/ml、2.067μg/ml、2.583μg/ml、5.166μg/ml、10.33μg/ml、15.50μg/ml的线性系列溶液，按照本发明所述色谱条件检测，结果见表3，线性图谱见图3。
表3[D-His1]-艾塞那肽线性关系试验结果
结果表明：杂质[D-His1]-艾塞那肽在浓度0.5166μg/ml～15.50μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y＝10604x-1514.3，相关系数r＝0.9999，线性符合要求。
3)方法准确度
(1)操作步骤
杂质贮备液配制：精密称取[D-His1]-艾塞那肽杂质对照品19.25mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品溶液配制：取杂质贮备液配制1ml，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，涡旋混匀，再加水稀释至刻度，摇匀，即得。
空白样品溶液配制：取本品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，涡旋混匀，再加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
40％加样回收供试品溶液：精密量取杂质贮备液10ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml量瓶中，取艾塞那肽25mg，精密称定，置同一量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，涡旋混匀，再加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
100％加样回收供试品溶液：精密量取杂质贮备液1ml，置50ml量瓶中，取艾塞那肽25mg，精密称定，置同一量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，涡旋混匀，再加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
150％加样回收供试品溶液：精密量取杂质贮备液1.5ml，置50ml量瓶中，取艾塞那肽25mg，精密称定，置同一量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加胰蛋白酶溶液1.5ml，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，放冷，加稀磷酸溶液5ml，涡旋混匀，再加1％碳酸氢铵溶液15ml，涡旋混匀，再加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
精密量取上述各溶液40μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表4。
表4杂质[D-His1]-艾塞那肽测定方法准确度试验结果
结果表明：各个浓度溶液，杂质[D-His1]-艾塞那肽的回收率在101.0％～105.9％范围内，RSD为1.3％，表明方法准确度良好。
4)溶液稳定性
供试品溶液及对照品溶液置室温(25℃±2℃)条件下放置，在36小时内供试品溶液单个杂质和总杂质的变化率在±10.0％之内，表明供试品溶液及对照品溶液在室温条件下36小时内稳定，结果见表5。
表5对照品溶液稳定性试验结果
实施例2：
1、色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪—紫外检测器
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂[X-TerraMSC18(5.0μm，4.6*150mm)]
流动相：A：0.1mol/L的氯化钾溶液(取氯化钾7.4g，加1ml的三乙胺，加水至1000ml，用磷酸调节pH至2.7)
B：乙腈
梯度洗脱程序
柱温：45℃。波长：214nm。流速：1.0ml/min。进样：80μl。
2、分析方法的验证：
1)专属性溶液
(1)空白溶剂：取1％碳酸氢铵溶液15ml，置25ml量瓶中，加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
(2)艾塞那肽定位溶液配制：精密称取艾塞那肽25.55mg，置25ml量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
(3)杂质[Double Pro38]-艾塞那肽定位溶液：精密称取杂质[Double Pro38]-艾塞那肽对照品25.39mg，置25ml量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
(4)杂质[Des Gly2]-艾塞那肽定位溶液：精密称取杂质[Des Gly2]-艾塞那肽对照品25.59mg，置25ml量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
(4)系统适用性溶液：取[Double Pro38]-艾塞那肽杂质对照品与[Des Gly2]-艾塞那肽杂质对照品各12.5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。
上述溶液按照本发明实施例所述色谱条件检测，杂质定位溶液及系统适用性溶液中各杂质的保留时间和分离度见表6，系统适用性HPLC图谱如图5所示。结果表明，空白溶剂及艾塞那肽T4肽段不干扰[Double Pro38]-艾塞那肽-T4肽段，分离度大于1.5；空白溶剂及艾塞那肽T1肽段不干扰[Des Gly2]-艾塞那肽-T1肽段，分离度大于1.5，系统适用性符合要求。
表6杂质定位溶液及系统适用性溶液中各杂质的保留时间和分离度
2)线性
分别配制[Double Pro38]-艾塞那肽浓度为0.5021μg/ml、0.8314μg/ml、2.0784μg/ml、4.1568μg/ml、8.3136μg/ml、12.4704μg/ml的线性系列溶液，按照本发明所述色谱条件检测，结果见表7，线性关系图见图5；分别配制[Des Gly2]-艾塞那肽浓度为0.1996μg/ml、0.3000μg/ml、0.7500μg/ml、1.5010μg/ml、3.0020μg/ml、4.5020μg/ml的线性系列溶液，按照本发明所述色谱条件检测，结果见表8，线性关系图见图6。
表7[Double Pro38]-艾塞那肽线性关系试验结果
表8[Des Gly2]-艾塞那肽线性关系试验结果
结果表明：杂质[Double Pro38]-艾塞那肽在浓度0.5021μg/ml～12.4704μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y＝33888x-4535.3，相关系数r＝0.9999；[Des Gly2]-艾塞那肽在浓度0.1996μg/ml～4.5020μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y＝23400x–1213，相关系数r＝1.0000，相关系数均大于0.99，线性符合要求。3)方法准确度
(1)操作步骤
杂质混合贮备液配制：精密称取[Double Pro38]-艾塞那肽杂质对照品12.4270mg，[Des Gly2]-艾塞那肽杂质对照品5.0285mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品溶液配制：精密量取杂质贮备液1ml，置25ml量瓶中，加入加的1％碳酸氢铵溶液15ml，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。
空白样品溶液配制：取艾塞那肽25.0mg，精密称定，置25ml量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。
32％加样回收供试品溶液：精密量取杂质混合贮备液10ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置25ml量瓶中，取艾塞那肽25mg，精密称定，置同一量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
80％加样回收供试品溶液：精密量取杂质混合贮备液1.0置25ml量瓶中，取艾塞那肽25mg，精密称定，置同一量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
120％加样回收供试品溶液：精密量取杂质混合贮备液1.5ml，置25ml量瓶中，取艾塞那肽25mg，精密称定，置同一量瓶中，加入1％碳酸氢铵溶液15ml使溶解，再加入1.5ml的胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，置37℃水浴加热0.5h，再加入2ml冰醋酸终止反应，再加水定容至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
精密量取上述各溶液80μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表9、表10、表11。
表9空白样品溶液含量试验结果
空白对照 [Double Pro<sup>38</sup>]-艾塞那肽(％) [Des Gly<sup>2</sup>]-艾塞那肽(％)
1 0.23 未检测到
2 0.22 未检测到
3 0.23 未检测到
4 0.23 未检测到
5 0.22 未检测到
6 0.23 未检测到
平均 0.23 未检测到
表10杂质[DoublePro38]-艾塞那肽测定方法准确度试验结果
表11杂质[Des Gly2]-艾塞那肽测定方法准确度试验结果
结果表明：各个浓度溶液，杂质[DoublePro38]-艾塞那肽的回收率均在96.2％～102.8％范围内；各个浓度溶液杂质[Des Gly2]-艾塞那肽的回收率均在81.7％～93.8％范围内，表明方法准确度良好。
4)溶液稳定性
供试品溶液及对照品溶液置室温(25℃±2℃)条件下放置，在48小时内供试品溶液单个杂质和总杂质的变化率在±10.0％之内，表明供试品溶液及对照品溶液在室温条件下48小时内稳定，结果见表12、表13。
表12对照品溶液稳定性试验结果
表13供试品稳定性试验结果

Claims (10)

1.一种艾塞那肽杂质含量的分析方法，其步骤包括：采用胰蛋白酶对艾塞那肽及其杂质进行酶解，然后采用色谱法进行分离。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述艾塞那肽杂质为[D-His1]-艾塞那肽、[Double Pro38]-艾塞那肽或[Des Gly2]-艾塞那肽。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：采用0.05mg/ml胰蛋白酶对艾塞那肽产品杂质[Double Pro38]-艾塞那肽、[Des-Gly2]-艾塞那肽及艾塞那肽样品特定位点进行酶切水解，并对水解产生的特定酶切肽段用色谱进行分离，并采用外标法准确定量。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：采用冰乙酸或者稀磷酸终止胰蛋白酶酶切反应。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：当杂质为[D-His1]-艾塞那肽时，色谱分析采用强阳离子交换色谱柱，以磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相。
6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：当杂质为[Double Pro38]-艾塞那肽或[Des Gly2]-艾塞那肽时，色谱分析采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以氯化钾溶液作为流动相A，以乙腈溶液为流动相B。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述强阳离子交换色谱柱的粒径为3μm，色谱柱长度为100mm，色谱柱内径为4.6mm；所述磷酸二氢钾缓冲液pH值为2.0～6.0，优选为3.8～4.2，更优选为3.9、4.0、4.1；所述磷酸二氢钾浓度为0.025～0.045mol/L，优选为0.035～0.040mol/L，更优选为0.035mol/L。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的粒径为5μm，色谱柱长度为150mm，色谱柱内径为4.6mm；所述氯化钾溶液的pH值为2.0～4.0，优选为2.5～2.9，更优选为2.6、2.7、或者2.8；氯化钾浓度为0.090～0.110mol/L，优选为0.095～0.100mmol/L，更优选为0.10mmol/L。
9.如权利要求5，7任一项所述的方法，其特征在于：色谱分析采用等度洗脱，磷酸二氢钾缓冲液-乙腈比例为56.4:43.6，流速为1.1ml/min～1.3ml/min；柱温：45℃～55℃；检测波长：214nm；进样体积：40μl。
10.如权利要求6,8任一项所述的方法，其特征在于：色谱分析采用如下梯度洗脱程序：
流速0.9ml/min～1.1ml/min，柱温40℃～50℃，检测波长：214nm，进样体积80μl；优选的，采用如下梯度洗脱程序：
流速0.9ml/min～1.1ml/min，柱温40℃～50℃，检测波长：214nm，进样体积80μl。
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